(附具体方法)基因工程菌质粒(遗传)稳定性--原创
基因工程菌质粒的稳定性
四、提高质粒稳定性的措施
1．选择合适的宿主菌和合适的载体 （1）宿主菌
（2）载体
大肠杆 菌
酵母菌
四、提高质粒稳定性的措施
2．选择适宜的培养方式
（1）两步发酵方式：生长阶段外源基因表达阶段 （2）控制基因过量表达
3．控制合适的培养条件 （1）施加选择压力 （2）培养基组成：限制培养基比丰富培养基更有 利于稳定 （3）培养温度： 较低的培养温度有利于重组质粒 的稳定
4．采用固定化技术
1. 质粒的不稳定性有哪几种表现？ 2. 质粒不稳定性产生的机制有哪些？ 3. 影响质粒不稳定性的因素有哪些？ 4. 如何提高质粒的稳定性？
课程名称:生物工艺学
基因工程菌质粒的稳定性
1 质粒不稳定的表现 2 质粒不稳定性的产生机制 3 影响质粒稳定性的因素 4 提高质粒稳定性的措施
一、质粒不稳定的表现
n 质粒丢失：脱落性不稳定
由环境因素或生理、遗传学原因，质粒从宿主中 丢失，丢失率因环境、宿主、质粒结构而不同。
n 质粒的基因结构突变：结构不稳定性
在pH为6．0时，基因工程酵母表达乙肝表面抗原的质粒最稳定， 在pH值为5.0时，质粒最不稳定。
设法控制pH值在合适范围内，确保质粒的稳定性。
（3)溶解氧和搅拌
当溶解氧浓度在培养基中周期变化时，连续培养酵母的质粒稳 定性强烈依赖于生长速率，在较低生长速率下完全稳定。
增加氧浓度能引起细胞内氧化性胁迫，稳定阶段缺氧限制产物 的形成和质粒稳定性。
在不同培养基中基因工程菌，还存在质 粒丢失概率的差异；比生长速率也不同。
2．发酵操作方式
n 流加操作方式 n 两段连续培养 n 固定化后
细胞
凝胶网 格载体
半透膜 胶囊ຫໍສະໝຸດ 3．发酵培养条件（1）温度
基因工程菌培养及其不稳定性
5. 搅拌器转速和通气应适当
6. 空气过滤系统要采用活性碳和玻璃纤维棉材料
7. 培养液要经化学处理或热处理后才可排放
8. 发酵罐的排气口须有蒸汽灭菌或微孔滤器除菌后才将废气放出。
9. 轴封可采用磁力搅拌或双端面密封
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中，大量乙酸在透析器中透过半透膜，降低培养基中的乙酸浓度，并
可通过在透析液中补充养分而维持较合适的基质浓度，从而获得高密
度菌体。
膜的种类、孔径、面积，发酵液和透析液的比例，透析液的组成
循环流速，开始透析的时间、透析培养的持续时间段都对产物的产率
有影响。
27
一、基因工程菌的培养方式
5. 固定化培养
基因工程菌培养的一大难题是如何维持质粒的稳定性。 有人将固定化技术应用到这一领域，发现基因工程菌经固定化 后，质粒的稳定性大大提高，便于进行连续培养，特别对分泌型菌 更为有利。 由于这一优点，基因工程菌固定化培养研究已得到迅速开展。
提高发酵罐的供氧能力。
有些含质粒的菌对发酵环境的改变比不含质粒的菌反应慢，因
而采用间隙改变培养条件的方法以改变这两种菌的比生长速率，从
而改善质粒的稳定性。通过间隙供氧的方法和通过改变稀释速率的
方法都可提高质粒的稳定性。
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提高基因工程菌稳定性的方法
5. 控制培养条件
pH pH 影响重组菌的稳定性。
5. 控制培养条件
限制性基质
一般培养基中各成分并不是完全平衡的，经过一段时间的培养， 微生物的生长通常会受到一种或几种物质的限制。
限制性基质的种类对重组菌有不同的影响
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提高基因工程菌稳定性的方法
5. 控制培养条件
溶解氧
在基因重组菌的高密度培养时，为了ห้องสมุดไป่ตู้持所需的溶氧水平，除
工程菌的高效表达及稳定性
固定化细胞的制备方法
常用的有吸附法、包埋法、共价结合法、交
联法、多孔物质包络法、超过滤法等，其中
包埋法最为普遍。
2.选择合适的载体
