遗传病基因诊断-2015-2016学年

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5 1.为正常 2、4、5纯合患者 3.为杂合子
(3) PCR----DGGE
• 变性梯度凝胶电泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE） • Tm值----DNA双链50%解链温度。 • Tm值主要与碱基组成相关。 • PCR扩增后的DNA，在变性梯度由低到高的聚丙 烯酰氨凝胶电泳过程中，Tm值低的DNA片段先 解链，电泳速度变慢 一个碱基差异也能改变 Tm值导致泳动速率改变 产生泳动变位，能检 测已知，未知点突变。 • 检测突变率比PCR-----SSCP高。
• 基因组中广泛存在的碱基置换，大约几百 ~1kb之中有一个。
• 应用于：
– 疾病的关联分析
– 基因功能鉴定
– 基因发现和制图
– 候选基因发现
连锁分析举例
连锁分析举例
连锁分析举例
连锁分析举例
I1 II 3
4.2 7.0
I2 4.0 7.0
4.0 7.0
4.0 7.0
4.0 7.0
II 1 4.2 9.7 4.0 7.0 4.2 7.0
（2）Southern印迹杂交
• 1975年Southern建立的检测DNA技术。 • 基因组DNA 限制酶消化 凝胶电泳分离 变性 转移到 硝酸纤维素膜(尼龙膜) 固定 预杂交 探针 杂 交 洗膜 放射自显影 分析杂交片段的大 小及密度。 • 可检测:
① DNA片段的缺失,插入,重排等。 ② 改变限制酶酶切位点的点突变。 ③ DNA扩增等拷贝数改变。 ④ RFLP等多态性。
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第二代遗传标记：数目可变的串联重复 （Variable number tandem repeat，VNTR） • 大约几十bp长的碱基序列在人群中其重复的拷贝 数不同所产生的多态，一般在非编码区中。
– 小卫星DNA(6~28bp)n – 微卫星DNA(2~6bp)n ，也称STRP（small tandem repeat polymorphism）
4、DNA测序
• Sanger法-----双脱氧核苷酸末端终止法。
• 双脱氧核苷酸不能形成5’磷酸和3’OH之间的 磷酸二脂键（因3’也脱氧）而终止反应。
• 4个反应体系分别加入ddATP，ddGTP，ddCTP， ddTTP，将产生不同长度（在A，G，C，T处随 机终止）的DNA片段，分别在变性凝胶电泳分离 呈梯状带型，自下而上是5’ 3’被合成的 DNA链顺序。
• 基因点突变正好发生在某限制酶识别位点 切点消失或增加 酶切片段长度改变。 酶
• 酶切图谱法检测的缺点:
① 不直接影响酶切点的突变不能检测到。 ② 产生的片段大小太相似也不易被检测到。 • 特异性扩增含酶切位点的PCR扩增片段，再经酶 切后电泳检测----更简便,快速,也能弥补缺点②。
镰状细胞血红蛋白（HbS）
II 2 4.2 9.7 4.0 7.0
连锁分析的优点
• 不一定清楚病因基因的分子基础，只要有基因内 或近旁DNA多态标记就可以分析。
• 缺点:
1、必须要有先证者以及家系中相关各成员的 DNA才能分析。
2、携带者是杂合子时才能分析。 3、连锁分析要充分认识到由于减数分裂时同源 染色体交叉互换导致误诊的可能性。
– 与正常序列杂交的探针 – 与异常序列杂交的探针 • 优点：探针可准确合成；不改变酶切位点的突变 也能检测。 • 缺点: 突变位点及性质清楚的前提下才能合成 ASO探针，只能检测已知点突变。
2、间接方法---连锁分析法
• 基因内或基因近旁DNA多态为遗传标记进行连锁 分析，判断被检者是否得到带有致病基因的染色 体而作出诊断。
诊断、治疗
• 血浆代用品 FVIII因子 分离的FⅧ因子 基因治疗 基因工程产品
• FVIII基因于1984年克隆并定位于Xq28，全长 186kb，含26个外显子，25个内含子，mRNA全 长为9kb，编码2351个氨基酸。 • 由于致病基因突变类型复杂多样，且突变位点不 集中------直接诊断受限制。
