加味脑泰方对局灶性脑缺血大鼠海马齿状回颗粒下区BrdU、Ki67和Nestin表达影响
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chemistry. Results The positive cells density of BrdU , Ki67, Nestin in the supplemented Naotaifang group were 200±
70.7 , 280±83.7 and 260±54.8 cells/mm2, respectively, it was significantly higher than that in the model group 120±44.7,
【摘要】目的观察加味脑泰方对局灶性脑缺血大鼠海马齿状回颗粒下区(SGZ)BrdU(外源性细胞增殖 标记物)、Ki67(内源性细胞增殖标记物)和Nestin(巢蛋白)表达影响。方法 通过线栓法制作右侧大脑中动脉 栓塞模型(MCAO)o大鼠分成模型组和加味脑泰方组。加味脑泰方组给予脑缺血大鼠灌胃加味脑泰方，1次/d (剂量为9g/kg,浓度0.9 g/ml),模型组灌胃同体积的生理盐水，连续14 do再灌注14 d后免疫组织化学技术观 察两组大鼠组海马SGZ区BrdU、Ki67和Nestin的表达情况。结果 加味脑泰方组海马SGZ区BrdU\Ki67+和 Nestin*细胞密度分别为(200±70.7)个/mn?、(280±83.7)个/mrr?和(260±54.8)个/mn?,均显著高于模型组[分别为 (120±44.7)个Ann?、(140±54.8)个/mn?和(160±89.4)个/rmr?](Pv0.05)。结论 加味脑泰方可促进局灶性脑缺血 大鼠海马SGZ区神经祖细胞的增殖。
2结果
2.1 加味脑泰方对脑缺血后大鼠SGZ区BrdU* 细胞表达的影响BrdU是胸腺吨噪类似物，标记 细胞增殖。BrdU*细胞沿着SGZ区呈点状分布。
220
胞核染成棕黄色（图1）。脑缺血后14 d,加味脑泰 方组和模型组SGZ区BrdlT细胞密度分别为（200±
解剖学研究 2021 年第 43 卷第 3 期 Anat Res. 2021. Vol. 43, No.3
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深度为(18±0.5) mm0右侧大脑中动脉栓塞30 min后将拴线拔出，同时将分叉处结扎(活结)的 颈外动脉手术线松开，去除颈总动脉近心端的微 动脉夹，用棉签压住出血处止血，模型制作过程中 尽量减少大鼠的痛苦。 1.2.2实验动物分组和给药通过线栓法制作的 右侧MCAO模型成功后给予大鼠腹腔注射BrdU (剂量50 mg/kg,终浓度50 mg/ml)3次，每次间隔 8 ho然后将20只大鼠随机均分成加味脑泰方组 和模型组。加味脑泰方组每天灌胃加味脑泰方1 次,模型组老鼠灌胃同体积的生理盐水。14d后， 比较两组大鼠海马SGZ区BrdU、Ki67和Nestin的 表达情况。 1.2.3灌注取材10%水合氯醛腹腔注射麻醉。 灌注针头从心尖处穿过至升主动脉，然后剪开右 心耳；先使用0.9% Nacl快速冲洗血管内淤积的血 液，然后改用4%多聚甲醛进行灌注，速度先快后 慢；取脑，4七后固定过夜；脑组织置入30%蔗糖 中沉糖2次；包埋剂包埋。采用邻切法在-24七珊 顿冰冻切片机冠状位切片，厚度为30 |±m。 1.2.4 免疫组织化学染色采用ABC-DAB法染 色。脑片放入3% H2O2中30 min,0.01 M PBS缓冲 液(pH=7.3)漂洗，10 minx3 次；5% 马血清+0.1% tritonX-100磷酸缓冲液孵育2 h ;漂洗3次后分别 加入兔抗 Ki-67(1： 1000)和鼠抗 Nestin (1: 1000) 4七孵育过夜；漂洗3次后与广谱生物素化二抗 (1：400)反应1 h后放置于抗生物素-卵白素-辣根 过氧化物酶复合物(ABC)溶液中孵育2 h；漂洗3 次后切片显色，显微镜下控制显色时间；贴片后干 片，梯度脱水，二甲苯透明组织,封片。 1.3统计学分析
cell proliferation marker), Ki67 (endogenous cell proliferation marker) and Nestin in the subgranular zone of dentate gy
rus (SGZ) of hippocampus in rats with focal cerebral ischemia. Methods The right middle cerebral artery occlusion