改造、构建能稳定表达的质粒载体是构建工程菌的重要一环。针对不同的载体及 不同的目的采取不同的策略。 3.选择压力 从遗传学来说，选择意味着利用某些生长条件使得只有那些具有一定遗传特性 的细胞才能够生长。
4.分段控制培养 提高质粒稳定性的目的是为了提高克隆菌的发酵生产率，但外源基因表达水平越 高，重组质粒往往越不稳定。 可采用两阶段培养法，即在发酵前期控制外源基因不过量表达，使重组质粒稳 定地遗传；到后期通过提高质粒的拷贝数或转录、翻译效率使外源基因高效表 达。
6.固定化 固定化技术包括固定化酶技术与固定化微生物技术。固定化微生物技术是用化学 或物理手段将游离微生物定位于限定的空间区域,以提高微生物细胞的浓度,使其 保持较高的生物活性并反复利用的方法。
良好固定化细胞方法的条件：
1）应该能够控制固定化细胞的大小和空隙度； 2）原料易得、成本较低，方法简便、易行，载体对细胞是惰 性的，固定过程温和，对细胞损伤轻；
（4） 原核基因不含内含子（intron），没有转录 后加工过程。 （5） 原核生物基因表达的控制主要是在转录水平。 对RNA合成的调控有两种方式：启始控制（启动子 控制）和终止控制（衰减子控制）。 （6） 在大肠杆菌mRNA的核糖体结合位点上，有 一个转译启始密码子及同16S核糖体RNA3‘末端碱 基互补的序列，即SD序列，真核基因则无此序列。
分泌到培养基中，提纯工艺简单，成本低。
影响工程菌发酵的原因
对发酵影响较大的几个因素有： 培养基的影响；接种量的影响；温度的影响； 溶解氧的影响；诱导时机的影响；诱导表达程 序的影响；pH的影响。
基因工程菌的稳定性
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发酵罐的组成有：
发酵罐体、保证高传质作用的搅 拌器、精细的温度控制和灭菌系 统、空气无菌过滤装置、残留气 体处理装置、参数测量与控制系 统、培养液配制和连续操作系统。
对发酵罐要求： 提供菌体生长最适生长条件， 培养过程不得污染， 保证纯菌培养， 培养及消毒过程不得游离异物， 不能干扰细菌代谢活动等。
温度还影响蛋白质的活性和包 含体的形成。
⒋ 溶解氧的影响
对于好氧发酵,溶解氧浓度是重 要的参数。
好氧微生物利用溶解于培养液 中的氧气进行呼吸。
若能提高溶氧速度和氧的利用 率，则能提高发酵产率。
发酵时，随DO2浓度的下降， 细胞生长减慢，ST值下降，发酵后 期下降幅度更大。
外源基因的高效表达需要大量 的能量，促进细胞的呼吸作用，提 高对氧的需求。
第五节 基因工程菌的 稳定性
基因工程菌在传代过程中常 出现质粒不稳定的现象。
质粒不稳定可分为： 分裂不稳定 结构不稳定
分裂不稳定：指工程菌分裂时出现一 定比例不含质粒子代菌的现象。
结构不稳定：指外源基因从质粒上丢 失或碱基重排、缺失所致工程菌性 能的改变
基因工程菌的不稳定性
• 工程菌的培养一般分为2个阶段： （1）第一阶段----先使菌体生长至一定密度。 （2）第二阶段----开始诱导外源基因的表达。
• 由于第一阶段外源基因没有表达，减少了 丢失质粒的细菌的产生概率，也就增加了
工程菌的稳定性。
• 因为丢失质 粒的细菌在 含的抗生素 的培养基环 境中是不能 正常生长的。
（2）然后随机挑选100个菌落，接种到含有 抗生素标记的平板培养基上，培养10-12小 时，统计所长出的菌落数B；
（3）计算出B/A的比值。该比值能够反映出 质粒的稳定性。
• 因为丢失质粒的细菌在含的抗生素的培养 基环境中是不能正常生长的。
பைடு நூலகம்
二、提高质粒稳定性的方法
1、分阶段培养法 2、在培养基中加入抗生素，形成选择性压力 3、通过温度、PH值、培养基组分、溶解氧
• 含高拷贝质粒的工程菌产生不含质粒子代 菌的频率较低，但是大量外源质粒的存在 使含质粒菌的工程菌的比生长速率明显低 于不含质粒菌，而不含质粒菌一旦产生， 能较快地取代含质粒菌而成为优势菌，对 质粒的稳定性不利。
质粒稳定性的分析方法
