不同应力环境对兔骨髓间充质干细胞修复关节软骨缺损的影响答辩

ME0M
不同应力环境对兔骨髓间充质干细胞
修复关节软骨缺损的影响
王刚刘一单玉兴徐莘香
!摘要 " 目的探讨不同应力环境对骨髓间充质干细胞#$%&’(修复关节软骨缺损的影响) 方法将日本大耳白兔 *+只制成髌骨外侧脱位动物模型,平均分成物正常应力组及
移植物脱位组)对兔$%&’进行分离/培养,以兔$%&’为种子细胞构建自体组织工程移植物修复关节软骨缺损)0周后
处死动物,观察修复组织的成分和结构) 结果术后 0周,移植物正常应力组修复组织浅层为软骨组织,甲苯胺蓝染色 -组,每组 +只 .即单纯载体脱位组 #对照组(/移植
接近正常关节软骨 1深层为软骨下骨,与正常关节软骨结构相似)移植物脱位组为骨组织所修复,缺损周围的正常关节软
骨变薄,软骨下血管侵入正常关节软骨内,遗留在股骨髁滑车槽内的移植物在滑车槽正常关节软骨表面形成新生类透明
软骨组织)单纯载体脱位组为纤维组织修复)
!关键词 " 组织工程软骨缺损结论$%&’修复关节软骨缺损,只有在正常应力状态下修复效果最佳1 应力环境提示维持负重关节正常的应力刺激,对组织工程软骨修复组织的形成和维持必不可少) 骨髓间充质干细胞
中图分类号.2-*3 203*4-
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织 )
关节软骨与鼻/喉/气管/支气管和肋软骨等虽
同
为透明软骨,但具有负重功能的关节软骨经过一定时基金项目.国家自然科学基金资助项目#-EFss*G*( 万方数据
间的废用将导致软骨退化以致机械性能丧失)&02,0*
等H*I应用骨髓间充质干细胞#/0.."4 /(’(*-’&/0,
’#/ -(,,’,$%&’(修复关节软骨缺损的研究提示,修
响 ,同时在应力的作用下 ,发育成为承重组
对用 J$-;40,#.等HI指出,关节软骨的正常结构及功能兔$%&’修复关节软骨缺损进行了不同应力环境下的需
要正常的应力来维持,应力在防止关节软骨退化中起
着重要作用 )
为了探讨应力对软骨缺损修复的影响 ,我们作者单位.吉林大学第一医院骨科#长春,*-sst*( 实验比较) K 材料与方法 K_K 兔$%&’的分离/培养 +月龄日本大耳白兔 *+只,雌雄不限,体重 t_sL
中国修复重建外科杂志 !((1年第’W卷第期
!"#$%&骨髓穿刺针接’()*注射器 +内含稀释的肝素
钠,(((-.约 ("!)*/+从髂后上棘或胫骨近端内侧穿刺+抽取骨髓 ,01)*+缓慢注入预先加入 1)*淋巴
fZ=f
K 结果 K"J 大体观察
带&移植物脱位组 [移植上述制备的移植物+移植后将囊覆盖移植物修复后的关节软骨缺损区+将关
细胞分层液的试管内+密度梯度离心.!(((23)45/!( 以
’9:; ’(3<)接种于
1
!
分钟+吸取中间单个核细胞层+678洗涤细胞 !次+髌骨保留在脱位位置+用髌骨内侧缘宽 ("W<)的关节
=# )*培养瓶内+加’()*
节囊和
位组.对照组/[移植无细胞的单纯载体+移植后修复方材&1B多聚甲醛固定 1W小时+!(B@>GH 脱钙 ,周& 常规组织切片万方数据+\@及甲苯胺蓝染色&
>?@? 培养液 .含青霉素钠’(( -3)*+链霉素髌内侧支持带缝合固定于髌内侧软组织&单纯载体脱
’((A%3)*+两性霉素 7("!#A%3)*+加入胎牛血清+终养+1天后半量换液 +=天后更换全部培养液 +并将未贴壁的细胞全部弃掉+继续培养+每周换液 !次&’!0’1 天后细胞基本长满单层+用和盼
蓝染色后计数活细胞+再以’; ’(3<)的浓度传
1
!
