乙酰甲喹在美洲鳗鲡体内的药物代谢动力学及残留研究

乙酰甲喹在美洲鳗鲡体内的药物代谢动力学及残留研究
潘葳;刘文静
【摘要】In the tank with a constant water temperature of 25 ±
1℃,American eels were administered with mequindox (MEQ)for the study.The eels were either orally fed with a feed at a single MEQ dosage rate of 120 mg/kg,or placed in a water bath containing 5 mg MEQ/L for 1 8 h.Samples were collected periodically to obtain MEQ concentrations in the blood plasma, muscle, liver, and kidney of the eels by HPLC, while MEQ pharmacokinetics analyzed.The pharmacokinetic characteristics of MEQ were found to be fast absorbed,evenly distributed,rapidly eliminated, and left with low residues in the fish. Under the oral administration, the pharmacokinetics of the blood plasma showed a Tmax at 0.75 h,Cmax at 4 115μg·L-1 ,T1/2 at 7.40 h,and CL/F a t 41.89 L·kg-1 ·h-1 .The concentrations of MEQ in the organs were below the detectable level after 72 h.For the medicated bath treatment,the pharmacokinetics of the eel blood plasma indicated Tmax to be 0.25 h,Cmax 435.6μg· L-1 ,T1/2 0.26 h,and CL/F 1.241 L·kg-1 ·h-1 .The MEQ in the organs became not detectable after 2.5 h.The distribution of plasma MEQ in the eels under either treatment fitted the one-compartment open model.%在水温(25±1)℃条件下,分别采用口灌和浸浴的给药方式,以120 mg·kg-1的单剂量混饲口灌及5 mg·L-1浸浴18 h给予乙酰甲喹后,用高效液相色谱法测定血浆、肌肉、肝脏及肾脏中的药物浓度,研究不同给药方式下乙酰甲喹在美洲鳗鲡体内的药代动力学特征及残留情况。

结果表明：乙酰甲喹原药在美洲鳗鲡体内吸收良好、代谢快、体内残留少。

口灌给药后,血浆中药
物浓度达峰时间Tmax为0.75 h,达峰质量浓度Cmax为4115μg·L-1,消除相半衰期T1/2为7.40 h,总体消除率CL/F为41.89 L·kg-1·h-1,72 h后血浆、肌肉、肝脏及肾脏中几乎检测不到原药；浸浴给药血浆中药物浓度于0.25 h达峰,达峰质量浓度Cmax为435.6μg·L-1,消除相半衰期T1/2为0.26 h,总体消除率CL/F为1.241 L·kg-1·h-1,2.5 h 后各组织中几乎检测不到原药。

2种方式给药乙酰甲喹在美洲鳗鲡血浆中分布均符合药动学一室开放模型。

【期刊名称】《福建农业学报》
【年(卷),期】2016(031)010
【总页数】6页(P1028-1033)
【关键词】乙酰甲喹;美洲鳗鲡;药代动力学;高效液相色谱
【作者】潘葳;刘文静
【作者单位】福建省农业科学院农业标准化与检测技术研究所/福建省精密仪器农业测试重点实验室，福建福州 350003;福建省农业科学院农业标准化与检测技术研究所/福建省精密仪器农业测试重点实验室，福建福州 350003
【正文语种】中文
【中图分类】S962.3
乙酰甲喹(mequindox)为卡巴氧类似物，又名痢菌净，为中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所最早合成的一类新兽药[1]，其价格低廉，临床上广泛用于猪、禽类及鱼类的肠炎、痢疾、烂鳃病、肠出血、白头白皮病、细菌性败血症等多种细菌性疾病的防治，其显效快、疗效高，并对大多数细菌具有很强的抑制作用，安全性好、内服吸收良好，因此在水产养殖中应用广泛[2-5]。

