基因工程考试试题

基因工程一名词解释1、限制与修饰系统：限制酶的生物学功能一般被认为是用来保护宿主细胞不受外源DNA的感染，可讲解外来DNA，从而阻止其复制和整合到细胞中。

一般来说，与限制酶相伴而生的修饰酶是甲基转移酶，或者说是甲基化酶，能保护自身的DNA不被讲解。

限制酶和甲基转移酶组成限制与修饰系统。

简答1.何谓 Star activity？简述 Star activity 的影响因素及克服方法？答：在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特征称为星星活性。

引起星星活性的的因素：①高甘油浓度（>5%）；②酶过量（>100U/µl）；③低离子强度（<25mmol/L）；④高 pH (>；⑤有机溶剂如 DMSO （二甲基亚砜）、乙醇、乙二醇、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺等；⑥用其它二价阳离子Mn2+、Cu2+、Co2+ 或 Zn2+ 代替 Mg2+ 。

星星活性的抑制措施：①减少酶的用量，避免过量酶切，减少甘油浓度；②保证反应体系中无有机溶剂或乙醇；③提高离子强度到 100～150mM （在不抑制酶活性的前提下）；④降低反应 pH 至；⑤使用 Mg2+ 作为二价阳离子。

2. 试回答影响限制性内切核酸酶切割效率的因素？（影响酶活性的因素？）答：外因：反应条件、底物纯度（是否有杂质、是否有盐离子和苯酚的污染）、何时加酶、操作是否恰当，反应体系的选择、反应时间的长短内因：星星活性、底物甲基化、底物的构象3、DNA末端长度对酶切割的影响答：限制酶切割 DNA 时，对识别序列两端的非识别序列有长度要求，也就是说在识别序列两端必须要有一定数量的核苷酸，否则限制酶将难以发挥切割活性。

在设计PCR引物时，如果要在末端引入一个酶切位点，为保证能够顺利切割扩增的PCR产物，应在设计的引物末端加上能够满足要求的碱基数目。

一般需加 3～4 个碱基对。

4、何为载体？一个理想的载体应具备那些特点？答：将外源 DNA 或目的基因携带入宿主细胞的工具称为载体。

载体应具备：①在宿主细胞内必须能够自主复制（具备复制原点）；②必须具备合适的酶切位点，供外源 DNA 片段插入，同时不影响其复制；③有一定的选择标记，用于筛选；④其它：有一定的拷贝数，便于制备。

5抗性基因（Resistant gene）是目前使用的最广泛的选择标记，常用的抗生素抗性有哪几种？并举两例说明其原理？答：氨苄青霉素抗性基因（ampr）、四环素抗性基因（tetr）、氯霉素抗性基因（Cmr）、卡那霉素和新霉素抗性基因（kanr , neor）以及琥珀突变抑制基因 supF 。

⑴青霉素抑制细胞壁肽聚糖的合成，与有关的酶结合，抑制转肽反应并抑制其活性。

氨苄青霉素抗性Ampr 编码一个酶，可分泌进入细胞的周质区，并催化β-内酰胺环水解，从而解除氨苄青霉素的毒性。

⑵四环素与核糖体 30S 亚基的一种蛋白质结合，从而抑制核糖体的转位。

Tetr 编码一个由 399 个氨基酸组成的膜结合蛋白，可阻止四环素进入细胞。

6.何为α-互补？如何利用α-互补来筛选插入了外源 DNA 的重组质粒？答：α-互补指 lacZ 基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酶阴性的突变体之间实现互补。

α-互补是基于在两个不同的缺陷β－半乳糖苷酶之间可实现功能互补而建立的。

实现α-互补主要有两部分组成： LacZ△M15 ，放在 F 质粒或染色体上，随宿主传代； LacZ' ，放在载体上，作为筛选标记，当在 LacZ' 中插入一个片断后，将不可避免地导致产生无α-互补能力的β－半乳糖苷酶片断。