(MCAO) model was established by thread occlusion method. Rats were divided into model group and supplemented Nao taifang group. The rats in supplemented Naotaifang group were administered with supplemented Naotaifang by gavage. The dose of drug (9 g/kg) was suspended in 0.9% saline (0.9 g/ml), once per day for 14 days after reperfusion. While rats in the model group were treated with equal volume of 0.9% saline, one injection per day until the rats were sacrificed at 14th day after MCAO. The expression of BrdU , Ki67 and Nestin in SGZ of hippocampus was observed by immunohisto
TANC Yan. Department of Anatomy, Yiyang Medical College, Yiyang, Hunan Province 413000, China Corresponding author: HE Xu, Email: Hexu0628@l 63. com
[Abstract ] Objective To explore the effect of supplemented Naotaifang on the expression of BrdU (exogenous
[Key words] Supplemented Naotaifang; Focal cerebral ischemia; Subgranular zone of dentate gyrus; Neu
ron ; Rats
脑卒中可分为缺血性和出血性两种类型，根
基金项目：湖南省教育厅课题（17C1587）；湖南省中医药管 理局科研项目（201932）；湖南省教育厅科学研究优秀青年项目 （19B441）;益阳市银城科技人才托举工程项目（益科协通（2020） 3号）
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解鏗研究 2021 年第 43 卷第 3 期 Anat Res. 2021, Vol. 43, No.3
■论著・
加味脑泰方对局灶性脑缺血大鼠海马齿状回颗粒下 区BrdU.Ki67和Nestin表达影响
王伟，贺旭)，赵宏，申燕伟，汤艳
(益阳医学高等专科学校人体解剖学教研室，湖南益阳413000)
140±54.8 and 160±89.4 cells/mm2 respectively (P<0.05). Conclusion Supplemented Naotaifang could promote the pro
liferation of neural progenitor cells in the SGZ of hippocampus in rats with focal cerebral ischemia.
70.7）个/mm：和（120±44.7）个/mm?,两组 BrdlT细胞 密度相比差异有统计学意义（¢=2.24 J=0.043）。
1.湖南中医药大学中西医结合学院，湖南长沙410208 通讯作者：贺 旭,E-mail: Hexu0628@
据医院质量监测系统的数据得知2018年我国缺 血性脑卒中占81.9%⑴。流行病学调查资料揭示 我国卒中终生风险为39.3%,风险比例是世界上 最高的国家⑵。卒中给社会和家庭带来巨大的经 济和精神负担。中药或者中药复方在脑缺血疾病 中有多靶点和多向调节的作用⑶，尤其在治疗脑 卒中康复期取得了不错的疗效，并且基础实验也
每个标本取5张含有海马SGZ区免疫组织化 学染色切片，在相同曝光值和像素下显微镜下观 察和计算等面积下阳性细胞数。实验数据以均 数土标准差表示，运用GraphPad Prism 5.0软件进行 统计，采用t检验比较两组海马SGZ区BrdU、Ki67 和Nestin细胞的表达差异。以P<0.05为差异有统 计学意义。
解剖学研究 2021 年第 43 卷第 3 期 Anat Res, 2021, Vol. 43, No.3
表明一些中药能促进脑缺血后大脑神经再生 ，对 脑起到神经保护作用4亠。加味脑泰方是在中医 药理论指导下，以《Байду номын сангаас林改错》中所记载的“补阳还 五汤”为基础方，结合临床用药经验加减而成，由 黄罠、益智仁、石菖蒲、田七、葛根、地龙、川莒组 成。目前国内外尚无文献报导加味脑泰方对大鼠 脑缺血后海马神经再生的影响 。考虑到海马是大 脑的两个主要神经再生区域之一，基于国内外最 新研究进展，我们提出假设：加味脑泰方可通过加 速成年脑缺血大鼠海马神经干细胞的增殖。因此 本实验研究拟采用线栓法建立右侧大脑中动脉栓 塞模型(MCA0)，观察BrdU、Ki67、Nestin在海马 SGZ区的分布。