但是目前我国对乙酰甲喹
的药理学研究不足，畜禽养殖过程中的中毒事件时有发生[6-13]，乙酰甲喹中毒是蓄积性中毒，中毒前期表现的症状不是很明显，因此中毒症状持续时间长、死亡率高，对养殖业造成很大危害，也对人的身体健康造成了潜在的威胁。

目前关于其在水生生物中药物代谢动力学的研究较少[14]，本试验旨在探讨在口灌和浸浴给药方式下，乙酰甲喹在鳗鲡体内的残留消除规律，为乙酰甲喹在水生生物上安全使用提供理论依据，使广大水产养殖户能够在鳗鲡生产上合理地运用此药，对食品安全评价有重要参考价值。

1.1 试验动物
美洲鳗鲡American eel，由福建永泰海生源养鳗场提供，平均体重(100±20) g
试验前暂养在水泥池中60 d，投饵，水温为 18～28℃；试验在直径为 150 cm，高150 cm的不锈钢的水族箱中(共6个)进行，每箱放水2 500 L 、放鳗鲡80尾，不间断冲气增氧，不投饵，水温控制在(25±1)℃。

试验前鳗鲡经抽查证明组织中
均不含乙酰甲喹。

1.2 药品与试剂
乙酸乙脂(上海试剂总厂生产，分析纯)；二氯甲烷(上海试剂总厂生产，分析纯)；
二甲基亚砜(天津市大茂化学试剂厂，分析纯)；甲醇(美国TEDIA，色谱纯)；正己
烷(上海试剂总厂生产，分析纯) ；乙酰甲喹对照品 (中国兽药监察所，99.7%) ；
实验用水均为超纯水。

1.3 试验仪器及色谱条件
1.3.1 试验仪器 Waters2690高效液相色谱仪， Waters2996二极管阵列(PDA)检测器(或紫外检测器)；Millennium 32色谱工作站；TDL-40B台式离心机 (Anke
公司，中国) ；AL204电子天平 (Mettler Toledo，瑞士) ；IKA-RV8旋转蒸发仪(IKA公司，德国) ；KQ 250DB超声波清洗器 (昆山市超声仪器有限公司，中国)。

1.3.2 色谱条件色谱柱：SunFireTM C18柱(4.6 mm×150 mm,3. 5 μm)；柱温：
35℃；流动相：甲醇∶水=40∶60(V/V) ；流速：0.8 mL·min-1；二极管阵列检
测器；检测波长：239 nm；进样量：20 μL。

1.4 试验设计及采样
1.4.1 口灌给药称取乙酰甲喹对照品4.00 g于 200 mL 容量瓶，加水配置成含乙
酰甲喹20.00 mg·mL-1 的溶液，根据不同鳗鲡体重，取相应体积的乙酰甲喹溶液，加入未加淀粉鳗鱼饲料调成糊状液。

灌服方法：5mL注射器上接长度为15 cm左右的软导管，直接从鱼嘴通到鱼的胃部，灌服后放到单独容器中，观察有无回吐，有则弃之，无则开始计时。

本试验模拟养殖生产中美洲鳗鲡1 d口服乙酰甲喹的
剂量为40 mg·kg-1，以3倍剂量120 mg·kg-1 混饲口灌给药，无回吐者，保留，进入试验。

于给药后的5*、10*、15、20、25、30、35、40、45、50、55、
60*、70*、80*、90*、100*、110*、120、150、240、480*、720、960、1 440、2 160、2 880、3 660、4 320 min共28个采样时间点采血液、肌肉、肝脏、肾脏，进行药动学预试验及组织中药物残留试验，每个采样时间点采鱼样5尾。

