ssr变性非变性胶配制
SSR分析的原理及操作技术
▪ 银染法（硝酸银）：是一种检测微量DNA的理想方法。
优点：经济、简便、快速、灵敏，无污染、分辨率高、结果可永 久保存
原理：银染液中的银离子(Ag+)可与DNA形成稳定的复合物，然后 用还原剂如甲醛在碱性条件下使Ag+还原成银颗粒，可把DNA 电泳带染色成黑褐色
7.染色
步骤 漂洗30s 染色8min 漂洗30s
显色4min
漂洗
试剂 ddH2O 0.1％硝酸银400ml ddH2O 8g NaOH，2ml 37％甲醛，0.1g四 硼酸钠定容至500ml ddH2O
8.观察
▪ 记录父母本及F1代的带型，供进一步的 分析用。
40％丙稀酰胺溶液（19：1） 丙稀酰胺（Acrylamide）
甲义-丙稀酰胺（Bis-Acrylamide）
100ml 38g 2g
5.电泳样品的准备：在PCR产物中加入8µL的loading buffer混合，得 到混合物，95℃加热3min，迅速置于冰上冷却，然后点样。
Loadingbuffer组分
▪ 这些网格孔径的平均直径决定于丙烯酰胺和双功能交联剂 的浓度。
聚丙烯酰胺凝胶
▪ 变性聚丙烯酰胺凝胶
用于单链DNA片断的分离与纯化。这些凝胶在尿素或甲酰胺等抑制核 酸碱基配对的试剂的存在下发生聚合。变性的DNA在这些凝胶中的迁 移率几乎与其碱基组成及序列完全无关。
▪ 非变性聚丙烯酰胺凝胶
用于双链DNA片段的分离和纯化。双链DNA在非变性聚丙烯酰胺凝胶 中的迁移率通常与其大小的常用对数值成反比。然而，电泳迁移率也受 其碱基组成和序列的影响，因此，大小完全相同的两条DNA的迁移率 可相差10％。非变性聚丙烯酰胺凝胶主要用于制备高纯度的DNA片段 和检测蛋白质－DNA复合物。
SSR的检测
SSR的检测1.PCR反应后SSR的变性：将PCR反应后的SSR材料每管加上8µl Loading Buffer（在PCR板上），置于PCR 仪中变性10min，取出，放入冰水混合物中冷却。
冷却后放入4℃冰箱里保存，待用。
2.制备聚丙烯酰胺变性凝胶电泳板：A.取大板，用水刷净（如果是用过的大板，表面有胶，则应用水浸泡，用小铲子铲去胶面，再用钢丝球擦去残余的胶，清水冲净），置于灌胶台面上的泡沫板上。
用洗瓶加少量的无水乙醇，拿卫生纸擦涂干净（这个过程避免橡胶手套碰到玻璃板）。
用2ml的离心管装1.9ml左右的无水乙醇，再各加9µl醋酸、Binding，摇匀，倒在玻璃板上，用卫生纸均匀涂抹，边缘要用力涂抹，以防止脱胶。
放上干净的边条，下端对齐，待用。
B.耳朵板的准备：将耳朵板放在通风橱内，用无水乙醇擦洗干净，再用2％的Repel（取少许）轻轻地均匀擦涂。
待干后，取出，涂Repel面向下，放在大板上，下端对齐，用夹子夹紧，固定好，待用。
C.灌胶：用灌胶瓶装适量的胶，加400µl的APS、40µl的TEMED，摇匀，开始灌胶。
先在灌胶口的一边灌胶，边灌边向另一边移动，待整个灌胶口都注满胶的时候，轻轻抬起灌胶的一端，以便胶液流向下端，同时不断的注入胶液。
在胶液流动缓慢处要轻轻敲打，防止出气泡。
整个操作中，一定要保证灌胶口处不缺胶，防止出现气泡。
待板灌好后，检查灌胶口处是否有气泡，如有，用齿钩子钩出。
D.插梳子：在灌胶口处加一些胶，把梳子放上，梳齿向外，待排除气泡后，从一端开始插入，逐渐把整个梳子插好。
用夹子固定好，待用。
3.上板、电泳：待聚丙烯酰胺胶凝聚后，把夹子拿掉，拔掉梳子，用钢丝球把灌胶口擦洗干净，用水冲洗干净。
然后把梳子刷洗干净，备用。
检查电泳槽的下槽液的量是否缺少；把刷洗好的板放在电泳槽上，灌胶口朝上、向上。
然后固定好玻璃板，平衡拧紧螺丝夹。
加上上槽液，检查是否有漏液。
SSR标记的原理步骤
SSR:微卫星DNA又叫简单重复序列，指的是基因组中由1～6个核苷酸组成的基本单位重复多次构成的一段DNA，广泛分布于基因组的不同位置，长度一般在200bp以下。
研究表明，微卫星在真核生物的基因组中的含量非常丰富，而且常常是随机分布于核DNA中。
微卫星中重复单位的数目存在高度变异，这些变异表现为微卫星数目的整倍性变异或重复单位序列中的序列有可能不完全相同，因而造成多个位点的多态性。
如果能够将这些变异揭示出来，就能发现不同的SSR在不同的种甚至不同个体间的多态性，基于这一想法，人们发展起了SSR标记。
SSR标记又称为sequence tagged microsatellite site,简写为STMS，是目前最常用的微卫星标记之一。
由于基因组中某一特定的微卫星的侧翼序列通常都是保守性较强的单一序列，因而可以将微卫星侧翼的DNA片段克隆、测序，然后根据微卫星的侧翼序列就可以人工合成引物进行PCR扩增，从而将单个微卫星位点扩增出来。