1材料与方法
1.1材料 I.1.1实验动物体质量230 g、左右出生8周的 雄性SD大鼠10只，由湖南斯莱克景达实验动物 有限公司提供。动物房保持室温(23±1)七，通风 条件尚可，饲养于光照/黑暗为12/12h的环境，自 由饮水，给予标准饮食。 1.1.2药物的制备加味脑泰方由黄英20g、益智 仁15 g、三七10 g、石菖蒲10 g、地龙5 g、川茸5 g 组成。中药复方经水煎煮浓缩，60七真空干燥成 干浸膏，4七冷冻备用，临用时以生理盐水配成溶 液。加味脑泰方的浓度0.9 g/ml,灌胃剂量9g/kg, 每天1次。 1.1.3实验仪器和试剂珊顿冰冻切片机(Shan Don),鼠抗 BrdU (Serotec),兔抗 Ki-67、生物素化 广谱 IgG、3,3-Diaminobenzidine (DAB ) (Vector),鼠 抗 Nestin(BD Bio-sciences )、MCA0 栓线(北京西 浓)、01ympus E53 显微镜(Olympus)，等。 1.2方法 1.2.1局灶性脑缺血模型制备采用大脑中动脉 栓塞法(MCAO)制备局灶性脑缺血模型。10% 水合氯醛(0.35 ml/100g)腹膜腔注射，待完全麻 醉后，将SD大鼠仰卧位固定于Kopf脑立体定位 仪上，75%酒精消毒去毛。取颈正中旁偏右做一 切口；钝性分离颈右侧颈总动脉和迷走神经，并 用微动脉夹夹闭颈总动脉的近心端，分离颈外动 脉和颈内动脉，在分叉处结扎(活结)颈外动脉。 然后在颈总动脉分叉部附近剪一小口，将拴线(直 径0.28 mm,头端0.34 mm)插入到颈内动脉，插入
【关键词】加味脑泰方；局灶性脑缺血；齿状回颗粒下区；神经元；大鼠
Effect of supplemented Naotaifang on the expression of BrdU , Ki67 and Nestin in the subgranular zone of den・ tate gyrus of hippocampus in rats with focal cerebral ischemia WANG Wei f HE Xu, ZHAO Hong, Shen Yan-wei,
70.7 , 280±83.7 and 260±54.8 cells/mm2, respectively, it was significantly higher than that in the model group 120±44.7,
【摘要】目的观察加味脑泰方对局灶性脑缺血大鼠海马齿状回颗粒下区(SGZ)BrdU(外源性细胞增殖 标记物)、Ki67(内源性细胞增殖标记物)和Nestin(巢蛋白)表达影响。方法 通过线栓法制作右侧大脑中动脉 栓塞模型(MCAO)o大鼠分成模型组和加味脑泰方组。加味脑泰方组给予脑缺血大鼠灌胃加味脑泰方，1次/d (剂量为9g/kg,浓度0.9 g/ml),模型组灌胃同体积的生理盐水，连续14 do再灌注14 d后免疫组织化学技术观 察两组大鼠组海马SGZ区BrdU、Ki67和Nestin的表达情况。结果 加味脑泰方组海马SGZ区BrdU\Ki67+和 Nestin*细胞密度分别为(200±70.7)个/mn?、(280±83.7)个/mrr?和(260±54.8)个/mn?,均显著高于模型组[分别为 (120±44.7)个Ann?、(140±54.8)个/mn?和(160±89.4)个/rmr?](Pv0.05)。结论 加味脑泰方可促进局灶性脑缺血 大鼠海马SGZ区神经祖细胞的增殖。
2结果
2.1 加味脑泰方对脑缺血后大鼠SGZ区BrdU* 细胞表达的影响BrdU是胸腺吨噪类似物，标记 细胞增殖。BrdU*细胞沿着SGZ区呈点状分布。
220
胞核染成棕黄色（图1）。脑缺血后14 d,加味脑泰 方组和模型组SGZ区BrdlT细胞密度分别为（200±
解剖学研究 2021 年第 43 卷第 3 期 Anat Res. 2021. Vol. 43, No.3
219
深度为(18±0.5) mm0右侧大脑中动脉栓塞30 min后将拴线拔出，同时将分叉处结扎(活结)的 颈外动脉手术线松开，去除颈总动脉近心端的微 动脉夹，用棉签压住出血处止血，模型制作过程中 尽量减少大鼠的痛苦。 1.2.2实验动物分组和给药通过线栓法制作的 右侧MCAO模型成功后给予大鼠腹腔注射BrdU (剂量50 mg/kg,终浓度50 mg/ml)3次，每次间隔 8 ho然后将20只大鼠随机均分成加味脑泰方组 和模型组。加味脑泰方组每天灌胃加味脑泰方1 次,模型组老鼠灌胃同体积的生理盐水。14d后， 比较两组大鼠海马SGZ区BrdU、Ki67和Nestin的 表达情况。 1.2.3灌注取材10%水合氯醛腹腔注射麻醉。 