检测点突变
• 已知点突变检测：
1、RFLP 2、ASO探针杂交法 3、等位特异性PCR 4、PCR----SSCP
• 未知点突变检测：
1、PCR----SSCP 2、PCR----DGGE 3、DNA测序 4、DHPLC
5、PCR-----DGGE
（1）RFLP方法---检测已知突变
• 基因较大片段缺失或插入 酶切片段长度改变。
• 生化检测：血清中磷酸肌酸激酶（CPK）升高。 • 肌电图：肌源性改变等。 • 1987年Kunkel等克隆DMD基因，定位于Xp21， 全长2400kb，含79个外显子，cDNA长度为14kb。
DNA自动测序
• 应用如上原理，不同的是：
① 4种不同荧光染料标记的dNTP掺入酶促反 应(不用分4个反应体系)。 ② 经过毛细管凝胶电泳分离(不用分4个泳道)。 ③ 激光分析和计算机处理，直接标出碱基序 列。
焦磷酸测序
焦磷酸测序检测结肠癌KRAS基因突变
下一代 “克隆” 测序
5、DNA微阵列（DNA芯片）
（3）Northern 印迹杂交
• 检测RNA的分子杂交技术
• 提取组织总RNA oligodT mRNA 琼脂糖凝胶电泳分离 转移 含甲醛的 预杂交
探针
杂交
洗膜
放射自显影。
• 检测特异mRNA大小和表达量。
（4）原位杂交及荧光原位杂交
（Flurescence in situ hybridization，FISH）
四、基因诊断-------遗传病产前诊断
1、甲型血友病（Hemophilia A）：FVIII因子遗传 性缺陷所致的凝血障碍性出血性疾病. • 发病率：男性的1/5000~1/10000，XR。 • 症状: – 自然或轻微外伤后出血不止。 – 皮下、关节、肌肉出血----关节强直、劳动力丧 失。 – 颅内出血可危及生命。 • 根据血浆中FⅧ浓度可分为轻、中、重度。
核酸分子杂交操作程序
制备待测核酸样品 分离、变性、转移、固化DNA片段 预杂交 杂交 漂洗去除未参与杂交的标记探针 制备核酸探针 标记核酸探针 加入标记核酸探针
检测杂交信号
（1）斑点杂交 （Dot blotting hybridization）
• 主要用于基因缺失和拷贝数改变。
• 应用： 1）混合样品DNA鉴定 2）基因缺失检测 3）基因表达分析 • ASO探针（等位基因特异性寡核苷酸）---检测已知点突变。
间接基因诊断
• 方案：先检测SRY，ZFY/ZFX基因，诊断性别后
– 间接诊断——连锁分析 1、首先ST14（DXS52）位点的VNTR多态； 2、FVIII基因intron 18中的Bcl I/RFLP； 3、FVIII基因intron 22中的Xba I/RFLP；
4、FVIII基因intron 13中的（CA）n多态。
• 引物的核苷酸顺序将决定扩增片段特异性及其长 度。 • 该技术灵敏度高，特异性强，操作简便，快捷， 目前自动化操作。
PCR扩增
（1）PCR----RFLP
• PCR扩增后酶切，检测点突变或多态。
（2）PCR----SSCP
• 单链构象多态（single strand conformation polymorphism, SSCP）：DNA单链在非变性胶 中电泳时形成立体构象，其构象与碱基顺序相关。
基因诊断
主要内容
一、基因诊断概念 二、基因诊断基本原理及常用技术
1、核酸分子杂交 2、探针标记 3、PCR技术 4、DNA测序 5、DNA微阵列（DNA芯片）
三、基因诊断方法 四、基因诊断-------遗传病产前诊断
一、基因诊断概念
传统诊断法: 表现型 推测 基因型。 基因诊断法: 基因型 推知 表现型。 检测核酸 分析 特定基因 判断 基因型。
• 例如:
– FVIII基因 ST14(DXS52)位点 (60bp)n – DMD基因intron 44、45、49、50中 (CA)n – PAH基因 intron3中STR(4bp)n
• 优点: 群体中等位基因数目多，杂合子频率高。
第三代遗传标记：单核苷酸多态 （Single nucleotide polymorphism，SNP）