由于单个微卫星位点重复单元在数量上的变异，个体的扩增产物在长度上的变化就产生长度的多态性，这一多态性称为简单序列重复长度多态性(SSLP)，每一扩增位点就代表了这一位点的一对等位基因。
由于SSR重复数目变化很大，所以SSR标记能揭示比RFLP高得多的多态性，这就是SSR标记的原理。
? 与其它分子标记相比，SSR标记具有以下优点：(1)数量丰富，覆盖整个基因组，揭示的多态性高；(2)具有多等位基因的特性，提供的信息量高；(3)以孟德尔方式遗传，呈共显性；(4)每个位点由设计的引物顺序决定，便于不同的实验室相互交流合作开发引物。
因而目前该技术已广泛用于遗传图谱的构建〔11，12，18，19，33〕、目标基因的标定〔8，9，21，22，26〕、指纹图〔22〕的绘制等研究中。
但应看到，SSR标记的建立首先要对微卫星侧翼序列进行克隆、测序、人工设计合成引物以及标记的定位、作图等基础性研究，因而其开发费用相当高，各个实验室必须进行合作才能开发更多的标记。
SSR分析的原理及操作技术报告
以单核苷酸多态性为基础的分子标记技术： 单核苷酸多态性（SNP）
SSR简介
在生物的基因组中，特别是高等生物的基因组中含有大量的重复序列，
根据重复序列在基因组中的分布形式可分为： 串联重复序列（Tandemly repeated sequences） 分散重复序列（Interspersed repeated sequences） 依据重复基序的长度、拷贝数和位置等又将串联 重复序列分为： 卫星DNA：基序（motif）长10～300bp，甚至长1,000～100,000bp；
和测序，然后根据两端的侧翼序列设计一对特异引 物，通过PCR技术将目的微卫星DNA片段扩增出来。
SSR标记的基本原理
由于单个微卫星位点的重复单元在数量上的不同，导致扩
增产物在长度上发生变化，即产生长度多态性，这种多态 性称为简单序列长度多态性(simple sequence length polymorphism，SSLP)，每一扩增位点就代表了该位点的 一对等位基因。
0.1％硝酸银400ml
ddH2O 8g NaOH，2ml 37％甲醛，0.1g四硼 酸钠定容至500ml
漂洗
ddH2O
8.观察 记录父母本及F1代的带型，供进一步的 分析用。
4.制备5％的变性聚丙烯酰胺凝胶：
将长、短玻璃板固定在制胶板上，用1.0％的琼脂糖封口，将配好
的胶溶液沿玻璃板点样端小心灌入，排除气泡，待胶灌满后插入梳 子，静置1h，让其聚合凝固。
5％变性胶 尿素 （Urea） 5×TBE buffer 40％丙稀酰胺 10％过硫酸铵 TEMED 40％丙稀酰胺溶液（19：1） 丙稀酰胺（Acrylamide） 甲义-丙稀酰胺（Bis-Acrylamide） 100ml 42g 20ml 12.5ml 400µl 87.5µl 100ml 38g 2g
SSR标记电泳
3.1.2.4 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳扩增产物用聚丙烯酰胺凝胶分离可以达到几个碱基，以便真实的反应各样品的多态性，本实验采用用8％的非变性聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳分离。
3.1.2.4.1 凝胶的制备（1）玻璃板的清洗：用洗涤灵或洗衣粉把玻璃板反复擦洗干净，用蒸馏水冲洗干净，放置干燥，备用。
（2）电泳凝胶的配制（常用6％和8％的非变性凝胶）：（4）按表4中顺序加入各组分（注意：TEMED一定要最后加入），充分摇匀后用注射器将配好的胶轻轻灌入好两玻璃板之间，当胶加到上部时，在灌胶口插入梳子，并注意防止梳子底部产生气泡。
若有漏出，应及时补加聚丙烯酰胺溶液。
置室温让其聚合1h以上。
3.1.2.4.2 扩增产物的电泳（1）电泳缓冲液：待凝胶聚合完后，在电泳槽中加入1×TBE（用5×TBE稀释）的电泳缓冲液。
（2）上样：1.5-2μl，用移液枪吸取混合液轻轻加入点样孔中，尽量缩短加样时间。
（3）电泳：将梳子轻轻拔出，170V预电泳1.5-2小时(50bp左右的用1个半小时）。
电泳结束后，切断电源，卸下玻璃板，准备染色。
3.1.4.2.3 扩增产物的快速银染显色非变性聚丙烯酰胺电泳的银染方法参考Sanguinetti等1994并经改进简化如下：（1）漂洗：在塑料盘中加入200ml蒸馏水漂洗1次，再加入200ml蒸馏水。
染色：加入2ml 10％AgNO3 (10g AgNO3加入到100ml蒸馏水中)后，平行摇动5～8min。