（1）将工程菌培养液样品适当稀释，均匀涂 于不含抗生素标记的平板培养基上，培养 10-12小时，统计所长出的菌落数A；
• 所以可以通 过加入抗生 素来抑制质 粒丢失的细 菌的生长。
• 通过温度、PH值、培养基组分、溶解氧的 综合调节措施
• 通过以下方法可以提高质粒的稳定性。
（1）间歇送氧 （2）改变稀释速率
基因工程菌的不稳定性
一、质粒不稳定产生的原因 分裂不稳定：指工程菌分裂时出现一定比 例不含质粒子代菌的现象。(常见) 结构不稳定：指外源基因从质粒上丢失或 碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变
3.2第三章_基因工程菌的稳定性_生物制药
遗传特性
载体的选择 宿主的选择 外源基因整合到宿主染色体上 培养基 生长速率 限制性基质 温度 pH 和溶氧 外源基因表达
发酵工艺
改进载体受体系统 以增加质粒稳定性为目的的构建方法包括：
1.将 R1 质粒上的 parB 基因引入表达型载体中 其表达产物可以选择性地杀死由于分配不均匀所产生的无质粒细胞 2.正确设置载体上的多克隆位点 禁止 DNA 片段插在稳定区内 3.将受体细胞的致死性基因安装在载体上 同时构建条件致死性的相应受体系统，如大肠杆菌的 ssb 基因
的稳定性，在第二级进行表达。
提高基因工程菌稳定性的策略
控制目的基因的过量表达
使用可控型启动子控制目的基因的定时表达及表达程度
使用可控型复制子控制质粒的定时增殖或降低质粒的拷贝数
优化基因工程菌的培养工艺
培养基组成：限制培养基比丰富培养基更有利于稳定
培养温度： 较低的培养温度有利于重组质粒的稳定
提高基因工程菌稳定性的策略
分批培养中选用不同的碳源、补料培养中控制补料速度、 连续培养中控制稀释速率等培养方法，都能在一定范围内控 制菌体的生长，从而控制乙酸的产生，减少它的抑制作用， 以实现工程菌的高密度培养和提高重组产物的表达水平。 实质：控制菌体的糖酵解速度，使之低于三羧酸循环和 呼吸链的最大代谢能力，从而避免乙酰辅酶A的积累和乙酸的 产生，以降低供能速度或前体供应速度来降低蛋白合成和菌 体生长速度。
连续培养：
连续培养是将种子接入发酵反应器中，搅拌培养至菌体浓度达到一定程度 后，开动进料和出料蠕动泵，以一定稀释率进行不间断培养。
连续培养可以为微生物提供恒定的生活环境，控制其比生长速率，为研究
基因工程菌的发酵动力学、生理生化特性、环境因素对基因表达的影响等创造了 良好的条件。 但是由于基因工程菌的不稳定性，连续培养比较困难。为了解决这一问 题，人们将工程菌的生长阶段和基因表达阶段分开，进行两阶段连续培养。在这
关于基因工程菌的稳定性
关于基因工程菌的稳定性摘要：研究了定态与周期操作对基因工程酒精酵母质粒稳定性的影响,周期操作有利于提高底物的利用率并增强质粒的稳定性；发现了固定化重组菌高稳定性的原因，另外还讨论了诸多培养条件对基因工程菌稳定性的影响。
关键字：固定化；基因工程菌；质粒；稳定性；基因工程基因工程菌就是将目的基因导入细菌体内使其表达，产生所需要的蛋白的细菌成为基因工程菌。
基因工程菌在传代过程中常出现质粒不稳定的现象。
质粒不稳定可分为：分裂不稳定和结构不稳定。
分裂不稳定：指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒子代菌的现象。
结构不稳定：指外源基因从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变。
1 常见分裂不稳定的两个因素：1.1 含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率；1.2 这两种菌比数率差异的大小。
2 提高质粒稳定性的方法2.1 选择合适的宿主菌；2.2 选择合适的载体，适当增加质粒拷贝数；2.3 加入选择性压力；2.4 采用两阶段培养法；先使菌体生长至一定密度，再诱导外源基因的表达。
由于第一阶段外源基因未表达，减小了重组菌与质粒丢失菌的生长速率的差别，增加了质粒稳定性。