灌注针头从心尖处穿过至升主动脉，然后剪开右 心耳；先使用0.9% Nacl快速冲洗血管内淤积的血 液，然后改用4%多聚甲醛进行灌注，速度先快后 慢；取脑，4七后固定过夜；脑组织置入30%蔗糖 中沉糖2次；包埋剂包埋。采用邻切法在-24七珊 顿冰冻切片机冠状位切片，厚度为30 |±m。 1.2.4 免疫组织化学染色采用ABC-DAB法染 色。脑片放入3% H2O2中30 min,0.01 M PBS缓冲 液(pH=7.3)漂洗，10 minx3 次；5% 马血清+0.1% tritonX-100磷酸缓冲液孵育2 h ;漂洗3次后分别 加入兔抗 Ki-67(1： 1000)和鼠抗 Nestin (1: 1000) 4七孵育过夜；漂洗3次后与广谱生物素化二抗 (1：400)反应1 h后放置于抗生物素-卵白素-辣根 过氧化物酶复合物(ABC)溶液中孵育2 h；漂洗3 次后切片显色，显微镜下控制显色时间；贴片后干 片，梯度脱水，二甲苯透明组织,封片。 1.3统计学分析
cell proliferation marker), Ki67 (endogenous cell proliferation marker) and Nestin in the subgranular zone of dentate gy
rus (SGZ) of hippocampus in rats with focal cerebral ischemia. Methods The right middle cerebral artery occlusion
(MCAO) model was established by thread occlusion method. Rats were divided into model group and supplemented Nao taifang group. The rats in supplemented Naotaifang group were administered with supplemented Naotaifang by gavage. The dose of drug (9 g/kg) was suspended in 0.9% saline (0.9 g/ml), once per day for 14 days after reperfusion. While rats in the model group were treated with equal volume of 0.9% saline, one injection per day until the rats were sacrificed at 14th day after MCAO. The expression of BrdU , Ki67 and Nestin in SGZ of hippocampus was observed by immunohisto
TANC Yan. Department of Anatomy, Yiyang Medical College, Yiyang, Hunan Province 413000, China Corresponding author: HE Xu, Email: Hexu0628@l 63. com
[Abstract ] Objective To explore the effect of supplemented Naotaifang on the expression of BrdU (exogenous
[Key words] Supplemented Naotaifang; Focal cerebral ischemia; Subgranular zone of dentate gyrus; Neu
ron ; Rats
脑卒中可分为缺血性和出血性两种类型，根
基金项目：湖南省教育厅课题（17C1587）；湖南省中医药管 理局科研项目（201932）；湖南省教育厅科学研究优秀青年项目 （19B441）;益阳市银城科技人才托举工程项目（益科协通（2020） 3号）
218
解鏗研究 2021 年第 43 卷第 3 期 Anat Res. 2021, Vol. 43, No.3
■论著・
加味脑泰方对局灶性脑缺血大鼠海马齿状回颗粒下 区BrdU.Ki67和Nestin表达影响
王伟，贺旭)，赵宏，申燕伟，汤艳
(益阳医学高等专科学校人体解剖学教研室，湖南益阳413000)
140±54.8 and 160±89.4 cells/mm2 respectively (P<0.05). Conclusion Supplemented Naotaifang could promote the pro
liferation of neural progenitor cells in the SGZ of hippocampus in rats with focal cerebral ischemia.