（2）漂洗：倒掉定影液，加入蒸馏水漂洗2～3次，洗净后，倒掉蒸馏水。
（3）显色：在瓷盘中加入200ml蒸馏水，10ml 30%NAOH和2ml甲醛，迅速振动，使显影液均匀作用，然后平行摇动10分钟左右，直至显影。
（4）洗涤：清楚显影后，倒掉显影液，加入蒸馏水清洗凝胶1～2次，彻底去掉显影液，以免保存时变色。
（5）保存：用蒸馏水冲洗干净，放在胶片上吸干水，上面盖上保鲜膜，统计带型，并照相或扫描。
SSR技术原理-方法及步骤
SSR技术1. SSR简介说明：简单重复序列(Simple Sequence Repeat，SSR)，简单重复序(SSR)也称微卫星DNA，其串联重复的核心序列为1-6 bp，其中最常见是双核苷酸重复，即(CA) n和(TG) n每个微卫星DNA的核心序列结构相同，重复单位数目10-60个，其高度多态性主要来源于串联数目的不同。
SSR标记的基本原理：根据微卫星序列两端互补序列设计引物，通过PCR反应扩增微卫星片段，由于核心序列串联重复数目不同，因而能够用PCR的方法扩增出不同长度的PCR 产物，将扩增产物进行凝胶电泳，根据分离片段的大小决定基因型并计算等位基因频率。
在真核生物中，存在许多2-5bp简单重复序列，称为“微卫星DNA”其两端的序列高度保守，可设计双引物进行PCR扩增，揭示其多态性。
SSR具有以下一些优点：(l)一般检测到的是一个单一的多等位基因位点；(2)微卫星呈共显性遗传，故可鉴别杂合子和纯合子；(3)所需DNA量少。
显然，在采用SSR技术分析微卫星DNA多态性时必须知道重复序列两端的DNA序列的信息。
如不能直接从DNA数据库查寻则首先必须对其进行测序。
SSR的分类：根据SSR核心序列排列方式的不同，可分为3种类型：1）完全型(perfect)，指核心序列以不间断的重复方式首尾相连构成的DNA。
如：ATATATATATATATATATATATATATATATATAT；2）不完全型(imperfect)，指在SSR的核心序列之间有3个以下的非重复碱基,但两端的连续重复核心序列重复数大于3 。
如：ATATATATGGATATATATATCGATATATATATATATATGGATATATATAT；3）复合型(compound) ，指2个或2个以上的串联核心序列由3个或3个以上的连续的非重复碱基分隔开,但这种连续性的核心序列重复数不少于5 。
如：ATATATATATATATGGGATATATATATATA 。
蛋白非变性胶详解[最新]
![蛋白非变性胶详解[最新]](https://img.taocdn.com/s3/m/b55dbc6700f69e3143323968011ca300a6c3f621.png)
Native-PAGE原理非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)是在不加入SDS 疏基乙醇等变性剂的条件下，对保持活性的蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于同工酶的鉴定和提纯。
未加SDS的天然聚丙烯酰胺凝胶电泳可以使生物大分子在电泳过程中保持其天然的形状和电荷，它们的分离是依据其电泳迁移率的不同和凝胶的分子筛作用，因而可以得到较高的分辨率，尤其是在电泳分离后仍能保持蛋白质和酶等生物大分子的生物活性，对于生物大分子的鉴定有重要意义，其方法是在凝胶上进行两份相同样品的电泳，电泳后将凝胶切成两半，一半用于活性染色，对某个特定的生物大分子进行鉴定，另一半用于所有样品的染色，以分析样品中各种生物大分子的种类和含量。
实验方法非变性聚丙烯酰胺凝胶和变性sds-page电泳在操作上基本上是相同的，只是非变性聚丙烯酰胺凝胶的配制和电泳缓冲液中不能含有变性剂如SDS等。
一般蛋白进行非变性凝胶电泳要先分清是碱性还是酸性蛋白。
分离碱性蛋白时候，要利用低pH凝胶系统，分离酸性蛋白时候，要利用高pH凝胶系统。
酸性蛋白通常在非变性凝胶电泳中采用的pH是8.8的缓冲系统，蛋白会带负电荷，蛋白会相阳极移动；而碱性蛋白通常电泳是在微酸性环境下进行，蛋白带正电荷，这时候需要将阴极和阳极倒置才可以电泳分离酸性蛋白。
