产纤维素酶菌株的分离·筛选及酶活性测定

7 856
安 徽农业科学
2009 年
酶培养基中, 三角瓶摇床培养, 培养一定时间后, 取发酵后 的 湿曲1 g , 用20 ml 的0 .1 mol / L 柠 檬酸缓冲液 振荡洗涤1 h , 过滤除杂 , 离心( 5 000 r/ mi n ,10 mi n ,4 ℃) , 取上 清 液, 即为 初 酶液[ 11] 。制备好 酶液后, 用 DNS( 3 ,5- 二 硝基 水 杨酸) 法测 其 OD 值, 再与标准曲 线比对, 求出该菌株 的酶活。 1 .2 .4 酶活 测定[ 8 - 12] 。还原 糖的 测定 为 DNS 试 剂法[ 13] : 在 540 nm 处有最大 光吸收, 在一定范 围内 还原 糖的 量与 反应 液 的颜色强度呈比例关系, 利用比色法测定其还原糖生成量就 可测定纤 维素酶的活 力。酶活定义 : 在pH5 .0 、50 ℃条 件下 , 每1 ml 纤 维素初酶液 在1 mi n 内 水解 CMC- Na( 羧甲基纤 维素 钠) , 生 成 1 μg 的 葡 萄 糖, 称 为 一 个 CMC 酶 活 力 单 位 ( μg/ mi n) 。1 h 内还原 底物 生 成1 μmol 葡 萄 糖量 为一 个 FPA 酶活力单 位, 酶活 的测 定方 法 是用 DNS 法 测 定还 原 糖 含量 , 从还原 糖量来求得 酶活力的大小[ 14] 。 1 .2.4.1 葡萄糖标准 曲线的 绘制。 准确 称取 100 mg 分析 纯 的无水葡萄 糖, 用 少量 蒸 馏 水溶 解 后, 定 量转 移 到100 ml 容 量瓶中, 再定容, 摇匀, 浓度 为1 mg/ ml 。 取8 支 比 色管, 分 别 按表1 顺序加入各种试剂, 将各管溶液混匀后, 在分光光度 计上( 540 nm) 进行比色测 定, 用空 白管溶液调 零后, 测 定各 管 光密度值。根据表1 可绘制葡萄糖标准曲线。
能够降解纤维素的微生物有很多, 目前的研究大多集中 在康宁木霉 、里 氏 木霉、黑 曲 霉、白 腐 菌等 几 个 菌 株 上, 这 些 菌株仍然 存在着产酶 成本高、酶活性不稳 定、作 用pH 范围 狭 窄等问题。 因此寻 找 更 多、更 高效 、作 用 范 围更 广 泛 的 新 菌 种, 探寻更合理更科学的利用方法是十分必要的。 1 材料与方法 1 .1 材料 与试剂 1 .1.1 试 验材料。在尖 峰 岭原 始 森林、农 学院 苗 圃、枯叶 堆 积处、甘 蔗堆积 处、新 鲜牛 粪 等 含有 机 质 丰 富处 , 采 集 草、树 枝等腐 烂的样品。在 不同地点数 次采 样, 一般 在雨 后1 ～2 d 各菌快 速生长时采 集。 1 .1 .2 培养 基、试剂 与 仪器。 ①培 养基 。PDA 培养 基、滤 纸
安徽农业科学,Journal of Anhui Agri .Sci .2009,37( 17) :7855 - 7857 ,7859
责任编辑 罗芸 责任校对 张士敏
产纤维素酶菌株的分离·筛选及酶活性测定
吴琳, 景晓辉, 黄俊生* ( 中国热带农业科学院环境与植物保护研究所, 海南儋州571737)
摘要 [ 目的] 寻找更多高效降解纤维素的新菌种及其科 学利用方法。[ 方法] 利用“采样—培养—分离 单菌落—初筛—复筛—测 OD 值”的方法筛选出分解纤维素能力较强的菌株。[ 结果] 经反复培养 和划线分 离从80 份样品中初 选出35 株具有分 解纤维素能 力的菌 株。其中10 株由白转绿, 长势较好;6 株深绿色, 长势一般;4 株绿色, 长 势较好。这20 株都产孢子, 被初步鉴 定为绿色木 霉。用 刚果红 培养基进行复筛选, 得到9 株透明圈较大的菌株。将这9 株菌株再进行发酵培养, 用DNS 法进行酶活测定得到2 株酶活较强的菌株。这 2 株菌株被鉴定为棘孢木霉。通过滤纸崩解测试筛选出20 株降解纤维素 能力较强的菌种。DNS 法酶活测定结果表 明采自甘蔗 堆积处 和甘蔗地的2 个菌株的产酶活性最高。[ 结论] 采自甘蔗堆积处和甘蔗地的2 个菌株可以作为降解纤维素的新菌种。 关键词 纤维素降解菌; 分离; 筛选; 纤维素 中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517 - 6611( 2009) 17 - 07855 - 03
Isolation and Screening of Strains Producing Cell ulase and Their Enzyme Activity Deter mination WU Lin et al ( Institute of Environment and Plant Protection , Chinese Academy of Tropical Agricultural Science , Danzhou , Hainan 571737) Abstract [ Objective] The purpose was to find more new high- efficiency cellulose- decomposing strains and their utilization methods . [ Method] The strains with stronger cellulose- decomposing ability were screened out bythe method “sampling — culture —isolation of si ngle colony —pri mary screening — secondary screening — deter mination of OD value”. [ Result] Thirty-five strains with cellulose- decomposing ability were isolated from 80 samples through repeated culture and streakingi n pri mary screening . Amongthe m, 10 strai ns turnedfrom white to be green and their growth potentials were better ; 6 strains were dark green and their growth potentials were common ; 4 strains were green and their growth potentials were better ; all these 20 strains produced spores and were identified to be Trichoder ma viride preli minarily . The congo- red media were used and 9 strains with bigger transparent circles were got in secondary screening . These 9 strains were cultured by fermentation and their enzyme activities were deter mined by DNS method , then 2 strai ns with stronger enzyme activity were got . These 2 strains were identified to be Trichoderma asperell um. Twenty strai ns with stronger cell ulose- deco mposing ability were screened out through filter- paper disintegration test . The results of enzyme activity deter mi nation bynase- producing activities of the 2 strains collected fro mthe stacking place of sugar cane and sugar cane fiel d were highest . [ Concl usion] The 2 strains collected fromthe stacking place of sugar cane and sugar cane field could be used as new cell ulose- deco mposing strains . Key words Cellulose- decomposi ng microorganisms ; Isolation ; Screening ; Cellulose
基金项目 作者简介
收稿日期
国家 科技支 撑计划 项目( 2007BAD48B02) 。 吴琳( 1982 - ) , 女 , 山 东济 宁人, 硕 士研 究 生, 研 究方 向: 微 生物。* 通讯作者, 研究员。 2009-03-11
条培养 基、滤纸条 液体培养基 、CMC- Na( 羧甲基纤 维素钠) 、刚 果红纤 维素培养基、产酶培 养基。 ②试 剂。柠檬 酸缓 冲液 与 DNS 试剂。③试验 仪器。分光光 度 计、水浴 锅、恒 温培 养箱 、 全温培养 柜、pH 酸 度 计、烘 干 机、电 子 天 平、控 温 摇床 、全 自 动灭菌 锅、电磁炉 、微波炉 、离心机 等。 1 .2 试验 方法 将采 集样品接 入 初筛 培养 基, 在28 ℃恒 温 培养1 周, 再在固体选择培养基平板上进行划线分离, 经反 复驯化培养和划线分离后获得降解纤维素纯菌种9 种。 1 .2.1 菌 种的初筛选 。用 滤纸 条培 养 基[ 8] 和 PDA 培 养基 培 养。纤维素分解菌的筛选与分离纯化: 将采集样品用点接法 分别接 种于滤纸条培 养基和PDA 培 养基进行初 筛选, 按 照常 规的分离 法筛选 分离 菌 株,28 ～30 ℃条 件 下 培养 , 观察 菌 的 生 长状 况及 培 养基 的变 色 程度, 选 取菌 株 生长 快、培 养基 变 色明显 的菌株作 为 纤维 素 分 解菌 。也 可 以进 行 滤 纸崩 解 测 试, 该实 验没有 完 全按 照 滤 纸崩 解 测 试[ 9] 去 做, 只 观 察 记 录 了滤纸条 崩解的快慢 和程度, 选出 较优 菌 株20 余 株, 再进 行 复筛。 1 .2 .2 菌种 的复筛 。采 用 CMC( 羧甲 基 纤维 素 钠) 分离 培 养 基和刚 果红纤维 素 培养 基 进 行菌 种 复 筛。将 选 出 较优 菌 株 接种于 以羧甲基纤 维 素钠( CMC- Na) 为唯 一 碳源 的 固体 培 养 基上进行 复筛, 培 养观察, 根据菌丝的生 长速度及 CMC- Na 的 液化程度, 选出纤维素降解菌的优良菌株。再接种于刚果红 纤 维素 培养 基, 观 察透 明圈 产 生的 先后 、清 晰 度并 测 其直 径 大小。 1 .2.3 纯 培养与酶 液提 取 法。纯 培养 分 离方 法 为 平皿 划 线 分离法[ 10] 。培养 方法:250 ml 三角瓶 中装液体产 酶培养基50 ml 接入分离到 的 菌 株, 在 125 r/ mi n 、28 ℃ 条 件 下, 恒 温 振 荡 培养5 d。初酶液的提取方法: 取5 % 的种子培养液接种于产