在培养基中加入抗菌素抑制质粒丢失菌的生长，提高质粒稳定性。
调控环境参数如温度、pH、培养基组分和溶解氧浓度。
有些含质粒菌对发酵环境的改变比不含质粒菌反应慢，间歇改变培养条件以改变两种菌比生长速率，可改善质粒稳定性。
通过间歇供氧和改变稀释数率，都可以提高质粒稳定性。
2.5 控制工程菌的培养条件；2.6 采用固定化培养基因工程技术是生物技术的核心和关键,已成功地表达了一系列与人类健康有关的重要多肽物质以及使多种氨基酸和抗生素增产,对人类社会生活产生了深远的影响。
基因工程菌中质粒稳定性问题是影响基因工程菌实现规模生产的一个重要因素,这种不稳定性主要表现为两种形式:一种是重组ＤＮＡ质粒的丢失,称为脱落性不稳定;另一种是质粒中的基因结构发生突变,称为结构性不稳定。
这两种不稳定都能使细胞失去生产能力。
第三章基因工程制下
质粒稳定性的分析方法： 10~
工程菌
稀释
涂布不含抗 12h 性平板
10~1
含抗性的 2h 平板
菌落计数
接种 随机挑取 100个菌落
在基础培养基中加入氨基酸能使菌体比生长速率提高， 蛋白合成增加。
第七节 基因工程菌发酵
一、基因工程菌的培养方式
1.补料分批培养:为保持基因工程菌生长所需的良好微环境， 延长生长对数期，获得高密度菌体，间歇连续地补加新鲜 培养基，使菌体进一步生长的方法。
2.连续培养：由于基因工程菌的不稳定性，连续培养很难 做到。 3.透析培养：将培养基用半透膜进行透析，去除其中对菌 生长有抑制的物质。
第五节 基因工程菌的稳定性
基因工程菌在传代过程中会出现质粒不稳定现象，包括分裂不 稳定和结构不稳定。
质粒不稳定产生的原因： 1.含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率 2.含质粒和不含质粒菌的比生长速率差异的大小 3. 细胞中所含质粒载体的拷贝数： 拷贝数差别不大时，质粒载 体相对地稳定；拷贝数相差悬殊，则很容易造成一些细胞丢失 质粒，并逐渐发展为优势群体。 4.宿主细胞DNA重组系统的作用： 质粒载体之间发生重组会形 成二聚体、三聚体，甚至四聚体等所谓的质粒寡聚体，其稳定 性比单体差。质粒载体中外源DNA片段的大小同质粒寡聚化的 程度也密切相关 5.质粒的拷贝数除与工程菌本身的特性有关外，还与培养条件 有关。
当菌体生长所需能量大于菌体有氧代谢所能提供的能 量时，菌体常会产生乙酸，乙酸会对菌体的生长起抑 制作用。乙酸的产生是因为供能不足，菌体将乙酰辅 酶A转变为乙酰来供能。
基因工程菌中重组质粒的稳定性研究进展_肖硕
重组质粒的不稳定性， 是指重组菌在培养过程 中发生突变或丢失， 结果使重组菌失去了原有的表 型特征。依据重组质粒的变化本质， 质粒不稳定性 可 分 为 结 构 不 稳 定 性 、分 离 不 稳 定 性 。 质 粒 的 结 构 不 稳 定 主 要 是 由 于 ＤＮＡ 的 插 入 、 缺 失 或 重 排 等 引 起的不稳定， 使目的基因功能丢失， 但对质粒主要
Ａｂｓ ｔｒａ ｃｔ： Ｒ ｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｉｓ ｓｕｂｍｉｎｉａｔｕｒｅ ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ ｉｎ ｍｏｄｅｒｎ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ ｏｎｅ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐａｌ ｐａｒｔ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｔｏ ｏｂｔａｉｎ ｓｔｅａｄｙ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｇｅｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔ ｉｓ ｔｈｅ ｈａｒｄ ｃｏｒｅ ｓｔｅｐ ａｎｄ ｆｉｎａｌ ａｉｍ． Ｐｌａｓｍｉｄ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｉｓ ｔｈｅ ｍｏｓｔ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｐｒｏｂｌｅｍ ｏｆ ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌｉｚｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｒｅｓｅａｒｃｈ． Ｔｈｅ ａｒｔｉｃｌｅ ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ ａｎｄ Ｓｕｍｍａｒｉｚｅｄ ｉｔｓ ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ， ｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇ ｆａｃｔｏｒｓ， ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ．
低 影 响 质 粒 稳 定 性 及 人 类 特 异 性 免 疫 反 应 的 降 低 ［７］。 ２．３ 调 控 突 变 、培 养 条 件 等
外 源 基 因 的 调 控 突 变 、培 养 条 件 及 质 粒 中 所 携 带 的 外 源 基 因 性 质 、重 组 菌 的 生 长 速 率 、外 源 基 因 的表达水平等因素都是影响质粒稳定性的因素， 有 些需要在质粒设计和构建时仔细考虑， 有些则与培 养过程有关。
(附具体方法)基因工程菌质粒(遗传)稳定性--原创
质粒遗传稳定性目前没有明确的规定，但一般用斜面传代法，一定数量点接抗性和非抗性板，生长计数（主要证明分裂稳定性）；更严谨时，可进一步双酶切、测序等验证（证明结构稳定性--国家药品监督管理局的新生物制品审批）。
工业用菌确实存在很多问题，免不了质粒丢失严重，高突变等现象，但是一般工业用菌都是经过10代以上稳定筛选之后才用于小试、中试和工业生产的。
菌体不稳定造可能成的损失巨大，所以鲜有工业用菌使用在2-3代菌就没有产量或者产量低的菌株。
一般来说，一代菌用一点少一点，一代菌上罐太伤了，工业用菌一般会存储足够量的二代菌（多数是冷冻干燥安瓿管）用于生产，在生产中需要活化、制作摇瓶种子，如果菌体生长慢，还要进一步做种子罐，最后才能用于生产。
如果菌体稳定性差，几代传下来，发酵的不稳定造成损失是很难估计的，而且一般不稳定菌都是先做小试、中试，成功后才能用于生产。
质粒在宿主中的稳定性确实需要进行筛选，实验中遇到的质粒突变能避免尽量避免，做好的质粒也不一定一直存放，由于不断的被用于各种改进实验，期间经过的大量筛选，避免了一代菌用完之后就没有更好的使用。
使用高保真酶扩增、保证没有物理化学因素促变，使用合适的宿主，还是很容易得到没有突变的质粒的，后续连续传代培养也可以得到比较稳定的质粒的。
质粒不稳定是重组基因工程菌培养过程中的常见问题，也是影响外源基因高效表达的限制因素之一[77~78]。
Koch[79]最早对外源基因引入宿主而对细胞产生的代谢负荷进行考察，研究表明质粒的大小、拷贝数，质粒的维持，抗性基因的表达，培养环境的变化，都会对宿主细胞产生代谢负荷，当供氧不足或营养物质受限制时，代谢负荷对细胞生长的影响会更加明显。
基因工程菌中质粒稳定性问题是影响基因工程菌实现规模生产的一个重要因素,这种不稳定性主要表现为两种形式: 一种是重组DNA 质粒的丢失, 称为脱落性不稳定; 另一种是质粒中的基因结构发生突变, 称为结构性不稳定。
工程菌的高效表达与稳定性
农杆菌
• 选择合适的宿主菌或质粒
(1)选择合适的宿主菌
重组质粒的稳定性在很大程度上受宿主 细胞遗传特性的影响。相对而言，重组 质粒在大肠杆菌中比较稳定，在枯草杆 菌和酵母中较不稳定，但是也有例外。