工作液配制1.40%胶贮液(Acr:Bis=29：1）；2.4×分离胶Buf(1.5 M Tris-HCl，pH 8.8)：18.2 g Trisbase 溶于ml 水，用浓HCl调pH 8.8，加水定容到100ml，4℃贮存；3. 4×堆积胶Buf(0.5 M Tris-HCl，pH 6.8)：6g Trisbase 溶于80ml 水，用浓HCl调pH 6.8，加水定容到100ml，4℃贮存；4.10×电泳Buf（pH8.8 Tris-Gly）:30.3 g Trisbase，144g 甘氨酸，加水定容到L，4℃贮存；5.2×溴酚蓝上样Buf:1.25ml pH6.8, 0.5M Tris-Cl，3.0ml甘油，.2ml 0.5% 溴酚蓝，5.5ml dH2O；-20℃贮存；6. 10％APS；7. 0.25％考马斯亮蓝染色液:Coomassie blue R-250 2.5g，甲醇ml，HAc 100ml, dH2O 450ml；8.考马斯亮蓝脱色液:100ml甲醇，100冰醋酸，800ml dH2O电泳胶的配制及电泳条件（上槽电极为负，下槽电极为正）1. 碱性非变性胶17%分离胶(10 ml) 4%堆积胶(5 ml)2. 40%胶贮液(40%T,3.3%C）4.25ml 0.5ml3. 4×分离胶Buf(1.5 M Tris-HCl，pH 8.8)2.5ml4. 4×堆积胶Buf(0.5 M Tris-HCl，pH 6.8) 1.25ml5. 水3.2ml6. 10％APS 35ul7. TEMED 15 ul8. 10×电泳Buf（pH8.8 Tris-Gly）:100ml稀释到L电泳条件:100V恒压约20min，指示剂进入浓缩胶；改换160V恒压，当指示剂移动到胶板底部时，停止电泳，整个过程约80min。
变性与非变性聚丙烯酰胺的区别
非变性和变性聚丙烯酰胺凝胶的区别？“变性”体现在哪里？作者: 墨池(站内联系TA)收录: 2011-07-31 发布: 2011-07-211 非变性和变性聚丙烯酰胺凝胶的区别？“变性”体现在哪里？2 SRAP标记用6%聚丙烯酰胺凝胶电泳，是变性还是非变性？配方是什么？配胶时，过硫酸铵是不是要最后加入？谢谢(*^__^*) 嘻嘻收、蛋白质分子量测定会使用变性PAGE，而DNA跑PAGE通常是采用非变性PAGE，另外回收活性蛋白也有用非变性PAGE的。
2. SRAP（貌似叫什么...相关序列扩增多态性）标记这个应该是非变性PAGE，6%的PAGE胶配方就不用发了吧，google一下一大堆。
TEMED和过硫酸铵都是最Originally posted by holyala at 2011-07-21 2121:1. 变性胶加尿素或者其他变性剂，非变性胶是不加的。
一般做RNA分离或回收、蛋白质分子量测定会使用变性PAGE，而DNA跑PAGE通常是采用非变性PAGE，另外回收活性蛋白也有用非变性PAGE的。
2. SRAP（貌似叫什么...相 ...Originally posted by 墨池 at 2011-07-21 2138:TEMED和过硫酸铵的先后呢？Originally posted by 墨池 at 2011-07-21 2019:1 非变性和变性聚丙烯酰胺凝胶的区别？“变性”体现在哪里？2 SRAP标记用6%聚丙烯酰胺凝胶电泳，是变性还是非变性？配方是什么？配胶时，过硫酸铵是不是要最后加入？谢谢(*^__^*) 嘻嘻1. “变性”体现在聚丙烯酰胺凝胶中加入尿素(一般跑DNA)或SDS(一般跑蛋白)，另外，如果样品也要变性(DNA的loanding buffer也与普通的琼脂糖电泳所用的不同，同理所用Marker也不同；蛋白也要变性)。
2.SRAP一般用变性的聚丙烯酰胺，毕竟片段还是比较小。
SSR分析程序—非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
SSR分析程序—非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳1．准备DNA样品，将浓度调整至40-60ng/μL;2．PCR扩增体系(反应体系总体积：10μL)试剂μL/tube 终含量ddH2O 5.1510 x PCR buffer 1 1xMgCl(25mM) 0.8 2mMdNTP(8mM/4个) 1 0.2mM/个Primers(5μM/2个) 1 250nM/个Taq 酶(5U/μL) 0.05 0.25U/10μL模板DNA 1 40-100ng/10μL(注：SSR的引物包括两个：Forward Primer 和Reverse Primer)最后每个反应管中加30μL矿物油；此外，操作时，试剂等应放在冰上；3.PCR扩增根据引物所要求的结合温度(TM=47℃、50℃、55℃、60℃)选择扩增程序；PCR 反应一般需要3hr左右;①SSR分析中所应用的PCR反应程序(引物结合温度60℃)File 15Time-delay95℃, 2min16 Step-cycle5 cycle(94℃, 1min; 60℃, 1.5min; 72℃, 1min)17 Step-cycle30 