人凝血因子8分离纯化工艺分析_药学_医药卫生_专业资料.ppt
2第二章--生物制药工艺基础
第二节 微生物制药工艺技术基础
一、菌种的分离与筛选
1．含菌样品收集 2. 富集培养：“投其所好”，“取其所抗” 3. 菌种纯化：（1）平板划线法 （2）稀释平板法 4. 性能测定（菌种复筛）
（1）平板划线法
是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀 释而达到分离的目的。固体培养基四区划法接种法步骤：
二、菌种的选育与保藏
1．自然选育
依据自发突变原理，通过不断分离、筛选，除去 衰变菌落，从中选择维持原有生产水平的菌株或高产 突变株，达到纯化、复壮、稳定生产目的。
单孢子菌悬液的制备→分离→单菌落培养→筛选
2．诱变育种
指有意识地将生物体暴露于物理的、化学的或生物的一种 或多种诱变因子，促使生物体发生突变，进而从突变体中 筛选具有优良性状的突变株的过程。
优点是生产规模大、蒸发温度低、速度快， 目的是除去挥发性溶剂，保持物料生物活性， 加速蒸发原理是使液体形成薄膜，增加气化表面
积。
世界上最大的具有80m2蒸发面 积的薄膜蒸发器。
实验室常用真空旋转蒸发仪。
薄膜蒸发器
2.干燥
使物质从固体或半固体状经除去存在的水分或它种 溶剂，从而获得干燥物品的过程。
第二章 生物制药工艺技术基础
Basis of biopharmaceutical technology
生化制药工艺技术基础 微生物制药工艺技术基础 生物技术制药工艺技术基础 生物制药中试放大工艺设计 生物药物的研究与新药申报
本章学习目标
掌握：生化活性物质的提取、分离和纯化； 微生物菌种选育和培养。
②pH；
③盐；
④表面活性剂。
四、生化活性物质浓缩与干燥
1.浓缩方法： 生化活性物质的热不稳定性 ①盐析，中性盐硫酸铵沉淀蛋白（酶）； ②有机溶剂沉淀，生物大分子溶液
血液制品
用于乙型肝炎的 预防
血液制品生产商血源从何而来 ？
我国在2006年4月11日，卫生部会同国家食品药品监督管 理局等9部委共同制定了《关于单采血浆站转制的工作方 案》，该方案规定，将原来由县级卫生行政部门设置的单 采血浆站转制为由血液制品生产企业设置，血浆站与血液 制品生产企业建立“一对一”的供浆关系。简单来说，就 是血浆站归血液制品生产企业所有，自行采浆，国家有关 部门执行监督职能。红十字会没有任何权利向血液制品生 产企业出售血浆。
血液制品
生物工程二班 于滢
14674030
血液制品的定义
血液制品：由健康人的血浆或特异免疫人血浆分 离，提纯或由重组DNA技术制成的血浆蛋白组分或 血细胞组分制品，如人血白蛋白、人免疫球蛋白、 人凝血因子（天然或重组的）、红细胞浓缩物等， 用于诊断、治疗或被动免疫预防。
血液制品属于生物制品范围，主要指以健康人血 液为原料，采用生物学血液制品工艺或分离纯化 技术制备的生物活性制剂。
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标。
血液制品的优点
血液制品是在临床输血的基础上发展起 来 的，它通过将血浆中的有效组分分离 出来并用于治疗，较好地解决了全血不 易运输和大量长期贮存中的问题中的问 题。
血液制品的安全性
制备血液制品的原料是人的血浆，因而通过 血液传播的病原体，特别是某些病毒，如乙 肝病毒（HBV）、丙肝病毒（HCV）、艾滋病 病毒（HIV）等对血液制剂的污染，是影响血 液制剂安全性的主要原因。
血液制品是提取血浆中成分制造的，来源是单采浆站，由 供浆员有偿提供。无偿献血全部用于临床医疗，绝对禁止 用于血液制品生产。如果发现把无偿献血的血液用于生产， 可以向卫生部举保报。
人凝血因子8分离纯化工艺分析
3
01
相关背景
性质
结构
内容
六个结构域， 结构复杂
分子量
等电点 血浆含量 半衰期
330KD
4.3左右 0.1-0.2μg/ml 12h
4
01
相关背景
原材料：人新鲜冰冻血浆 主要杂质：人纤维蛋白原、人纤维结合蛋白、白蛋白、其他凝血因子等