在诱导物 IPTG 和底物 X-gal（同时可作为生色剂）的作用下，含重组质粒的菌落不能产生有活性的β－半乳糖苷酶，不能分解 X-gal ，呈现白色，而含非重组质粒的菌落则呈现兰色。

以此达到筛选的目的。

7、试简述λ噬菌体的裂解生长状态Lytic growth 和溶原状态Lysogenic state 两种循环的分化及其调节过程？答：裂解生长状态是λ噬菌体在宿主中大量复制并组装成子代λ噬菌体颗粒，导致宿主细胞裂解。

溶原状态为λ噬菌体基因组 DNA 通过位点专一性重组整合到宿主染色体 DNA 中随宿主的繁殖传到子代细胞。

调节过程：由感染复数和细胞的营养状态决定的，感染复数越高，营养状态越差，则溶源化的频率就越高。

溶源现象的生化媒介可能是3'--5'cAMP，它在细胞内的浓度会随营养条件的变化而改变，当细胞在富营养培养基中生长时，cAMP 的浓度较低，有利于裂解生长；在缺乏cAMP的突变细胞中，更有利于裂解生长另外一个重要的调节因素是噬菌体的CⅡ蛋白，它是噬菌体基因转录的激活子，抑制裂解功能基因的表达，催化噬菌体 DNA 整合到细菌的染色体中去。

高浓度的CⅡ蛋白促进溶源化，而低浓度的CⅡ蛋白促进裂解生长。

当CⅡ蛋白浓度足够时，激活CⅠ蛋白和基因 int 的表达，导致噬菌体DNA与染色体整合，朝着溶源态生长。

9、cDNA文库的构建：将来自真核生物的mRNA体外反转录成cDNA，与载体连接并转化大肠杆菌的过程。

⑴细胞总RNA的提取和mRNA的分离⑵第一链合成：由mRNA到cDNA的过程为反转录，由反转录酶催化。

⑶第二链合成：①自身引物合成法②置换合成法③引导合成法④引物—衔接头合成法⑷双链cDNA里连接到质粒或噬菌体载体并导入大肠杆菌中繁殖10、文库质量检测答：文库质量是由文库所含克隆的数目、平均插入片段的长度、插入效率、基因组覆盖度和覆盖倍数等因素决定。

克隆数越多、平均插入片段的长度越长、插入效率和基因组覆盖度越高，文库质量越好。

克隆数目可以通过多次转化累加，但并非越多越好，只要达到一定数目的基因组覆盖倍数和覆盖度就行，一般要求达到4—6倍覆盖率。

11、基因覆盖倍数的估算方法答：有两种，一：用公式计算基因组覆盖倍数=平均插入片段的长度ⅹ克隆数/基因组DNA长度二：结合基因覆盖度检测来估算。

基因组覆盖度是指问苦衷克隆覆盖基因组的范围。

即选择一定数目的单拷贝基因作探针来筛选文库。

每个探针筛选的克隆数目，即为该基因位点的覆盖倍数。

12、解释并计算N=ln(1-P)/ln(1-f)式中N：代表一个基因组文库所包含重组克隆个数 P：代表所期望的目的基因在文库中出现的概率f：表示重组克隆平均插入片段的长度和基因组DNA长度的比值计算：大肠杆菌基因组大小约 mb，若P=99%，平均插入片段大小为20kb，f=20kb/4600kb,则N=1057.即当期望从一个平均插入片段为20kb的大肠杆菌基因组文库中筛选到任意一个感兴趣的基因的概率达99%，该基因文库至少应包含1057个重组克隆。

选择合适的载体系统和挑去一定的阳性克隆是构建基因组文库时首先考虑的问题。

论述题1、cDNA文库的均一化处理两条途径：基因组DNA饱和杂交法和基因组DNA饱和杂交法⑴基因组DNA饱和杂交法原理：利用不同表达水平的基因对应的基因组拷贝数相对一致的特点，可以对cDNA文库进行均一化处理步骤①将基因组DNA用限制性内切酶消化固定，消化后的基因组DNA扁形为相对较短的单链且最大可能的覆盖基因组。