cycle(92℃, 30sec; 60℃, 50sec; 72℃, 30sec)18 Time-delay72℃, 5min19 Time-delay25℃, 1min14 Soak-file4℃, 24hrs②SSR分析中所应用的PCR反应程序(引物结合温度55℃)File 21 Time-delay95℃, 2min22 Step-cycle5 cycle(94℃, 1min; 55℃, 1.5min; 72℃, 1min)23 Step-cycle 30 cycle(92℃, 30sec; 55℃, 50sec; 72℃, 30sec)24 Time-delay72℃, 5min25 Time-delay25℃, 1min14 Soak-file4℃, 24hrs③SSR分析中所应用的PCR反应程序(引物结合温度50℃)File 26 Time-delay95℃, 2min27 Step-cycle5 cycle(94℃, 1min; 50℃, 1.5min; 72℃, 1min)28 Step-cycle30 cycle(92℃, 30sec; 50℃, 50sec; 72℃, 30sec)29 Time-delay72℃, 5min30 Time-delay25℃, 1min14 Soak-file4℃, 24hrs4聚丙烯酰胺凝胶制备4.1 清洗玻璃板、灌胶用量筒和烧杯，玻璃板气干(制胶用玻璃板为硫化玻璃，灌胶面必须干净无水分，否则灌胶时容易产生气泡；烧杯、量筒和玻璃板如果有水，由于胶与水不相溶，易使胶不能牢固粘在玻璃板上)；4.2将平口玻璃板和凹口玻璃板放在桌面的支撑物（瓶盖等）上，给玻璃板滴少量100%乙醇，用质量好的纸均匀擦洗制胶面，气干；4.3 平口玻璃板和凹口玻璃板的三个边均匀的涂抹适量凡士林（凡士林太多不容易清洗）；放上需要厚度的板条，此步应注意密封好板条的相接处，用手将三边和接茬处按牢固，否则容易漏胶；然后用夹子（夹子夹在板条中间）将玻璃板固定于灌胶架上；4.4 配胶（8%非变性聚丙烯酰胺凝胶，Acr:Bis=37.5:1）、灌胶;将以下母液按量混合均匀保存于4℃，一般一周内用完，溶液 120ml 240ml40%Acr 24ml 48ml2%Bis 12.84ml 25.68ml10XTBE(8.3) 12ml 24mlddH2O 70.8ml 141.6ml10%APS （催化剂）和TEMED（加速剂），摇匀，灌胶，缓慢插入与胶厚度一致的梳子，同时避免梳齿下产生气泡，待胶凝固；（注：1 聚丙烯酰胺凝胶在凝固以前有毒，凝固后无毒，因此操作时应戴上手套； 2 板条和梳子厚度必须一致，否则将在点样孔中产生胶膜，影响点样和最后电泳质量）对于20cm x 17cm的玻璃板，除去板条尺寸，胶为16.5cm(宽) x 15.5cm(高) x 1mm(厚)，配制如下：胶混合液10%APS TEMED一板胶30ml 180μL 80μL两板胶60ml 360μL 160μL5电泳5.1 在气门芯中放入金属线，弯成凹形，挂在电泳槽上，在气门芯上均匀涂抹适量凡士林，用来防止上槽缓冲液渗入下槽，往上下电泳槽先加入适量1 x TBE 电泳缓冲液，缓冲液可重复使用6-7次；5.2 胶凝固后，拔去梳子（注意不要将梳齿拔断），取出胶底端的板条，用纸擦净板条上的凡士林，并用板条刮净玻璃板底端内侧的凡士林（防止将玻璃板放入胶槽中的缓冲液时产生气泡），并用水稍微冲洗点样孔处，斜着将玻璃板放入电泳槽，避免胶底端与缓冲液相接处产生气泡，用夹子从上端将玻璃板固定于电泳槽上，再加入缓冲液，使上槽缓冲液至少盖住点样孔，下槽缓冲液至少与胶下边缘相平齐，然后用电泳缓冲液冲洗点样孔；5.3 向10μL PCR扩增样品中加入2μL的5x Loading dye（此步一般可在PCR扩增完成后进行，从而使溶液充分混合），每个样品点10-12μL；最后点Marker DNA;5.4 恒压或恒流电泳，恒流，1板，50mA-60mA, 电压约300V; 2板，100-120mA, 电压约300-400V；但是应保持电压恒定，否则条带容易弯曲；注：PCR扩增产物也可以进行琼脂糖凝胶（3%）电泳，用EB染色观察。
一种快速有效检测SSR标记的非变性聚丙烯酰胺凝胶的银染方法