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02 分离纯化工艺
关键步骤：
6
02 分离纯化工艺
冷沉淀中所含杂质： 杂质 人纤维蛋白原 人纤维结合蛋白 白蛋白 FⅨ FⅡ FⅦ FⅩ 分子量 340KD 450KD 67KD 56KD 72KD 50KD 59KD 等电点 5.2-5.6 5.5左右 4.7-4.9 4.0-4.6 4.1 4.0-4.6 4.1-4.6
7
02 分离纯化工艺
2. 乙酸缓冲液调节pH —— 等电点沉淀法
调节温度为15℃，pH6.3左右 去除等电点较高的人纤维白蛋白和人纤维结合蛋白
8
02 分离纯化工艺
3.Al(OH)3 吸附 —— 吸附分离法 （负吸附） 使用Al(OH)3 作为吸附剂，通过预实验确定铝胶含量为12%。由于该吸附剂为两性离子，在pH7.1 （预实验确定）左右时带正电，易于吸附小分子酸性蛋白，去除F Ⅸ、F Ⅱ、F Ⅶ、F Ⅹ 等
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02 分离纯化工艺
4. DEAE 650M 弱阴离子交换凝胶 —— 离子交换层析 固定层析过程为pH7.0,通过调节缓冲液盐浓度来改变蛋白结合能力，进行洗脱。 梯度洗脱方案：
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02 分离纯化工艺
11
02 分离纯化工艺
5. 病毒灭活 （1）S/D处理法 灭活脂包膜病毒 （2）100℃ 30min 干热灭活法灭活非脂包膜病毒
生物制品的基本知识 ppt课件
药学院---办公室305、QQ：
1
生物制品的基本知识
一、生物制品定义 二、生物制品种类 三、生物制品的生物学及免疫学基础 四、生物制品的用途 五、典型的生产设备
2
精品资料
• 你怎么称呼老师？ • 如果老师最后没有总结一节课的重点的难点，你是
否会认为老师的教学方法需要改进？ • 你所经历的课堂，是讲座式还是讨论式？ • 教师的教鞭 • “不怕太阳晒，也不怕那风雨狂，只怕先生骂我笨，
药品批准文号一般为“国药准字H”开头，如胰岛素、18种氨基酸注射液等。
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其中字母代表生物。和化学，第一二数字代表行政区，比如11代表北 京，34，代表安徽。20代表云南。
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生物制品的基本知识
（一）按生物制品的组成和性质可分为:
疫苗（Vaccines） 抗毒素及免疫血清(Antitoxin and Antisera) 血液制品（Blood Products） 细 胞 因 子 和 重 组 DNA 产 品 （ Cytokines and Recombinant DNA Products） 诊断制品(Diagnostic Reagents) 其他制品
苗
形成完整免疫
2. 抗原性稳定
点 3. 在一定范围内疫苗病 3. 经过灭活处理不会污染其它
毒可排斥野毒
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ病原
4. 可提纯抗原，加入佐剂增加 免疫效果
缺 1. 抗原不稳定，灭活即 1. 一般需注射2~3次才明显有效
失效
2. 一般仅产生体液免疫
点 2. 易污染其它病原
3. 抗原要求量大，制造工艺较
繁琐
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OPV:脊髓灰质炎是由脊髓灰质炎病毒引起的严重危害儿童健 康的急性传染病，脊髓灰质炎病毒为嗜神经病毒，主要侵犯中 枢神经系统的运动神经细胞，以脊髓前角运动神经元损害为主。 患者多为1～6岁儿童，主要症状是发热，全身不适，严重时肢 体疼痛，发生分布不规则和轻重不等的迟缓性瘫痪，俗称小儿 麻痹症。
人凝血因子8分离纯化工艺分析ppt课件
进一步纯化
