电转染操作流程

Neon TM

电转染一般流程

1． 电穿孔前一至两天，将细胞转移至装有新鲜培养基的培养皿中，保证实验当天细胞量达

到70-90%。

2． 加培养基（不含抗生素）到24孔板中，每孔500µl ，放于37℃培养箱预热。（注：使用

其他孔数培养板或者100µl 枪头时，加入培养基和质粒及细胞的数量见下表1） 3． 将培养细胞取出，悬浮细胞直接取部分培养的细胞计数，确定细胞密度；贴壁细胞用2ml

的PBS 冲洗细胞，吸出PBS ，加入约750µl 胰酶消化3min ，加入750µl 培养基，终止消化，取部分细胞悬液进行细胞计数，确定细胞密度。

4． 将悬浮细胞转到离心管，室温下100-400g 离心力离心5min ，倒掉上清。 5． 向细胞中加入2mlPBS 冲洗细胞，室温下100-400g 离心力离心5min 。

6． 吸出PBS,用重悬缓冲液R 重新悬浮细胞沉淀，最终使细胞密度为2.0×107个/ml 。轻轻

吹打细胞，使其形成单细胞悬液。（注：细胞悬液在室温时间不能超过15-30min ,否则将导致细胞活性和转染效率降低）

7． 将适量质粒加到1.5ml 离心管中，再加入细胞悬液，轻轻混匀。所用细胞浓度、DNA 和

接种体积见下表1）。

8． 将装有3ml 电解缓冲液E 的Neon TM 管插入移液器架中。 9． 在仪器上设置脉冲电压、脉冲宽度、脉冲数。 10．将枪头插入NeonTM 移液器中，用10µl 的枪头吸细胞混合液，枪头中必须无气泡。将带有样品的NeonTM 移液器垂直插入NeonTM 管中。

11．选择电穿孔方案，并按下触摸屏上的Start （开始）键。 12．电脉冲释放后，触摸屏上会显示完成，提示电穿孔完成。 13．将脉冲好的样品立即转移至准备好的装有预热培养基的培养板中。将培养板放到培养箱培养。

14．实验结束后，倒掉移液器中E 液，关闭电转仪。

注意：1．加R 液体积=四大格细胞总数/（4×104）×细胞液体积/（2.0×107）。 2．加入质粒体积=加入质粒的量/质粒浓度。

3．加入细胞悬液体积=需加细胞数量/细胞悬液浓度。 4．每个枪头最多只能用2次。

5．Neon TM 管装入的3ml 电解缓冲液E 可用10次电转化。

6．Neon TM 管中加入3ml 电解缓冲液，用10µl 枪头时加E 液,100µl 枪头时用E2液。 表1

NeonTM 枪头 平板培养基的体积 细胞数量（个） 规格 每孔表面积(cm2)

DNA(µg) 10µl 100µl 96孔 0.3 0.2-0.3 √ 100µl 1-3×104 48孔 0.7 0.3-0.7 √ 250µl 5-7.5×104 24孔 2 0.5-1.5 √ 500µl 0.5-1.5×105 12孔 4 0.5-3.0 √ 1.0ml 1-3×105 6孔 10 2.0-4.0 √ √ 2.0ml 0.5-1×106 60mm 20 4.0-8.0 √ 5ml 2-4×106 10CM

60

8.0-16

√

10ml

4-8×106