一种快速有效检测SSR标记的非变性聚丙烯酰胺凝胶的银染方法郭培国;刘文杰;李海洋;王直亮;夏岩石;李荣华【摘要】聚丙烯酰胺凝胶银染法是一种具有高分辨率检测SSR标记的有效方法,然而传统的银染方法存在操作步骤较多、所需时间较长及试剂种类与用量较多等不足.本研究利用菜心和烟草SSR标记为研究对象,建立一种能快速有效检测其PCR扩增产物的非变性聚丙烯酰胺凝胶的银染方法.该方法包括染色和显影2个主要操作步骤,整个银染流程耗时6～7 min,只需要AgNO3、NaOH和甲醛3种试剂,所检测SSR标记的DNA条带清晰、易辨.与其他银染法相比,本研究建立的银染法具有易于操作、耗时少、所需试剂种类和用量少及检测效果好的优势.【期刊名称】《广州大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2016(015)004【总页数】6页(P8-12,49)【关键词】SSR标记;检测;非变性聚丙烯酰胺凝胶;银染【作者】郭培国;刘文杰;李海洋;王直亮;夏岩石;李荣华【作者单位】广州大学生命科学学院,广东广州510006;广州大学生命科学学院,广东广州510006;广州大学生命科学学院,广东广州510006;广州大学生命科学学院,广东广州510006;广州大学生命科学学院,广东广州510006;广州大学生命科学学院,广东广州510006【正文语种】中文【中图分类】Q503DNA简单序列重复(SSR)标记在植物基因组中覆盖面广、数量丰富，且具有特异性强、共显性和操作简单的优点[1]，已成为研究工作者常用的分子标记之一.该技术已广泛应用于植物的遗传多样性分析、生物进化、遗传图谱的构建、QTL定位和分子标记辅助育种等研究和应用工作[2-3].聚丙烯酰胺凝胶的银染法是检测SSR标记的常用方法之一，该方法具有较高的灵敏度和较高的分辨率，可鉴别出低至1 pg·mm-2的DNA量和区分1个碱基的差异[4-5].但传统经典的银染法操作流程含有固定、漂洗、银染、漂洗、显色和终止等步骤，在使用前需配制一些溶液等[5]，存在操作复杂、耗时和费力等不足；另外，其染色的一致性、银染后凝胶的贮存时间等方面亦不是很理想[6-7].针对银染操作繁琐及染色效果的不足，先后有一些研究对银染方法进行了改进，如修改了固定步骤中固定液的成分、减少了显色和终止步骤要求10 ℃低温的条件[8-9]；取消固定步骤、调整染色液和显色液化学成分及比例等[6, 10-16].但这些改良的银染方法在操作繁琐程度或效率上仍存在不足，在化学试剂种类及用量上面还有减少的空间.据此，本研究在前人建立的银染方法基础上，利用菜心(Brassica campestrisL.ssp. chinensis var. utilis Tsen et Lee)和烟草(Nicotiana tabacum L.)SSR标记作研究对象，探讨变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的银染检测方法，建立一种仅需染色和显色2个主要步骤、3种试剂的操作简单、耗时少和分辨力高的快速有效检测SSR 标记的银染方法，适用于大量SSR标记的基因分型工作.1.1 材料1.1.1 植物材料供试的菜心材料为“四九-19号菜心”、“油绿501”、“3T6”和“柳叶50”，由广州市农业科学院提供；烟草材料“红花大金元”、“粤烟98”、“118-3”和“岩烟97”，由广东省烟草南雄科学研究所提供；盆栽种植供试的菜心和烟草材料.1.1.2 SSR标记的引物和试剂选取菜心和烟草SSR标记的引物组合各1对，用于检测银染的效果.这些SSR标记的引物由生物工程生工(上海)股份有限公司合成，其信息见表1.DNA分子大小标样DL500购自于日本宝生物工程株式会社(Takara Bio Inc.)，其他试剂均购自于Sigma-Aldrich公司.1.2 方法1.2.1 DNA的提取采收幼嫩的菜心和烟草材料的叶片，按李荣华等[17]改良的CTAB法提取菜心和烟草材料的基因组DNA；采用琼脂糖凝胶电泳检测提取DNA的质量，用NanoDrop2000超微量分光光度计(Thermo Scientific，USA)检测DNA的浓度，并将之调整到10 ng·μL-1作为SSR扩增的DNA模板.1.2.2 PCR扩增及电泳分离在10 μL的PCR反应总体积中，含10 ng·μL-1的DNA模板2.0 μL，10×PCR Buffer 1.0 μL，25 mmol·L-1 MgCl2 0.8 μL，10 μmol·L-1正向引物0.25 μL，10 μmol·L-1反向引物0.25 μL，10 mmol·L-1 dNTPs 0.25 μL，Taq DNA聚合酶(5 U·μL-1)0.15 μL，ddH2O 5.3 μL.PCR扩增循环反应程序：94 ℃预变性5 min，之后按94 ℃下变性45 s、55 ℃ 45 s、72 ℃ 1 min的PCR程序运行35个循环，最后再在72 ℃条件下延伸10 min；之后置于4 ℃条件下贮藏备用.