浓度为’#B/&在 ,=CD#B EF!饱和湿度孵箱内培法同移植物脱位组 &分别于术后 :周处死各组动物+取
("!#B胰酶
("(!B
@>GH 消化 #分钟+即得到原代 ?8EI悬液+用苔
代培养&
J"K 兔 ?8EI的体外诱导
参照国外相关报道L’M+加入软骨起源诱导因子
GNOPQ’’(5%3)*+地塞米松’()S*3T+维生素
R =
E
#(A%3)*+每周换液 !次+培养 !周后经消化制成细胞悬液&
J"U 组织工程移植物的制备
取牛 V型胶原酸性溶液和两倍浓度的 >?@? 各 ("#)*混合+使其加入上述诱导物后的第,代 ?8EI 终浓度为#; ’(3)*+再加入约 W()%冻干人纤维
:
蛋
白原+充分溶解后加入凝血酶 #(A*.含凝血酶 #(-/& 放入 ,=XE孵箱内+!分钟后即成为胶冻样的移植物 &
将其切割成不同大小的小圆柱体+待用& J"Y 自体组织工程移植物修复兔关节软骨缺损
#月龄日本大耳白兔’#只+雌雄不限+体重!"(0 !"#$%&,B戊巴比妥钠.’)*3$%/静脉麻醉+膝内侧切口+切开皮肤D浅筋膜+在距髌骨内缘内侧 ("W<) 纵行切开髌内侧支持带及关节囊 +将膝关节屈曲 Z(度造成髌骨外侧脱位动物模型&于股骨髁部滑车槽内钻孔+直径 1"#))+深 #))& 动物随机分为 ,组+每组 #只& 移植物正常应力组[移植制备的自体组织工程移植物+ 将向外侧脱位的髌骨复位+缝合关节囊
及髌内侧支持
U 讨论
见[移植物正常应力组缺损已被呈乳白色类关节软骨的正常生物力学性质和功能取决于其基软骨组织质的正常成分和结构&生理条件下的应力刺激对维持充填+表面光滑+但弹性略差]移植物脱位组缺关节软骨细胞的正常结构及功能具有重要意义&关节损被骨制动会使关节软骨发生变性改变]一定的组织所充填 +骨组织表面接近正常关节软骨 +遗留在股骨髁滑车槽内的移植物在滑车槽正常关节软骨表面形成新生条索状乳白色类透明软骨组织+新生软骨表面
光滑+弹性略差]而对照组缺损为纤维组织所修复& K"K 组织学观察
术后 :周+移植物正常应力组[修复组织浅层为透
所有动物术后膝切口愈合良好&术后:周肉眼可
机械应力则
会促进关节损伤的修复&既往研究证实+物理载荷和力学分布明显影响关节软骨的生物力学性质L,M&不同机械负荷区蛋白多糖种类及含量不同 +使各个区域的生
物力学性能适应该区的 L1M
&F^>24<S**L#M注
机械应力
意到持续被动运动对骨膜成软骨作用有重要影响
724_‘a2%等L:M指出+软骨下皮质骨的完整性
明软骨组织 +甲苯胺蓝染色接近正常关节软骨]深层为软骨下骨+与正常关节软骨结构相似.图’/&移植物脱位组[缺损为骨组织所修复 +骨组织高度达到与正常关节软骨表面一致的水平]缺损周围的正常关节对软骨缺
损的再生很重要&深达软骨下骨的缺损+因软骨下骨正软骨细
胞排列紊乱 +软骨下血管侵入正常关节软骨内+正常关节软骨变薄]遗留在股骨髁滑车槽内的移植物在滑车
槽正常关节软骨表面形成的新生条索状乳白色类透明软骨组织+镜下表现为类透明关节软骨组织+甲苯胺蓝染色较正常关节软骨略淡.图 !/&对照组[缺损为纤维常结构被破坏导致力学性能改变+是修复组织早期愈
合率低和产生退变的一个原因&Ebc等L=M发现+正常软骨下骨板的形成对关节软骨修复组织的生存具有重要作用+因为它为关节软骨修复组织的成熟和生存提供
组织修复+缺损周围正常软骨显示软骨下血管了必要的应力环境&
目前认为+自体 ?8EI优于自体关节软骨细侵入正
常关节软骨内.图,/&
胞也
与修复组织的力学性质有关 &Ede*d5等LWM用自体关节软骨细胞修复关节软骨缺损 +术后 :个月修复组织与
acba
附图各组术后 !周关节软骨修复情况 "甲苯胺蓝#$%&
’( 移植物正常应力组)修复组织浅层为软骨组织)深层为软骨下骨)与正常关节软骨结构相似
在股