PCR Mst II
A … … CC↓TGAGG … … 56 bp 54 bp S … … CCTGTGG … … 110 bp
（2）ASO探针杂交法--检测已知点突变
• 等位特异性寡核苷酸探针（allele specific oligonucleotide probe，ASO）以点突变为中心 合成20bp左右的一对探针：
• • • •
染色体标本上，组织切片上分子杂交 原位杂交----3H标记探针 FISH-----荧光素或生物素标记 应用于基因定位，染色体数目及结构异常 诊断。 • 组织切片上的FISH----mRNA水平表达及一 些病原体感染诊断。
肌球蛋白mRNA在胚胎小鼠心脏原位表达
荧光原位杂交（FISH）与染色体涂染
• 在杂交测序基础上发展起来的：
① 大规模集成电路手段把成千上万个寡核苷酸探针 有规律地排列在指甲大小的芯片上----制作寡核 苷酸阵列。 ② 将待测的DNA，RNA或cDNA用荧光标记后在 DNA芯片上与探针杂交。
③ 用激光共聚焦显微镜对芯片进行扫描，配合计算 机处理荧光信号，得出所需信息。
High-resolution melt curve analysis (HRM)
• 长度相同，但只要一个碱基的差别 形成不同 构象 泳动速率不同 形成不同泳动带。 • 能检测已知和未知点突变。
PCR-SSCP过程
--------------------------primer --------------------------↓ 32P-dNTP掺入 PCR扩增 产物 ↓ 变性 ↓ 单链DNA ↓ 中性聚丙烯酰胺凝胶电泳 ↓ 1 2 3 自显影 ↓ 结果分析
基因诊断特征: 1. 检测DNA不受被检测来源的限制。 2. 症状前诊断成为可能。 3. 对遗传病可进行分子水平再分类----遗传异质性 的分子水平阐明。
二、基因诊断基本原理及常用技术
1、核酸分子杂交
双链DNA
变性 加热,强酸,
单链
复性 探针
杂种DNA
强碱,变性剂
• 探针: 一段与待测DNA或RNA互补的核苷酸序列, 作为工作状态的探针必须是单链。 • 常用探针种类: 基因组DNA, cDNA,人工合成的寡 核苷酸。
– 直接诊断：检测i22的倒位。
2、假肥大型肌营养不良症(DMD/BMD)
• 肌萎缩中占60%。 • 由于抗肌萎缩蛋白（dystrophin）遗传性缺陷所 致的进行性肌萎缩的致死性神经肌肉性遗传病。 • 发病率为1/3500，XR遗传。 • BMD比DMD发病晚，病情轻。 • 主要症状：通常3---5岁发病，开始走路不稳，鸭 型步态，上楼梯困难，Gower征阳性，进行性肌 萎缩伴有腓肠肌假性肥大，10多岁下肢瘫，一般 在20多岁之前死于心衰或呼吸衰竭。
Identification of copy number changes by array comparative genomic hybridization (CGH)
三、基因诊断方法
1、直接诊断：直接检测致病基因缺陷性质。 能作直接诊断的条件： 遗传方式已知 病因基因或cDNA已克隆分离 突变性质与疾病关系已阐明 基因突变类型： 1、DNA碱基置换(点突变) 2、DNA片段的缺失、插入、重复等 3、动态突变
• DNA多态性（DNA polymorphism）：群体当中 不同染色体上的基因每几百个bp中大约有1个的 比例存在碱基取代，但对表现型无改变，这种变 异的频率在群体中占1%以上，这种现象叫DNA 多态性。 • 这种变异以孟德尔共显性遗传方式传递。
第一代遗传标记：限制性片段长度多态性 （Restriction fragment length polymorphism， RFLP）
3、PCR技术 （Polymerase chain reaction)
• 1985年美国cetus公司的Kary Mullis创建， 80年代一向革命性技术，1993年获诺贝尔 化学奖。 • 模拟生物体内的DNA复制，在体外DNA聚 合酶酶促合成某一特异DNA片断的技术。
步骤：
变性
20----30周期 复性 延伸