选取美国CBS公司MGV-216-33双面三倍宽垂直电泳槽及电泳仪，电泳玻璃板大小为33 cm宽×16 cm高，采用6%(丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺之比为29∶1)的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离SSR标记的PCR扩增产物.凝胶厚度为1.5 mm，每个载样孔宽3 mm，上样2 μL.电泳条件为电压120 V，电泳时间120 min.1.2.3 银染方法电泳结束后，取下附有凝胶的玻璃板，按表2中列出的各个银染方法的实验条件和步骤进行操作，除有说明外，均在室温下操作.银染结束待凝胶晾干后，用BenQ M800扫描仪扫描，贮存扫描图片.在电脑中观察、读取数据并分析.2.1 不同银染方法的检测效果图1为除去颜色并调整至适宜亮度和对比度后不同银染法检测菜心和烟草SSR标记的银染图.从图1可见，所有的银染方法均能检测到烟草和菜心SSR标记的主条带，但BASSAM等[5]、QU等[10]和KUMAR等[16]3种银染法的背景反差较小，DNA条带强度低和清晰度不高，一些具有多态性的次级条带难观察到，检测效果差.SANGUINETTI等[8]和BYUN等[13]银染法的条带强度和清晰度要高于前3种方法，主条带清晰易辨，且能粗略判断次级条带的多态性，但清晰度不高.而AN等[14]、LIANG等[15]和本研究建立的银染法效果更进一步，经扫描成像后的凝胶背景较浅、清晰度高，菜心和烟草SSR标记的主、次条带强度高且清晰，容易检测；尤其是本研究建立的改良银染法，检测效果最佳.A～H分别为BASSAM等[5]、SANGUINETTI等[8]、QU等[10]、BYUN等[13]、AN等[14]、LIANG等[15]、KUMAR等[16]和本研究建立的银染法.图中M为DNA分子大小标样，1～4分别为烟草品种“岩烟97”、“ 红花大金元”、“ 118-3”和“粤烟98”的SSR标记TME0580的扩增产物，5～8分别为菜心品种“油绿501”、“柳叶50”、“四九-19号菜心”和“3T6”的SSR标记CX-3的扩增产物.2.2 不同银染方法所需时间和试剂种类分析根据各个银染方法报道的从固定或染色步骤开始至完全显色或终止步骤的操作流程，测定各银染法检测菜心和烟草SSR标记PCR扩增产物所耗费的时间.几种银染方法实际所需检测时间见表3.从表3可见，BASSAM等[5]、SANGUINETTI等[8]和KUMAR等[16]建立的银染方法所需的时间较长，检测需时在30 min以上；QU 等[10]和BYUN等[13]建立的银染方法需要15 min或以上，而AN等[14]和LIANG等[15]建立的银染法减少了银染所需的时间，但仍分别需时10 min；而本研究建立的银染法只需6～7 min，整个银染过程所需时间最短.从银染所需试剂的种类来看，BASSAM等[5]、SANGUINETTI等[8]和BYUN等[13]的方法需5种试剂，QU等[10]、AN等[14]、LIANG等[15]和KUMAR等[16]银染法需6种试剂，而本研究建立的改良银染法仅需3种试剂(表3)，这3种试剂为AgNO3、NaOH和甲醛，且用量亦相对较少(表2).目前SSR标记主要采用琼脂糖凝胶电泳检测和聚丙烯酰胺凝胶电泳检测的方法，其中琼脂糖凝胶电泳技术由于易于操作而被广泛使用，但存在难以分辨几个碱基差异的不足；聚丙烯酰胺凝胶电泳可区分几个碱基的差异，但BASSAM等[5]和SANGUINETTI等[8]建立的传统银染法检测聚丙烯酰胺凝胶中SSR扩增产物，具有操作步骤较多(包括固定、清洗、染色、清洗、显色、终止和清洗等步骤)、耗时较长等不足；使用荧光SSR标记技术能提高检测效率[18]，但需要较为昂贵的专用仪器设备，检测所需的试剂药品花费也较高，普通实验室里难以开展检测工作.据此，不少研究对银染法进行了改进，如在染色步骤中加入5%～10%乙醇，将原银染法中的固定、清洗和染色步骤合并成一个同时进行固定和染色的步骤[6, 10, 13-16, 19]，或不加乙醇直接进入染色步骤[11]；将银染检测过程减少至2个[6, 15]或3～4个主要步骤[10-11, 13-14, 16]，但有些银染法流程的操作较为复杂，如需在5 ℃[16]或55 ℃条件下显色[13].报道这些改进方法银染操作时间最少可达13～15 min[11, 16],有的最低可至10 min左右[6, 10, 13-14],甚至达7 min [15].但利用业已报道的银染法的操作步骤检测本研究菜心和烟草SSR标记时发现，需时最少的为AN等[14]和LIANG等[15]建立的银染法，均为10 min，但高于其报道所需的7～9 min的检测时间，这一现象亦在其他银染法[5, 10, 13, 16]中出现.