骨髁滑车槽内的移植物形成类透明关节软骨组织)较正常关节软骨略淡’* 移植物脱位组)缺损为骨组织所修复)遗留’+ 对照组为纤维组织修复
,-./ 0123245-3678539:52!;22<=57923642359-6>->2581.36?4"0@# $%&
’( ABCDCE(FCGHFIJCFKKLDM(NMC+B(KF(NCKOFLKMCKHPDLJEQFHB+(D HNPFKLJI+LKIHJ+HIBLQCG+(DHNPCRNSCHFIJCFKIJECDT+FNNUCD(KG
IJ*+BLKGDN*LKCHFIJCFKGCCEN(UCDDCCM*NKPHBCIHJ+H
CLTKLDM(N+(DHNPC
IHFKFKPLTHLNJFGFKC*NJCHB(KHB(HLTKLDM(N+(DHNPC ’*
ABCGCTC+HQ(ITFNGQFHB*LKCHFIJCFK+(DFNPFKLJI
+LKIHJ+HGFNL+(HLKPDLJE/ABC+(DFNPFKLJI+LKIHJ+HNTHFKHBCTCMLD NHL+BN(PDLLOCTLDMCGBU(NKC+(DHNPCRNSCHFIJC)QBF+BIBLQCGNFP BHD ’+ ABCGCTC+HFK+LKHLNPDLJEQ(IDCE(FCG*UTF*DLJI HFIJC
宿主仍无融合)因此在宿主软骨与修复软骨
间产生了
化以紊乱)软骨下血管侵入正常关节软骨内)正常关节软骨变薄)被软骨下骨板部分取代)在对照组也可观察到类会发生退化)软骨细胞无正常应力刺激则失去抵抗软
骨下血管侵蚀的能力V 应力不匹配)这种不匹配最终导致表层软骨纤维似现象V表明正常关节软骨如失去正常的应力刺激也致移植失败V因此W(ENK 等认为)已分化软骨细胞不
适宜修复全层关节软骨缺损V而 XYWI再现了胚胎的
骨软骨形成过程)形成的软骨下骨板结构与宿主 Z/Z 软骨下血管对移植物的影响
我们的实验结果发现 )遗留在股骨髁正常
软骨下骨结构一致)因此修复组织表层软骨形态
结构
与正常关节软骨十分接近V
Z/[ 应力环境对修复组织内 XYWI分化方向的影响
我们通过实验了解应力及滑膜环境 \软骨
下骨内
血管环境对修复组织产生的影响V结果显示)术后 ]周滑车槽内的移植物在滑车槽正常关节软骨表面形成了新生条索状
对正常应力组的缺损)修复组织浅层为软骨组织)深层
为软骨下骨 V提示在正常应力条件下 )在修复组织浅层
的 XYWI向成软骨细胞系转化)深层的则向成骨细
胞
系转化)而移植物脱位组缺损全部为骨组织所修复)提
示异常应力使修复组织浅层及深层的 XYWI均向成骨
细胞系转化 V可见正常的应力环境对修复组织内软骨
的形成是至关重要的V至于移植物脱位组修复组织表
层的 XYWI是直接向成骨细胞系转化 )还是先向成
软
骨细胞系转化\再通过软骨内化骨过程转变为骨)尚需
进一步研究 V
Z/^ 失去正常应力刺激对正常软骨的影响
移植物脱位组缺损周围的正常关节软骨细胞排列
乳白色类透明软骨组织)镜下表现为类透明关节软骨
组织V同样为自体 XYWI构建的组织工程移植物)在部分应力缺损条件下全部转变为骨组织)而正常关节软
骨表面的移植物仍可维持软骨状态V二者的差别是缺损内部的移植物与软骨下血管相接触)关节软骨表面
的移植物与关节表面及滑膜相接触V由此可推测)软骨下血管的作用在移植物向成骨细胞系转化过程中是必不可少的V我们的实验结果还提出另一问题_既然异常应力导致移植物骨化及正常关节软骨退化)正常关节
软骨表面的移植物为何未发生骨化 )答案是血管的作
用V正常关节软骨表面的移植物 ]周时未发生骨化)并不等于这部分移植物转化而来的软骨不易骨化)
正常应力组在手术中也在关节腔内 "包括股骨髁
滑车槽内&遗留小片状移植物V如果这种移植物在关节腔内分化为软骨\继而发生软骨内化骨)术后会形成关节鼠V但术后 ]周时正常应力组关节腔内并未找到任何异物)小片状移植物被全部吸收V提示在正常应力条件下)关节腔内游离的移植物可被吸收)对移植效果无影响V游离的移植物可能在分化为成软骨细胞系或成骨细胞系之前就被吸收)或者在分化为软骨细胞后并