借助亲和层析、层析后处理等方法,进一步提高凝血因子8的纯度
和活性。
离心分离-离子交换层析
离心分离
利用离心力将血浆成分按密度差异进行分离，去除杂质和红细 胞等不需要的部分。
离子交换层析
通过离子交换介质对带电荷的生物分子进行吸附和洗脱，实现 目标蛋白的进一步分离纯化。
层析参数优化
调整pH值、离子强度等因素，确保凝血因子8在层析过程中保 持活性并实现高效分离。
通过离心分离和层析等技术,可以有效去除 血浆中的杂质物质,如血细胞碎片、脂肪颗 粒等,确保最终产品纯度满足标准要求。
病毒去活
采用化学处理、热处理等方法对血浆制品 进行病毒灭活,可有效降低病毒感染风险,提 高产品的安全性。
质量控制
通过严格的质量检测,确保 final 产品符合相 关规范和标准,为患者用药提供可靠保障。
测试项目 理化性质 生物活性 杂质分析
评价重点
测试方法
pH值、溶解度、粘度 等
标准分析仪器测试
目标蛋白的功能活性
细胞活性测试、酶活 性测试等
高聚物、降解产物等
色谱、电泳等检测方 法
通过稳定性研究,可以确定产品的有效期,为产品的储运和保管提供依据,确保患者 用药的质量和安全。
杂质的去除及病毒去活
杂质去除
亲和层析-层析后处理
亲和层析 1
利用目标蛋白与亲和介质的特异性结合原理分离纯化
层析后处理 2
包括脱盐、浓缩、病毒灭活等步骤
质量控制 3
确保最终产品符合国家标准和注册要求 亲和层析是人凝血因子8分离纯化的关键步骤之一。它利用目标蛋白与特异性亲和介质的结合原理，实现高选择性的分离。层析后还需进 行脱盐、浓缩等处理，并进行病毒灭活等质量控制步骤，确保最终产品安全有效。
人凝血因子_的纯化
果做比较, 计算 FÕ (或 FÒ 、F× 、FÚ )的 百分 活性, 以 1 m l 正常人新鲜血浆中的 FÕ ( 或 FÒ 、F× 、FÚ )的 百分活 性作 为 1个活性单位 ( U )。 1. 7 紫外分光光度法测蛋白含量 将 1 mg /m l的牛 血清白
层析柱 ( 2. 6 cm @ 26 cm )用平衡液 (配方及 条件同上 )平衡, 然后将上述溶解后的 样品上柱, 平衡液冲洗直到紫外检 测值 回到基线; 再分别用 0. 1、0. 2和 0. 3 m o l/L NH4 C l的缓冲 液 做阶段洗脱 , 流速为 180 cm /h; 用 收集器按 10 m l/管收集, 隔 管检 测 FÕ B C。将 FÕ B C\ 2 U /m l 的 组 分 进 行 收 集, 用 01 22 Lm 的膜过滤, 检测总 FÕ B C和蛋白含量。用 超滤器 超 滤至适当体积。
v 通信作者: 肖小璞 ( 1953) ) , 女, 主任技师, 硕 士研究生导师, 主要 从事 血栓 与止 血相关 蛋白 质的 研究, 电话: 028-68169101, Em ai:l x-i aopux iao@ vip. sina. com
1 材料与方法
1. 1 实验用血浆 共 30袋 ( 600 g /袋 ) , 2008 年 7月 28日 由什邡单采血浆 站采 集、提供, 质 量符 合 5中 国生 物制 品规 程 6相关要求。 1. 2 仪器与试剂 层析纯化系统 ( AKTA explo re r 100 air, 美 国 GE公司 ); 垂直电泳 仪 ( EPS-601, 美国 GE 公司 ); 大容量 低温冷冻 离心机 ( SORVALL RC 3BP+ , 美国 Therm o 公司 ); 超滤器 (M icon8050, 美 国 M icon公 司 ); 紫 外-全 波长 分 光光 度计 ( UV2900, 日 本 日立 公 司 )。 