70.7）个/mm：和（120±44.7）个/mm?,两组 BrdlT细胞 密度相比差异有统计学意义（¢=2.24 J=0.043）。
1.湖南中医药大学中西医结合学院，湖南长沙410208 通讯作者：贺 旭,E-mail: Hexu0628@
据医院质量监测系统的数据得知2018年我国缺 血性脑卒中占81.9%⑴。流行病学调查资料揭示 我国卒中终生风险为39.3%,风险比例是世界上 最高的国家⑵。卒中给社会和家庭带来巨大的经 济和精神负担。中药或者中药复方在脑缺血疾病 中有多靶点和多向调节的作用⑶，尤其在治疗脑 卒中康复期取得了不错的疗效，并且基础实验也
每个标本取5张含有海马SGZ区免疫组织化 学染色切片，在相同曝光值和像素下显微镜下观 察和计算等面积下阳性细胞数。实验数据以均 数土标准差表示，运用GraphPad Prism 5.0软件进行 统计，采用t检验比较两组海马SGZ区BrdU、Ki67 和Nestin细胞的表达差异。以P<0.05为差异有统 计学意义。
解剖学研究 2021 年第 43 卷第 3 期 Anat Res, 2021, Vol. 43, No.3
表明一些中药能促进脑缺血后大脑神经再生 ，对 脑起到神经保护作用4亠。加味脑泰方是在中医 药理论指导下，以《Байду номын сангаас林改错》中所记载的“补阳还 五汤”为基础方，结合临床用药经验加减而成，由 黄罠、益智仁、石菖蒲、田七、葛根、地龙、川莒组 成。目前国内外尚无文献报导加味脑泰方对大鼠 脑缺血后海马神经再生的影响 。考虑到海马是大 脑的两个主要神经再生区域之一，基于国内外最 新研究进展，我们提出假设：加味脑泰方可通过加 速成年脑缺血大鼠海马神经干细胞的增殖。因此 本实验研究拟采用线栓法建立右侧大脑中动脉栓 塞模型(MCA0)，观察BrdU、Ki67、Nestin在海马 SGZ区的分布。
1材料与方法
1.1材料 I.1.1实验动物体质量230 g、左右出生8周的 雄性SD大鼠10只，由湖南斯莱克景达实验动物 有限公司提供。动物房保持室温(23±1)七，通风 条件尚可，饲养于光照/黑暗为12/12h的环境，自 由饮水，给予标准饮食。 1.1.2药物的制备加味脑泰方由黄英20g、益智 仁15 g、三七10 g、石菖蒲10 g、地龙5 g、川茸5 g 组成。中药复方经水煎煮浓缩，60七真空干燥成 干浸膏，4七冷冻备用，临用时以生理盐水配成溶 液。加味脑泰方的浓度0.9 g/ml,灌胃剂量9g/kg, 每天1次。 1.1.3实验仪器和试剂珊顿冰冻切片机(Shan Don),鼠抗 BrdU (Serotec),兔抗 Ki-67、生物素化 广谱 IgG、3,3-Diaminobenzidine (DAB ) (Vector),鼠 抗 Nestin(BD Bio-sciences )、MCA0 栓线(北京西 浓)、01ympus E53 显微镜(Olympus)，等。 1.2方法 1.2.1局灶性脑缺血模型制备采用大脑中动脉 栓塞法(MCAO)制备局灶性脑缺血模型。10% 水合氯醛(0.35 ml/100g)腹膜腔注射，待完全麻 醉后，将SD大鼠仰卧位固定于Kopf脑立体定位 仪上，75%酒精消毒去毛。取颈正中旁偏右做一 切口；钝性分离颈右侧颈总动脉和迷走神经，并 用微动脉夹夹闭颈总动脉的近心端，分离颈外动 脉和颈内动脉，在分叉处结扎(活结)颈外动脉。 然后在颈总动脉分叉部附近剪一小口，将拴线(直 径0.28 mm,头端0.34 mm)插入到颈内动脉，插入
【关键词】加味脑泰方；局灶性脑缺血；齿状回颗粒下区；神经元；大鼠
Effect of supplemented Naotaifang on the expression of BrdU , Ki67 and Nestin in the subgranular zone of den・ tate gyrus of hippocampus in rats with focal cerebral ischemia WANG Wei f HE Xu, ZHAO Hong, Shen Yan-wei,