分子荧光光谱分析PPT
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第九章分子荧光光谱法Molecular-fluorescence-spectroscopy
测量荧光的仪器主要由四个部分组成：激发光源、样品 池、双单色器系统、检测器。
特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。 基本流程如图： 单色器：选择激发光波长 的第一单色器和选择发射 光(测量)波长的第二单色 器； 光源：灯和高压汞灯，染 料激光器(可见与紫外区) 检测器：光电倍增管。
仪器框图
该型仪器可进 行荧光、磷光 的发光分析；
同步扫描技术
根据激发和发射单色器在扫描过程中彼此间所保持的 关系，同步扫描可分为固定波长差(Δλ)和固定能量差及可 变波长三种；
辐射复合发光过程：
1. 自由激子复合(X)； 2. 导带电子—中性受主复合
(e，A0)； 3. 施主—受主对复合
(D0，A0)； 4. 束缚于中性施主上的——
激子复合 (D0，X)； 5. 中性施主——价带空穴的复合(D0，h)；
中性受主、电离施主或受主上的和等电子杂质上的束缚激子复合而发 光。
3.激发光谱与发射光谱的关系
（4）取代基效应：芳环 上有供电基，使荧光增 强。
3.内滤光作用和自吸现象
内滤光作用：溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发射 的荧光，如色胺酸中的重铬酸钾；
自吸现象：化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸收 光谱的长波长端重叠，产生自吸收；如蒽化合物。
4、溶液荧光的猝灭
碰撞猝灭： 氧的熄灭作用等。
四、仪器结构流程
2. 激发态分子的失活: 激发态分子不稳定，它要以辐射
或无辐射跃迁的方式回到基态。
λ1
λ2
λ2/
λ3
λ4
无辐射跃迁:
(1) 振动弛豫：激发态分子由同一电子能级中的较高振动能 级转至较低振动能级的过程，其效率较高。 (2) 内转换：相同多重态的两个电子能级间，电子由高能级 回到低能级的分子内过程。 (3) 系间窜越： 激发态分子的电子自旋发生倒转而使分子的 多重态发生变化的过程。 (3) 外转换：激发态分子与溶剂或其它溶质相互作用、能量 转换而使荧光 （或磷光）减弱甚至消失的过程。荧光强度的
特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。 基本流程如图： 单色器：选择激发光波长 的第一单色器和选择发射 光(测量)波长的第二单色 器； 光源：灯和高压汞灯，染 料激光器(可见与紫外区) 检测器：光电倍增管。
仪器框图
该型仪器可进 行荧光、磷光 的发光分析；
同步扫描技术
根据激发和发射单色器在扫描过程中彼此间所保持的 关系，同步扫描可分为固定波长差(Δλ)和固定能量差及可 变波长三种；
辐射复合发光过程：
1. 自由激子复合(X)； 2. 导带电子—中性受主复合
(e，A0)； 3. 施主—受主对复合
(D0，A0)； 4. 束缚于中性施主上的——
激子复合 (D0，X)； 5. 中性施主——价带空穴的复合(D0，h)；
中性受主、电离施主或受主上的和等电子杂质上的束缚激子复合而发 光。
3.激发光谱与发射光谱的关系
（4）取代基效应：芳环 上有供电基，使荧光增 强。
3.内滤光作用和自吸现象
内滤光作用：溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发射 的荧光，如色胺酸中的重铬酸钾；
自吸现象：化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸收 光谱的长波长端重叠，产生自吸收；如蒽化合物。
4、溶液荧光的猝灭
碰撞猝灭： 氧的熄灭作用等。
四、仪器结构流程
2. 激发态分子的失活: 激发态分子不稳定，它要以辐射
或无辐射跃迁的方式回到基态。
λ1
λ2
λ2/
λ3
λ4
无辐射跃迁:
(1) 振动弛豫：激发态分子由同一电子能级中的较高振动能 级转至较低振动能级的过程，其效率较高。 (2) 内转换：相同多重态的两个电子能级间，电子由高能级 回到低能级的分子内过程。 (3) 系间窜越： 激发态分子的电子自旋发生倒转而使分子的 多重态发生变化的过程。 (3) 外转换：激发态分子与溶剂或其它溶质相互作用、能量 转换而使荧光 （或磷光）减弱甚至消失的过程。荧光强度的
《荧光光谱法》PPT课件
O
CC
3b
Counts
60000 40000
O C 2H 5
20000
0 300 350 400 450 500 550 600
Wavelength (nm)
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8
从图可看出激发光谱同荧光光谱大致成
镜相对称 a.荧光光谱(发射光谱）形状与基态S0振能级的分布情况（即能量间
隔情况）有关 b. 激发光谱(吸收谱)形状与激发态S1振动能级的分布有关 c. S0、、S1态中振动能级的分布是相似的(说明峰形状相 似）
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33
一般情况下，多采用相对灵敏度来表示。相对灵敏度是以喹啉硫酸氢 盐的0.05mol/L硫酸溶液为标准，并定为1，然后与相同浓度荧光物 质的荧光强度比较，可求该物质的相对灵敏度。
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34
3. 荧光分析法的选择性 很多分子在紫外可见区有吸收，但其中
只有一部分能再发射荧光或磷光，故荧光法 固有干扰很少，选择性较好。
b. 荧光物质的激发态分子M*与基态分子M形成激发态的二聚体（M*M）。
c. 基态的荧光物质分子的缔合。荧光自猝灭是与浓度有关的效应，因而 通过在荧光测定前稀释溶液的办法，可避免这一现象的发生，或减 小它所产生的影响。
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23
三、发光强度同浓度的关系
荧光强度If正比于吸收的光量Ia与荧光量子产
11
❖ 3、降落到第一电子激发态的最低振动能级的分子，继续降落到基态 的各个不同振动能级，同时发射出相应的光量子，这就是荧光；
❖ 4、到达基态的各个不同振动能级的分子，再通过无辐射跃迁最后回 到基态的最低振动能级。
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12
分子产生荧光必须具备两个条件：
分子光谱分析Chapter01
0.3 Differences between emission and absorption of radiation 吸光：基态→电子各激发态跃迁 吸光：基态→电子各激发态跃迁; 发射： υ 发射：S1(υ=0)→S0(υ=i)的辐射跃迁 υ 的辐射跃迁;
分别携带被观察物体的激发态或基态信息 信息， 分别携带被观察物体的激发态或基态信息，可以从不同侧面 激发态 了解物质的内部结构。 了解物质的内部结构。
发光概述?chp1荧光分析?principleoffluorimetry荧光的原理?thefluorescencemechanism荧光方法?characteristicsoffluorescencespectrum荧光光谱特性?fluorescencedecayandlifetime荧光衰减和寿命?quantumyield量子产率?fluorescenceintensity荧光强度01发光现象luminescentphenomena煤气燃烧蓝色火焰炽热铁丝黄色火焰煤气燃烧蓝色火焰炽热铁丝黄色火焰发光介绍introductiontoluminescence荧光灯管电激发发光白炽灯泡发光汞灯365nm3brcarbazole奇特磷光奇特磷光ex363nm光棒化学反应发光汞灯365nmfonkos菌悬浮液takenfromdrternuraevenmanysinglecelledorganismsarebioluminescent
二、发光的类型 (Type of luminescence )？ • Photoluminescence (光致发光 光致发光): 光致发光 Fluorescence/Fluorimetry; Phosphorescence/Phosphorimetry; • Chemiluminescence (化学发光 化学发光); 化学发光 • Bioluminescence (生物发光 生物发光); 生物发光 • Radioluminescence (辐射发光 辐射发光); 辐射发光 • Electroluminescence(电致发光 电致发光); 电致发光 • Sonoluminescence(声致发光 声致发光); 声致发光
第十三章-荧光分析法PPT课件
内部能量转换
当两个电子激发态之间的能量相差较小以至其振动能级有重叠 时，受激分子由高电子能级转移至低电子能级的过程。
.
6
荧光和磷光产生示意图
关于荧光
荧光的产生需经历两个过程：
吸收 发射
第一激发单重态的最低振动能级
振动驰豫 内部能量转换
.
8
例题
1. 所谓荧光，即某些物质经入射光照射后， 吸收了入射光的能量，从而辐射出比入射 光： A 波长长的光线 B 波长短的光线 C 能量大的光线 D 频率高的光线
.
24
三、影响荧光强度的外部因素
温度 溶剂 酸度 散射光
学习目的: 提高荧光分析的灵敏度和选择性
.