不发生软骨内化骨)最终被滑膜组织所清除V总之 )在滑膜关节腔内未找到任何软骨内化骨的证据V
由此可推测)负重关节的正常应力刺激通过细胞
外基质将力学刺激传递给修复组织细胞)修复组织浅
表的应力环境同滑膜关节腔分泌的滑液共同
作用)有而是
因为不易被血管侵蚀的正常关节软骨的利于修复组织细胞向软骨细胞分化‘修复组织天然屏障作深层的
应力环境与软骨下血管系统共同作用使修用)将新生软骨与软骨下血管隔开V
复组织细
Z/$ 正常应力环境对关节腔内游离移植物的影响
中国修复重建外科杂志 SeeL年第’Z卷第期
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胞经历软骨内化骨过程!形成软骨下骨板"
对于应力在维持关节软骨正常结构及功能中的作用!可以这样认为 #$无正常的应力!就无正常的关节软骨%"维持负重关节正常的应力刺激!不仅对维持正常
软
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关节软骨的形态与结构十分重要!而且对组织工程 R
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P收稿#SeeSB’eB’L
修回#See[BeSB’eQ
骨修复组织的形成和维持也是必不可少的"
& 参考文献
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第二届全国颅颌面外科学术研讨会暨第一届 !中国颅颌面外科"编委会
会议纪要
由中国修复重建外科专业委员会主办i中山大学附属第二医院承办!第二届全国颅颌面外科学术研讨会暨第一届中国颅颌面
外科编委会会议!于 See[年’’月’[日j’O日在广州召开 "在这次会议上!成立了我国颅颌面外科学界的全国性学术组织kk 第一届颅颌面外科学组!确立了学组组织机构和成员!实现了我国老一辈颅颌面外科先驱们多年的夙愿"拟定了今后学术研讨会的形
式和时间P两年一次Q"讨论了这一新兴交叉学科的基本定义 i治疗范畴和未来发展"这次学组会议决定第三届全国颅颌面外科学术
研讨会将于 SeeL年 R月在重庆召开"
中国修复重建外科专业委员会主任委员王炜教授i秘书长祁佐良教授出席会议"王炜教授作了题为$S’世纪整形外科的发展与展望%的演讲"与会者来自国内具有代表性的大学和研究机构!其中包括中国医学科学院i北京大学i四川大学i上海第
二医科大学i
第四军医大学!以及中山大学各附属医院的专家教授!他们是当今国内颅颌面外科学的先驱和肩负开拓中国颅颌面外科新局面的
年青一代学者"会议期间!专家学者们就其卓有建树的研究领域展开 SR个专题的
报告和讨论"交流论文和专题报告的内容!反映了学科当今发展的前沿领域的最新动态和进展"
会议内容涵盖了现代颅颌面外科的所有领域#先天性颅颌面畸形的外科治疗及基础研究M颅颌面创伤畸形的整复M颅颌面肿瘤
切除后组织器官缺损的修复再造M颅颌面美容整形 M微创内镜技
术在颅颌面外科的应用M牵引成骨技术在颅颌面外科的应用M颅
颌
面外科手术模拟及虚拟现实技术的应用研究M生物材料及组织工
程技术在颅颌面修复重建中的应用M颅颌面种植外科M颅底外科
显微外科技术在颅颌面修复重建中的应用等"
与会代表认为!l中国颅颌面外科m是国内颅颌面外科学界唯一的一份学术期刊!为全国的颅颌面外科学者们提供了一方学术
交流园地!应努力办好!尽快申办国家标准刊号!使之成为医学核心学术期刊!促进学科发展和专业队伍的培养"
会议学术气氛浓厚!讨论热烈"与会代表都表示这次会议开得好 !大家增进了友谊!获得了大量的新信息i新知识 "不同专业的
学者共聚一堂!体现出这一多学科交叉产生的新型学科的特点"老一辈学者回顾历史!感慨万千M年青一代为有老一辈的指引。