(2)质粒的选择
• 为了构建稳定的结构体，最好利用小的 质粒，小的质粒在高密度发酵中遗传性 状比较稳定，而大的质粒往往由于发酵 环境中各种因素的影响，而出现变异的 几率较高。
3.表达产物的稳定性
• 外源基因在大肠杆菌中表达，表达产物 对宿主菌而言，是异物，所以大肠杆菌 体内常会产生一些蛋白，消化表达产物
• 提高产物稳定性的方法： 采用融合表达， 分泌表达， 点突变 （改变外源蛋白的酶切识别位点）， 选 用蛋白酶缺陷型的宿主菌
4.细胞的代谢负荷
• 大量复制质粒和表达外源基因，会破坏 宿主菌原有的代谢平衡，降低目的蛋白 的产生和回收量
（5）稀有密码子
1. 可以共表达编码tRNArg （AGG/AGA）的argU（DNAy）基 因，使外源蛋白得到高效表达。
2. 可以在不改变蛋白质的氨基酸序列下 改造碱基序列，使密码子尽量满足宿 主菌较高使用率的密码子。
3. 可以选择表达低利用率的稀有密码子 的宿主细胞，如Rosetta(DE3)做宿 主。
工程菌的高效表达与稳定性
主要内容：
• 工程菌的稳定性 • 重组蛋白高表达策略
一、 工程菌的稳定性
• 工程菌的不稳定性大多数是由于质粒不 稳定造成的
• 质粒的不稳定分为
1. 分裂不稳定 :工程菌分裂时出现一定比例 不含质粒子代菌的现象（常见）
2. 结构不稳定 : 指外源基因从质粒上丢失 或碱基重排、缺失而导致工程菌性能的 改变
生物工艺学课件 基因工程菌的稳定性问题
第七章基因工程菌发酵第二节工程菌的稳定性问题近年来，重组DNA技术（基因工程）已开始由实验室走向工业生产。
现在，由工程菌产生的珍稀药物如：胰岛素、干扰素、人生长激素、乙肝表面抗原等等都已先后供应市场，基因工程不仅保证了这些药物的来源，而且可使成本大大下降，但是从许多研究中发现，工程菌的保存过程中及发酵生产过程中表现出不稳定性，因而工程菌的稳定性的解决已日益受到重视并成为基因工程这一高技术的成就转变为生产力的关键之一。
一、工程菌不稳定性的表现（倾向）工程菌的不稳定实际上包括质粒的不稳定及其表达产物的不稳定两个方面。
具体表现为下列三种形式：质粒的丢失；重组质粒发生DNA片段脱落；表达产物不稳定。
由于某种环境因素或生理、遗传学上的原因，质粒从某些宿主细胞中丢失（消除curing），丢失率因环境、宿主、质粒结构而有不同。
由于质粒的丢失，工程菌的发酵过程实际上是两种菌的混合物。
在非选择性条件下，含有重组质粒的工程菌的比生长速率（μ+）往往小于不含重组质粒的比生长速率（μ-）。
宿主细胞的生长优势对工程菌的发酵极为不利。
有时质粒不稳定并非由于质粒丢失的缘故，而是重组质粒上一部分片段脱落，表现为质粒变小或某些遗传信息发生变化甚至丧失。
表达产物不稳定也是一个很重要的问题。
发现人干扰素工程菌在表达干扰素时，随着培养时间的延长，干扰素活性反而下降。
这种情况在别的工程菌培养过程中也有发现。
二、引起工程菌不稳定性的一些因素及对策组建成的工程菌的稳定与否，取决于重组质粒本身的分子组成、宿主细胞生理和遗传性及环境条件等三个方面。
就质粒本身的分子结构而言，引起工程菌不稳定常常是由于稳定区受到影响。
某些质粒如PSC101、R1、F等的分配系统在质粒上的位置已经确定，质粒col DF13有两个DNA序列part A, part B对它的稳定起着不可缺少的作用。
枯草杆菌质粒pUB110上几个与膜结合的蛋白基因对稳定性有关。
如质粒在重组过程中影响到这些序列的完整性，则其稳定性也受影响，另外可能由于重组质粒上有重复序列，或与宿主染色体有部分同源等等都会造成质粒的不稳定。
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质粒遗传稳定性目前没有明确的规定，但一般用斜面传代法，一定数量点接抗性和非抗性板，生长计数（主要证明分裂稳定性）；更严谨时，可进一步双酶切、测序等验证（证明结构稳定性--国家药品监督管理局的新生物制品审批）。