25
1 溶剂对荧光的影响
萘在下列哪种溶剂中的荧光强度最强？ A 1－氯丙烷 B 1－溴丙烷 C 1－碘丙烷 D 1，2－二氯丙烷
1. 一般情况下，荧光波长随着溶剂极性的增强而长移， 荧光强度也增强。
OH N
C H2
芴φf 1.0
O N Mg1/2
.
21
（三）分子的刚性和共平面性
CH3
SO3Na
N
CH3 CH3
SO3NaN CH3
H CCH
H CC H
结论：在相同的长共轭分子中，分子的刚性和共 平面性越强，荧光效率越大，荧光波长长移
（四）取代基效应
给电子基团 －NH2、 －OH、－OCH3、－NHR、－NR2荧 光效率提高、荧光波长长移
•
• • • •
cx
cs
.
34
二、定量分析方法
2、比例法（对照法）
Fs F0 KCs
FxF0KCx
Cx
Fx Fs
当两个电子激发态之间的能量相差较小以至其振动能级有重叠 时，受激分子由高电子能级转移至低电子能级的过程。
.
6
荧光和磷光产生示意图
关于荧光
荧光的产生需经历两个过程：
吸收 发射
第一激发单重态的最低振动能级
振动驰豫 内部能量转换
.
8
例题
1. 所谓荧光，即某些物质经入射光照射后， 吸收了入射光的能量，从而辐射出比入射 光： A 波长长的光线 B 波长短的光线 C 能量大的光线 D 频率高的光线
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三、影响荧光强度的外部因素
温度 溶剂 酸度 散射光
学习目的: 提高荧光分析的灵敏度和选择性
.
25
1 溶剂对荧光的影响
萘在下列哪种溶剂中的荧光强度最强？ A 1－氯丙烷 B 1－溴丙烷 C 1－碘丙烷 D 1，2－二氯丙烷
1. 一般情况下，荧光波长随着溶剂极性的增强而长移， 荧光强度也增强。
OH N
C H2
芴φf 1.0
O N Mg1/2
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（三）分子的刚性和共平面性
CH3
SO3Na
N
CH3 CH3
SO3NaN CH3
H CCH
H CC H
结论：在相同的长共轭分子中，分子的刚性和共 平面性越强，荧光效率越大，荧光波长长移
（四）取代基效应
给电子基团 －NH2、 －OH、－OCH3、－NHR、－NR2荧 光效率提高、荧光波长长移
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cx
cs
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二、定量分析方法
2、比例法（对照法）
Fs F0 KCs
FxF0KCx
Cx
Fx Fs
现代生物仪器分析第三章 分子荧光光谱法
第二节 荧光分析的原理
（一）荧光发生机理 物质的基态分子受一激发光源的照射， 被激发至激发态，在返回基态时，产生 波长与入射光相同或较长的荧光。 通过测定物质分子产生的荧光强度进行
分 析 的 方 法 称 为 荧 光 分 析 (fluorescence analysis)。
1、分子的激发态
荧光和磷光这两种光致发光过程的机理不同， 可从实验观察激发态分子寿命的长短来加以区 别： 对于荧光来说，当激发光停止照射后，发光 过程几乎立即停止（在10-9～10-6秒，荧光寿 命fluorescence life time ）。 磷光则将持续一段时间（在10-3～10秒）。
荧光分析法发展简史
2、分子荧光和磷光的产生
分子在室温时基本上处于电子能级的基态。当吸 收了紫外—可见光后，基态分子中的电子只能跃 迁到激发单线态的各个不同振动—转动能级，根 据自旋禁阻规律，不能直接跃迁到激发三重态的 各个振--转能级。 处于激发态的分子是不稳定的，它可能通过辐射 跃迁和无辐射跃迁等分子内的去活化过程释放多 余的能量而返回至基态，发射荧光是其中的一条 途径。