②分离纯化独立cDNA文库的混合质粒③文库cDNA与固定的基因组DNA充分饱和杂交，固定住相应的cDNA，并将它洗脱重新转化受体菌。

优点：应用简单、没有一仪器上的限制缺点：由于基因组DNA相对很复杂，很难获得覆盖基因组的单链DNA片段，导致基因丢失；在基因组DNA与文库DNA杂交的过程中，文库DNA自身杂交的速度会很快，导致基因丢失。

⑵基因组DNA饱和杂交法原理：双链DNA在加热变后再复性形成双链DNA的速度遵循二次复性动力学原理。

即与组分中的单链DNA浓度有关，浓度越小，复性所需时间越长。

cDNA文库中高丰度的cDNA复性所需要的时间短，低丰度的cDNA复性所需的时间长。

通过对复性时间的控制，可以使高丰度的cDNA复性成双链状态，低丰度的cDNA保持单链状态。

利用羟基磷灰石柱很容易将单链和双链cDNA分开，再用得到的单链cDNA转化宿主细菌，即可得到均一化cDNA文库。

优点：几乎不会导致文库中cDNA的丢失；均一化效果明显缺点：基因组DNA饱和杂交法成功率高，而基因组DNA饱和杂交法在参数控制上存在着比较多的因素。

2、扣除杂交cDNA文库原理：利用分子杂交原理，去除非差异表达基因的cDNA，保留差异表达的基因的cDNA用于制备文库。

待测样本tester:待测样本的总cDNA。

对照样本driver:表达谱背景一致但不含目的基因的总cDNA。

tester与过量的driver杂交，用特定方法将二者共同表达的cDNA去除。

如：抑制性扣除杂交(suppression subtractive hybridization, SSH)原理：含目的基因的cDNA称为供体tester，不含目的基因的cDNA称为驱动driver。

它们是由对应的mDNA组分在体外独立反转录成的。

同时利用识别4个碱基的限制性内切酶RsaΙ将这些cDNA消化成平末端小片段。

将供体一分为二，分别接上二种不同的接头。

第一轮杂交：过量的驱动cDNA分别与带有2中不同接头的供体cDNA杂交，在2个独立的杂交体系中，供体与驱动cDNA会形成4种类型的cDNA片段：a、供体中既没有与供体杂交，也没有与驱动杂交的cDNA分子。

b、供体中自身杂交的cDNA分子。

c、供体与驱动中共同表达的基因杂交形成的双链cDNA分子。

d、驱动中自身杂交和不能自身或与供体杂交的cDNA分子。

第二轮杂交：将第一轮杂交的两个体系混合，再加入过量的驱动cDNA，进入第二轮杂交。

杂交结果进一步形成了a、b、c、d。

也形成了e（带不同接头a形成的）。

将第二轮杂交的产物进行末端补齐，再进行两轮PCR扩增。

在扩增过程中，由于a、d两端没有引物结合位点而不能再扩增。

b两端带有相同的接头序列，形成蜗柄结构，不能进行指数扩增。

c 只有一个引物接头，只能被线性扩增。

只有e是均一化的，差异表达的基因。

用巢式引物进行第二轮PCR，降低PCA产物的背景，富集差异的基因。

最后将PCR产物用T/A克隆载体进行克隆构建扣除杂交cDNA文库3、烟草酸性焦磷酸酶法构建全长cDNA文库原理：烟草酸性焦磷酸酶（TAP），能特异性地识别真核生物mRNA的5’端帽子结构并将其去除。

暴露出切口5’端的磷酸基团，可在该切口处连接一段特异的接头来引导cDNA第二链的合成。

①在反转录合成第一链前对mRNA进行去磷酸化处理，使不完整的mRNA分子暴露的5’磷酸基团被去掉。

②在反应中加入TAP，特意的去掉完整mRNA分子5’末端的帽子结构，暴露出5’磷酸基团。