血液置于含少量 1%肝素钠 (已风干)离心管中混匀，5 000 r·min-1 离心 10 min，分离血浆，血浆、肌肉、肝脏、肾脏于-20℃保存待用。

选取了其中的19
个采样时间点(*为根据预试验结果可以去除的采样时间点)进行血浆中药动力学正
式试验。

1.4.2 浸浴给药称取乙酰甲喹对照品适量，加水溶解后投入200 L曝过气的水中，使水中乙酰甲喹质量浓度为5 mg·L-1；将鳗鲡置于其中浸浴18 h后换水，分别
于浸浴后5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、110、120、150、240、480、720 min共22个采样时间点采样，采样方
法同1.4.1。

1.5 样品处理
1.5.1 血浆、肝脏、肾脏取出冷冻保存的血浆样品，室温下自然解冻，摇匀，准确
吸取0.5 mL于2 mL离心管中；将肝脏、肾脏样品匀浆，分别称取匀浆后肝脏、肾脏各约0.5 g(精确至0.01 g)于2 mL离心管中，在上述离心管中分别加入二氯甲烷-乙酸乙脂混合提取液(二氯甲烷体积分数为75%)1.0 mL，旋涡振摇5 min，10 000 r·min-1 离心10 min，吸取上层液于另一离心管中。

重复以上提取操作，合并上层提取液，用氮气吹至近干，加入0.5 mL流动相，旋涡振摇 2 min和超声3 min溶解残留物，过孔径为0.2 μm滤膜后，上 HPLC进样检测。

1.5.2 肌肉将肌肉样品匀浆。

分别称取匀浆后样品约5.0 g(精确至0.01 g)于50 mL塑料离心管中，加20 mL二氯甲烷-乙酸乙酯混合提取液，振摇混匀，超声提取15 min，4 000 r·min-1离心10 min，将提取液移至100 mL鸡心瓶中，残渣用15 mL二氯甲烷-乙酸乙酯混合提取液重复提取1次，合并上清液于上述鸡心瓶中，40℃旋转蒸发至近干。

向蒸发至近干的鸡心瓶中加入0.50 mL流动相，旋涡振摇 2 min和超声 5 min溶解残留物，重复以上“加入0.50 mL流动相，……超声波 5 min溶解残留物”操作，合并流动相溶解液至10 mL具塞离心管中，加入5 mL正己烷，漩涡混合1 min，4 000 r·min-1离心10 min，弃去上层正己烷，下层溶液过0.2 μm微孔滤膜后，供液相色谱分析。

1.6 标准曲线的制备
准确称取0.01 g(精确至0.000 1 g)乙酰甲喹，用甲醇溶解并定容至100 mL，配成浓度为100 μg·mL-1的标准贮备液，置4℃冰箱保存，保存期不超过1个月，临用前用流动相稀释成系列标准溶液。

取5份空白样品(血浆、肝脏、肾脏或肌肉)分别加入相应体积的标准溶液，配制含乙酰甲喹的血浆、肝脏或肾脏样品，使上机样品质量浓度为0.05、0.1、0.5、1.0、2.5 μg·mL-1；配制含乙酰甲喹的肌肉样品，使上机样品质量浓度为0.05、0.5、5.0、10.0、30.0 μg·mL-1的样品，按“1.5”方法对样品处理后，各进样20 μL上机测定，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标作标准曲线，求出血浆、肝脏、肾脏和肌肉的标准工作曲线回归方程和相
关系数。

1.7 回收率和精密度
选取不含乙酰甲喹残留的4种空白鳗鲡组织样品，分别于0.05、0.1、1.0 μg·mL-1 3个水平进行加标回收试验，每个添加水平做6个平行(进行日内精密度实验)，
计算加标回收率和日内变异系数；各取1份供试材料，每隔2 d将样品测定1次，连续测定6次，计算日间变异系数。

1.8 模型及参数的确定
药动学模型拟合及药动参数的计算采用 DAS3.0版药物代谢动力学软件。

2.1 色谱行为
利用二极管阵列检测器采集加标样品的3D图，并截取乙酰甲喹标准品的紫外光谱图发现乙酰甲喹在239 nm处吸收值远高于其他波长，且基质中无杂质对乙酰甲
喹存在干扰，因此确定其为鳗鲡中乙酰甲喹的检测波长。