Benzam id ine hydrochloride ( 2726b015, 美 国 P romega 公 司 ); 胰 蛋 白 酶 抑 制 剂 ( 90234021, 美 国 R oche 公 司 ); 二 异 丙 基 氟 磷 酸 ( DFP ) ( 55914, 美国 S igm a公司 ); 缺乏 FÒ 血浆、缺乏 FÕ 血浆、缺 乏 F × 血 浆、缺 乏 F Ø 血 浆、缺 乏 F Ú 血 浆 ( F Ò - ID5020071127, F Õ- ID-5020071127, F × - ID-5020071127, F Ø ID-5020071127, F Ú -ID-5020071127, 美 国 HT I 公 司 ) ; PT 检 测试剂盒 ( 20071208, 成都协和生物技术中心 ); A PTT 检测试 剂盒 ( 20060402, 成都协和生物技术中心, ) ; 高分子量 M a rker ( IC0765, 美国 invitrogen公司 ); 其它试 剂均为国产分析纯。 1. 3 血浆前处理 1. 3. 1 加入酶抑制剂 将保存于 - 80e 新鲜冰冻血浆 1 L, 于 4e 放置 5 h, 37e 水浴迅 速融化, 然 后将血 浆转 入 4e 降 温, 加入酶抑制剂, 使终浓度达到如下标准: 2 mm o l/L Benzam id ine hydrochlor ide、1 mm o l/L DFP、50 mg /L 胰蛋 白酶 抑制 剂。用磁力搅拌器边搅拌边加入。 1. 3. 2 柠檬酸钡沉淀吸附 在经处理的血浆中加入 1 mo l/L BaC l2 80m ,l 4e , 边搅拌边逐滴缓慢加入, 30 m in加完, 然后继 续搅拌 30 m in, 静置 10 m in, 4e , 6 000 g离心 10 m in, 取上清。 1. 3. 3 PEG-6000分级沉淀 在 上清中加入 PEG 6000使终
人凝血酶原复合物提取及纯化工艺的研究
人凝血酶原复合物提取及纯化工艺的研究何淑琴;张丽铃;黄璠【摘要】[目的]确定血浆中人凝血酶原复合物提取及纯化的最佳工艺条件.[方法]以人血浆为原料,凝血酶原复合物的吸附率和回收率为评价指标,采用单因素试验及正交试验对提取和纯化条件进行优选.[结果]最佳工艺为:选用pH值为7.0的DEAE-Sephadex A50凝胶从人血浆中提取人凝血酶原复合物,吸附50 min时,凝胶对凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ的吸附率可达84.0％、86.5％、85.7％和78.0％;采用NaCl浓度为0.1 mol/L、pH值为7.2的洗涤液洗涤吸附后的凝胶5次,然后用NaCl浓度为2.0 mol/L的洗脱液洗脱3次,对凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ的回收率可达84.9％、76.4％、82.8％和78.7％.[结论]该工艺合理、可行,适合人凝血酶原复合物的工业化生产.【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2013(000)017【总页数】3页(P7420-7422)【关键词】人凝血酶原复合物;凝胶;提取纯化工艺【作者】何淑琴;张丽铃;黄璠【作者单位】江西博雅生物制药股份有限公司,江西抚州344000;江西博雅生物制药股份有限公司,江西抚州344000;江西博雅生物制药股份有限公司,江西抚州344000【正文语种】中文【中图分类】S188人凝血酶原复合物制剂(Prothrombin Complex Concentrate，PCC)是一种从人血浆中分离提取出的、具有凝血功能的混合制剂，其主要含有Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ4种凝血因子。
在我国，PCC是治疗乙型血友病的主要制品［1］。
在临床上，PCC也被广泛地用于肝病患者的治疗，及治疗服用抗凝药物如双香豆素等过量而引起的出血症状［2］。
1959年，Diaisheim 等［3］最早用磷酸钙吸附法从人血浆中分离出含凝血因子IX的凝血酶原复合物，而我国血液制品产业发展缓慢，国内PCC有以血浆组分III为起始原料进行制备的报道［4］，但易出现凝血酶原激活现象。
纳米膜过滤技术在提高人血浆制品安全性方面的应用