工业用菌确实存在很多问题，免不了质粒丢失严重，高突变等现象，但是一般工业用菌都是经过10代以上稳定筛选之后才用于小试、中试和工业生产的。
菌体不稳定造可能成的损失巨大，所以鲜有工业用菌使用在2-3代菌就没有产量或者产量低的菌株。
一般来说，一代菌用一点少一点，一代菌上罐太伤了，工业用菌一般会存储足够量的二代菌（多数是冷冻干燥安瓿管）用于生产，在生产中需要活化、制作摇瓶种子，如果菌体生长慢，还要进一步做种子罐，最后才能用于生产。
如果菌体稳定性差，几代传下来，发酵的不稳定造成损失是很难估计的，而且一般不稳定菌都是先做小试、中试，成功后才能用于生产。
质粒在宿主中的稳定性确实需要进行筛选，实验中遇到的质粒突变能避免尽量避免，做好的质粒也不一定一直存放，由于不断的被用于各种改进实验，期间经过的大量筛选，避免了一代菌用完之后就没有更好的使用。
使用高保真酶扩增、保证没有物理化学因素促变，使用合适的宿主，还是很容易得到没有突变的质粒的，后续连续传代培养也可以得到比较稳定的质粒的。
质粒不稳定是重组基因工程菌培养过程中的常见问题，也是影响外源基因高效表达的限制因素之一[77~78]。
Koch[79]最早对外源基因引入宿主而对细胞产生的代谢负荷进行考察，研究表明质粒的大小、拷贝数，质粒的维持，抗性基因的表达，培养环境的变化，都会对宿主细胞产生代谢负荷，当供氧不足或营养物质受限制时，代谢负荷对细胞生长的影响会更加明显。
基因工程菌中质粒稳定性问题是影响基因工程菌实现规模生产的一个重要因素,这种不稳定性主要表现为两种形式: 一种是重组DNA 质粒的丢失, 称为脱落性不稳定; 另一种是质粒中的基因结构发生突变, 称为结构性不稳定。
这两种不稳定都能使细胞失去生产能力。
质粒的稳定性与宿主及载体的特性有关, 也与培养条件有密切的关系。
试验一：遗传稳定性验证（斜面活化代时）
连续传代实验：将构建好的四个质粒pBES、pBEF、pBESF和pBEG分别转化进入B. amyloliquefaciens TA208，取工程菌的培养液梯度稀释到合适浓度，涂布于LB（+）（含10 μg/mL 卡那霉素）平板，37 ℃培养16 h后随机挑取50个单菌落，同一菌落分别接种于LB（+）和LB（–）（不含卡那霉素）上，于37 ℃培养16 h（第1代）。
将LB（+）上的菌落接种于LB（+）平板上，LB（–）上的菌落接种于LB（–）平板上，于37 ℃培养16 h（称为第2代）。
依此进行连续转接50次，分别计算两个平板上菌落生长数。
平板传代稳定性实验：在传代过程中，每隔5- 10代将LB（–）平板上的菌落接种于LB（+）平板上，菌落计数，计算该基因工程菌在无选择压力下的遗传稳定性。
将各基因工程菌株分别在LB（+）和LB（-）上连续传代培养，在传代过程中LB（+）上的菌株长势都非常好，说明在抗生素压力下，菌株稳定性良好，未发生质粒丢失情况。
但在无抗生素压力下，如图3-11所示LB（-）上生长的50 个单菌在连续传代过程中，传代30次左右质粒开始丢失，到第50代18 % 的菌落质粒已经丢失，并且各工程菌株的质粒稳定性没有显著性差异。
说明工程菌株遗传稳定性一般，需要在传代及培养过程中加入抗生素，这对工业化生产和菌种保
藏均有重要意义。
图3-11 重组菌株的遗传稳定性测定
Fig. 3-11 The test of heredity stability of recombinant strains
试验二：质粒稳定性研究（分裂代时）
段取样涂布，挑单*50，分别接抗性与非抗性板，计算；同时转接至下一时间段。
）结果如图3‐25所示：
图3-25 质粒稳定性研究
Fig. 3-25 The plasmid stability test
摇瓶发酵培养30 h，约有10%的菌株丢失质粒；培养至50 h，质粒丢失率约为15%，且质粒pXMJ19和pXMJ19‐ilvA( F383V)的稳定性差异不大，说明ilv A (F383V)基因的插入不会影响质粒pXMJ19的稳定性。
同时在发酵生长期？？质粒的丢失率高于中后期，推测分裂不稳定是此质粒丢失的主要原因。