世界上第一次记录荧光现象是16世纪 西班牙的内科医生和植物学家 N.Monardes。 1575年他提出在含有一种木头切片的 水溶液中，可观察到极可爱的天蓝色。
1852年，stokes在考察奎宁和叶绿素的 荧光时，用分光光度计观察到其荧光的 波长比入射光的波长稍微长些，从而导 入了荧光是光发射的概念。 18工作。应用铝—桑色素配 合物的荧光进行铝的测定。 19世纪以前，荧光的观察是靠肉眼进行 的，直到1928年，才由Jette和West完成 了第一台荧光计。
激发单重态与激发三重态的性质不同
分子荧光光谱分析
分子荧光光谱分析分子荧光光谱分析是一种用于分析化学物质的基本技术，这种技术可以检测特定物质的含量或结构。
荧光光谱分析被大量应用于食品、农业、医药、环境分析等领域，在所有的分析技术中占有重要地位。
荧光光谱分析的基本原理是，经过一定的处理，把紫外线或可见光辐射照射到样品上，通过检测分子散射回来的光来测量特定分子的含量或结构。
当光辐射射到样品中时，分子会吸收辐射，然后经过一定的激发，输入一定的能量，使分子达到激发态，并以光子的形式释放这些能量，形成荧光光谱。
根据测量的荧光光谱，可以研究分子的稳定性、结构和含量。
荧光光谱分析主要有三类技术：荧光光谱仪、激发源谱仪和时间谱仪。
荧光光谱仪是一种用于检测可见光和紫外光的仪器，它可以检测样品中各种物质的荧光特性；激发源谱仪是一种用于精确测量荧光信号量的仪器，它可以同时获得多种物质的信号；时间谱仪是一种用于检测分子的荧光瞬变过程的仪器，可以检测各种分子行为的时间信息。
荧光光谱分析有一定的优势，例如精确，可以精确的检测分子的结构和运动；灵敏，可以检测出极少的物质；选择性，可以根据激发光的波长来选择不同的分子；全面，可以同时检测多种物质；适用性强，可以用于模拟各种物理和化学环境，如溶液、气体和固体等；可重复性强，可以将检测结果记录下来，以便重复使用。
荧光光谱分析的研究和应用正在不断深入，它已成为化学、生物、物理过程观察的重要手段，在食品、农业、医药、环境分析等方面均有广泛应用。
随着科学技术的发展，分子荧光光谱分析将会在更多领域有更多的应用，对于科学研究和技术应用将产生重要作用。
分子荧光光谱分析是一门复杂的学科，涵盖了物理学、化学、生物学等学科，能够有效检测分子的数量和结构，而且还可以用于模拟复杂的物理和化学环境，是一种有效的分析技术。
随着科学技术的发展，荧光光谱分析将会在更多领域有更多的应用，为社会发展做出更大的贡献。
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荧光自吸收：
荧光荧光波长与激发光波长重叠时，荧光被吸收
二、激发光谱与发射光谱
激发光谱:固定发射波长(λEM),一般在最大发射位置
做If– λEX的光谱，既不同波长激发光所
产生荧光的相对效率。 做If– λEM的光谱，既最大吸收波长下产 生荧光的相对强度。
发射光谱:固定激发波长(λEx),一般在最大吸收位置
当I0一定并且浓度C很小时,荧光强度与荧光物质浓度成正比
I f= K · C
K = 2.303 φ I0 kb)
Cmax≈0.05/kb 当C超过Cmax 时，If—C偏离线性 溶液浓度太大，荧光分子之间及荧光分子与溶剂分
子之间碰撞，发生非辐射跃迁，使荧光强度下降。
荧光自熄灭： C增大到一定程度，就会发生荧光自熄灭现象
5、能系间交叉跃迁
电子自旋被反转，使分子的多重性发生变化
6、磷光 从三重态最低振动能级回到基态，放出磷光。 二、影响荧光强度的因素 1、荧光效率（荧光量子产率Φ） 物质分子发射荧光的能力用荧光量子产率（Φ）表
示：
Ff = 发射荧光的分子数 激发态的分子数
= 发射的光子数 吸收的光子数
光致发光（Photoluminescence）:
荧光和磷光是分子吸光成为激发态分子，在返
荧光：受光激发的分子从第一激发单重态的最 低振动能级回到基态所发出的辐射。 磷光：从第一激发三重态的最低振动能级回到 基态所发出的辐射。
回基态时的发光现象.