由于乙酰甲喹中有氢键作用力强的氧元素，因此选择甲醇和水作为流动相。

考察纯甲醇作为流动相时色谱峰保留时间太短，目标物无法和杂质分离。

在流动相中增加水的比例，研究发现当流动相为甲醇∶水(40∶60，体积比)时，乙酰甲喹峰形良好，与4种样品的杂质均能得到快速有效分离，分离度大于1.5，且峰型良好，乙酰甲喹色谱峰保留时间在
4.4 min左右(图1)。

2.2 标准品标准曲线
在0.05～30 μg·mL-1线性范围内，乙酰甲喹在美洲鳗鲡血浆、肝脏、肾脏和肌肉中线性关系良好(表1)。

2.3 回收率和精密度
试验结果见表2。

回收率在75%～90%，作为痕量测定此结果回收率良好；日内
和日间精密度RSD均小于10%。

2.4 检出限和定量限
在空白鳗鲡肌肉、肾、肝和血浆中添加一定浓度的标准溶液，以信噪比(S/N≥3)确定各组分检出限(LOD)，信噪比(S/N≥10)确定各组分定量限(LOQ)，结果发现，当添加水平分别为0.015和0.05 μg·mL-1时，满足检出限和定量限的信噪比要求，结合不同组织的称样量和最终定容体积，确定本方法乙酰甲喹在鳗鲡肌肉、肾、肝和血浆中的LOD分别为3 μg·kg-1、15 μg·kg-1、15 μg·kg-1、15 μg·L-1，LOQ分别为：10 μg·kg-1、50 μg·kg-1、50 μg·kg-1、50 μg·L-1。

2.5 乙酰甲喹在美洲鳗鲡体内的浓度变化及代谢动力学特征
2.5.1 口灌给药以120 mg·kg-1 单剂量口灌给药后，乙酰甲喹在美洲鳗鲡血浆中的药时曲线见图2，肌肉、肝脏和肾脏中药物残留随时间变化情况见图3，主要药代动力学参数见表3。

将乙酰甲喹浓度-时间数据采用DAS
3.0药代动力学程序进行分析，根据AIC值最小和R2值最大的原则，判断美洲鳗鲡单剂量口灌乙酰甲喹后血浆中的药物经时过程符合开放性一室模型，其药时关系理论方程为：C血浆=A·e-α·t-K·e-Ka·t=2862e-0.094t(本结果α=Ka=0.094)。

2.5.2 浸浴给药后代谢结果以5 mg·L-1 浸浴给药18 h后，乙酰甲喹在美洲鳗鲡血浆中的药时曲线见图4，肌肉、肝脏和肾脏中药物残留随时间变化情况见图5。

将乙酰甲喹浓度-时间数据采用DAS
3.0药代动力学程序进行分析，根据AIC值最小和R2值最大的原则，判断美洲鳗鲡浸浴给药18 h后乙酰甲喹后血浆中的药物经时过程符合开放性一室模型，其药时关系理论方程为：C血浆=A·e-α·t-K·e-Ka·t=4013e-1.575t(本结果α=Ka=1.575)。

主要药代动力学参数见表4。

其中Tmax、Cmax为实测值，AUC用梯形法计算。

3.1 样品前处理过程
由于鳗鲡肝脏、肾脏和血浆在鱼体内所占的比例很小，样品稀少，故测定时取样量只取约0.5 g(或0.5 mL)，方法检出限能达到15 μg·kg-1(或15 μg·L-1)，灵敏度足够高。

而肌肉样品在鱼体内所占的比例大，故测定时取样量取5.0 g左右，较测
定肝脏肾、脏等其他组织提高10倍。

由于测定肌肉时所用的容器较测定其他组织所用的容器大很多，故需要更多的溶剂来溶解残留物，故最终定容体积增加了1倍，所以测定肌肉中药物残留的灵敏度较测定其他组织提高5倍，方法检出限能
达到3 μg·kg-1，能更好地满足餐桌安全的需要。