纳米膜过滤技术在提高人血浆制品安全性方面的应用来源：本站原创作者：代旭兰陈海陈代杰刘文芳（四川远大蜀阳药业股份有限公司，四川双流 610214）发布时间：2009-12-2病毒污染严重威胁血液制品的安全性，如何进一步提高制品的安全性是人们始终所关注的问题。
虽然经过改进原料血浆筛选的检测方法、增加血浆检疫期、增加制品有效病毒灭活/去除步骤、提高生产技术和GMP等措施已经使制品安全性得到了很大的提高，HIV、HBV和HCV）经由现代生产工艺制得的血液制品传播的可能性已经非常小，但仍有少量的病毒，如细小病毒B19（B19）等小型病毒，通过一些凝血因子浓缩物传播的危险还没有完全消除［1—3］，新出现的病原体，如变异型克雅氏病（vCJD），也是安全性关注的焦点［4,5］。
因此，血液制品的研究与生产厂家仍然要致力于不断研发增加病毒灭活/去除的新方法。
采用小孔径的膜过滤血浆蛋白溶液，是通过筛选机制截留并去除血浆中的病毒的一种方法；和常规的过滤不同，这项技术所采用的膜的平均孔径为纳米级别，且专为去除病毒而开发，所以又被称为纳米膜过滤。
目前，这项技术作为病毒灭活/去除方法的一种安全补充措施，已被广泛接受并应用于生物制品的病毒去除。
1 纳米膜过滤技术及其产品类型1.1 纳米膜过滤的原理该技术是根据根据分子筛原理，按膜孔径大小截留病毒，使目的蛋白通过滤器，大致分为错流（切向）过滤和直流（死端）过滤2种方式，其病毒去除率和蛋白透过率很大程度上都依赖膜的结构。
纳米膜过滤能有效去除大于膜平均孔径的病毒，对于小于或接近平均膜孔径的病毒、病毒聚合体、潜在的病毒与抗体复合物则去除效果不甚理想，蛋白质浓度和因电荷效应产生的膜表面吸附等因素都可能影响病毒清除的程度。
该技术的蛋白质回收率取决于蛋白浓度、蛋白质聚合物或高分子量组分、过滤表面积、pH和温度等因素。
市售的多数纳米膜为整装的易处理囊式膜包或盒式膜包，可在过滤前后对其进行完整性测试，以确保该滤器在使用中滤除病毒的能力，这是纳米膜过滤可靠性的一个额外的保障。
生物化学教学大纲(药学、预防、临床、中药等专业)
《生物化学》教学大纲（供药学专业、药物制剂专业、制药工程专业、化学工程与工艺专业、中药学专业、中药资源与开发专业、临床医学专业、预防医学专业、卫生检验专业、护理学专业及所有方向使用）一、课程性质、目的和任务生物化学（biochemistry）又称为生命的化学，是研究生物体内化学分子与化学反应的科学，从分子水平探讨生命现象的本质。
生物化学主要研究生物体分子结构与功能，物质代谢与调节，以及遗传信息传递的分子基础与调控规律。
生物化学的研究主要采用化学的原理和方法，但也融入了生物物理学、生理学、细胞生物学、遗传学和免疫学等的理论和技术，使之与众多学科有着广泛的联系和交叉。
本课程主要向学生传授了生物大分子的结构与功能；生物体重要物质代谢的基本途径、主要生理意义、调节以及代谢异常与疾病的关系；基因信息传递的基本过程、基因表达调控的概念；各组织器官的代谢特点及它们在生命活动中的意义等知识。
为学生学习其他基础课、专业课乃至毕业后的继续教育、相关学科的研究工作中在分子水平上探讨疾病的病因、发病机理及疾病诊断、预防、治疗奠定理论与实验基础。
二、课程基本要求本课程分为掌握、熟悉、了解三种层次要求。
掌握的内容要求理解透彻，能在本学科和相关学科的学习工作中熟练、灵活运用其基本理论和基本概念。
熟悉的内容要求能熟知其相关内容的概念及有关理论，并能适当应用。
了解的内容要求对其中的概念和相关内容有所了解。
考试内容中掌握的内容约占70%，熟悉、了解的内容约占25%，超大纲内容约占5%。
本大纲的参考教材是普通高等教育“十五”国家级规划教材、卫生部规划教材、普通高等学校规划教材《生物化学（第六版）》（周爱儒主编，北京，人民卫生出版社，2007年）。
三、课程基本内容及学时分配生物化学课程的教学内容大体分为四个部分：从第一章到第三章为第一部分，主要讨论生物大分子的结构和功能；第四章到第九章为第二部分，主要内容为物质代谢、能量代谢及代谢调节；第十章到第十四章为第三部分，主要内容为分子生物学中遗传信息的流向及调控；第十五章到第十八章为第四部分，主要内容为基因重组与基因工程、机能生物化学等内容。