分子的多重态
单重态
优势。 1、振动驰豫 1）分子吸收光子后，可能被激发到激发态的各个 振动能级 2）通过碰撞（非辐射跃迁）到达同一激发态的最 低振动能级 需时间10-13—10-11sec，效率较高 2、荧光发射
Hale Waihona Puke 分子从单重激发态的最低振动能级发射光子回 到基态——荧光发射。 荧光光谱的波长比吸收光的波长大（长），这 种现象叫作红移或斯托克斯位移。 3、内部转换 1）分子内过程，热退激 2）两个激发态重叠的能级发生内转换，因此吸 收λ1、λ 2 两种波长的光后，都产生λ’ 2 的荧光。 4、外转换 激发态分子与溶剂或其它溶质间相互作用和能量 转换。
一个所有电子自旋都配对的分子的电子
状态。大多数有机物分子的基态是单重态。
当基态一对电子中的一个被激发到较高能 级，其自旋方向不会立刻改变，分子仍处于 单重态。 有两个电子的自旋不配对而平行的状态。 激发三重态能量较激发单重态低。
三重态
一、分子退激发的过程 激发态分子回基态的途径很多，速度最快的途径占
4、检测器
光电倍增管
二、仪器光路
样品池 光源 激发单色器
发射单色器
检测器
第三节 荧光光谱法的基本参数及测量
一、荧光强度
根据朗伯-比尔定律
Ia=I0-I=I0(1-10-εbc)
则If=ΦfI0（1-10-kbc)=φI0(1-e-2.303k=bc) 对于稀溶液，kbc=A A＜0.05 If= 2.303 φf I0 kbc
机离子能与一些有机试剂形成荧光络合物,而进行定量测定.
生物化学及生理医学方面的应用
荧光法对于生物中许多重
要的化合物具有很多的灵敏度和较好的物效性,故广用于生 物化学分析,生理医学和临床分析.
药物分析
荧光分光光度计作为高效液相色谱,薄层色谱和高效毛细管
电泳等的检测器,使有效的分离手段与高灵敏度,高选择性的 测定方法结合起来,可用于测定复杂的混合物
3）pH值的影响
荧光物质的电离与非电离形式的Φf有差别，带 有酸性或碱性取代基的芳香化合物的荧光与 pH关； 4）溶解氧的影响 溶解氧的存在使Φf下降
第二节
荧光分光光度计
一、基本构造
1、光源
强度较高的氙灯或氙汞灯，要求有稳定的供电源。
2、单色器 两个，互成直角 3、样品池 四通杯
目的:找到λEXmax 和λEMmax
三、荧光分析法
直接荧光法：样品本身发荧光，直接测定其荧光强
度，按吸收定律计算样品浓度。
荧光物质）间接测定。 探测剂称为荧光探针
间接荧光法：样品本身不发荧光，通过探测剂（强
样品浓度的定量计算采用标准曲线法
四、荧光分析法的应用
无机物分析 无机离子中除少数例外一般不发荧光.但很多无
Φf与退激发过程的速率常数k有关
Ff =
k
f
kf + k i + k ec + k ic
凡是使荧光速率常数kf增大而使其他退激发过程 （能系间交叉、外转换、内转换的速率常数减小的 因素都可使荧光增强。 Kf、Ki与分子结构有关，Kec、Kic与分子所处的环 境有关
高荧光分子Φf
1，无荧光分子Φf
0
2、影响荧光强度的因素
1）荧光与分子结构的关系
a、能吸收紫外可见光，有共轭双键，分子呈刚 性、平面、多环结构，而且共轭平面越大、π电子共 轭度越大， Φf越高。 b、取代基的影响 给电子基团使Φf增强，如-NH2、-OH 与π电子体系相互作用小的取代基对荧光影响小
高原子序数的原子引入π电子体系，使荧光减弱
吸电子基团，如：-COOH 、–NO2 、–N=O2、 卤素 刚性平面结构有利于荧光，因为刚性结构可以 减少分子振动，减少能系交叉和碰撞退激。 2）温度和溶剂效应 温度升高， Φf下降 溶液黏度下降， Φf下降 不能使用含有重原子的溶剂
使荧光熄灭。
溶剂极性增加有时会使荧光强度增加，荧 光波长红移；若溶剂和荧光物质形成氢键或 使荧光物质电离状态改变，会使荧光强度、 荧光波长改变。
荧光团杂化纳米二氧化硅微球