3.2 代谢动力学参数
本试验结果显示：在水温(25±1)℃条件下，以120 mg·kg-1单剂量口灌给药后(给药浓度比其他药动学试验略高)，血浆中药物浓度达峰时间Tmax为0.75 h，该药动学参数与鲤鱼[14] 0.50 h相近，是鸡[15](0.31±0.12) h、鼠
[16](0.33±0.00)h的2倍。

达峰浓度Cmax为4 115 μg·L-1。

消除相半衰期
T1/2k为7.40 h，约为鼠[16](3.21±0.40)h的2倍,是绵羊[17](2.062 2±0.264 5) h的3倍，说明乙酰甲喹在鳗鱼体内的消除规律与鲤鱼、鸡、鼠、绵羊相似。

总体消除率CL/F为41.89 L·kg-1·h-1，药时曲线下面积AUC为223.8 μg·L-1·h-1。

浸浴给药从浸浴开始乙酰甲喹在美洲鳗鲡体内富集，血浆中药物浓度于浸浴结束后0.25 h达峰，达峰浓度Cmax为435.6 μg·L-1，消除相半衰期T1/2k为0.26 h，总体消除率CL/F为1.241 L·kg-1·h-1。

口灌和浸浴给药均符合药动学一室开放模型。

此参数结果说明乙酰甲喹在美洲鳗鲡体内吸收良好，短时间内在血浆中形成高浓度，能够抑制细菌代谢和繁殖，并且迅速进入血液循环，代谢很快。

3.3 乙酰甲喹在美洲鳗体内的残留及休药期
乙酰甲喹在美洲鳗鲡体内的各组织中残留试验结果表明，在水温(25±1)℃条件下，以120 mg·kg-1单剂量口灌给药后，乙酰甲喹在血浆、肌肉、肝脏和肾脏中的浓度变化趋势基本一致，但肌肉中的药物浓度最高，血浆其次，肝脏、肾脏内的药物浓度相对较低，这可能是因为肝脏、肾脏是解毒器官，乙酰甲喹在这2个脏器中
迅速代谢。

肌肉、肝脏及肾脏中药物浓度达峰时间Tmax分别为1.17、0.5和
0.92 h，达峰浓度Cmax分别为5 377、638、694 μg·kg-1；浸浴给药肌肉、肝
脏及肾脏中药物浓度分别于浸浴后0.83、0.17和0.42 h达峰，达峰浓度Cmax 分别为41.00、320.0和237.4 μg·kg-1，说明给药后药物迅速分布于各被测组织与器官，对细菌性疾病有良好的疗效。

口灌给药方式下，血浆、肌肉、肝脏和肾脏中乙酰甲喹含量分别到给药72、24、36和72 h后才检测不到；浸浴给药方式下，血浆、肌肉、肝脏和肾脏中乙酰甲喹分别于给药1.33、2.5、1.5、1.67 h才符合未检出要求，说明乙酰甲喹在鳗鱼体内代谢很快。

目前对鳗鲡目中乙酰甲喹尚未规定最高残留限量(MRL)，为了充分保障消费者的安全，以各组织中未检出为准(本方法肌肉、肾、肝和血浆中的检出限分别为3 μg·kg-1、15 μg·kg-1、15 μg·kg-1、15 μg·L-1)，因此初步建议在(25±1)℃ 水温条件下，以120 mg·kg-1单剂量对美洲鳗鲡混饲口灌给药，休药期至少为给药后72 h；以5 mg·L-1浸浴给药后，休药期至少为给药后2.5 h，起捕食用才是安全的。

乙酰甲喹原药在美洲鳗鲡体内会代谢成其他代谢产物，为保证餐桌安全，我们将进一步对代谢物进行深入研究。

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