究其原因，是各方法中显色步骤所需时间均高于其报道所需的最少时间(数据未发表)，因而导致整个检测过程所需时间的增加.而本研究建立的银染法，只有染色和显色2个主要步骤，检测菜心和烟草SSR标记只需要6～7 min；从检测SSR标记所需时间来看，优于其他银染法.从菜心和烟草SSR标记的检测效果来看，BASSAM等[5]、QU等[10]和KUMAR 等[16]建立的银染方法背景较浅、显淡黑色，DNA条带强度较弱，尽管能分辨出SSR标记的主条带，但次级条带相对较模糊，辨别难度较大，表明这些方法的分辨力较低.SANGUINETTI等[8]、AN等[14]、BYUN等[13]、LIANG等[15]及本研究建立的改良银染法染色背景呈浅黄色，SSR标记的DNA条带强度高，经扫描除黄色背景色、调整亮度和对比度后，凝胶图背景浅、SSR标记的主、次级条带较清晰，易于辨别，均可有效检测菜心和烟草的SSR标记.其中AN等[14]、LIANG等[15]及本研究建立的改良银染法DNA条带强度高、对比度大、分辨力高，检测效果好,尤为本研究建立的改良银染法，DNA条带更为清晰易辨.另外，本研究建立的改良银染法检测菜心和烟草SSR标记时所需试剂种类和用量最少，与检测效果较好、耗时较短的AN等[14]和LIANG等[15]所需6种试剂相比，未使用这2种方法需要的乙醇、HNO3、Na2CO3或铬黑T(EBT)，只利用这2种方法均具有的AgNO3、NaOH和甲醛3种试剂.AgNO3和NaOH的用量与An等[14]方法基本一致，但分别为LIANG等[15]方法的75%和25%；而甲醛的含量则为这2种方法的25%.这一结果表明，染色步骤中溶液的乙醇和HNO3成分不影响DNA的检测效果，但较高浓度的HNO3可能延长显色步骤中DNA显色所需的时间.究其原因是染色液中具有的HNO3，染色结束后1次5～10 s的去离子水冲洗难以将HNO3清洗完全，残留在凝胶中的HNO3减缓显色步骤中碱性环境下甲醛与Ag+的反应速度，从而延长显色时间.本研究建立一种能快速、有效检测SSR标记的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的银染方法，检测效果明显优于传统的银染方法.该银染法只需染色和显色2个主要步骤，整个银染过程耗时6～7 min，检测只需AgNO3、NaOH和甲醛3种试剂且用量少.具有简便快速、成本低、检测效果好和对环境污染少的特点，适合于大量样品的SSR标记的基因分型工作.【相关文献】[1] POWELL W, MACHRAY G C, PROVAN J. 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聚丙烯酰胺凝胶配制方法
5×TBE（组份浓度：5×TBE，pH 8.3；配制量：1 L）：称取53.9 g Tris，27.5 g硼酸，量取20 ml 0.5 mol/L EDTA（pH 8.0），置于1 L烧杯中；加入约800 ml 超纯水，充分搅拌溶解；加超纯水将溶液定容至1 L；室温保存。
10% 过硫酸铵（组份浓度：10% (W/V) 过硫酸铵；配制量：10 ml）：称取1 g过硫酸铵，置于10～50 ml烧杯中；加入约8 ml超纯水，搅拌溶解；加超纯水将溶液定容至10 ml；4 ℃保存（保存时间为2周左右，超过期限过硫酸铵将失去催化作用）。
30% 丙烯酰胺（组份浓度：30% (W/V)丙烯酰胺；配制量：1 L）：称取290 g丙烯酰胺，10 g N,N'-亚甲基双丙烯酰胺，置于1 L烧杯中；加入约600 ml超纯水，水浴加热至37 ℃，充分搅拌至溶解；加超纯水将溶液定容至1 L，用0.45 μm滤膜过滤除去杂质；并检测该溶液pH值应不大于7；棕色瓶4 ℃保存。
0.1% AgNO3（组份浓度：0.1% (W/V) AgNO3；配制量：1 L）：称取1 g AgNO3，置于1 L烧杯中；加入约800 ml超纯水，；加超纯水将溶液定容至1 L；棕色瓶室温保存。
显色液（组份浓度：2% (W/V) NaOH，0.04% (W/V) Na2CO3，0.4% (W/V) 37%甲醛；配制量：1 L）：称取20 g NaOH，0.4 g Na2CO3，置于1 L烧杯中；加入约800 ml超纯水，充分搅拌溶解；加4 ml 37%甲醛溶液，加超纯水将溶液定容至1 L；室温保存。
10% 冰乙酸（组份浓度：10% 冰乙酸；配制量：1 L）：量取100 ml冰乙酸，置于1 L烧杯中；加入约800 ml超纯水，搅拌混匀；加超纯水将溶液定容至1 L；室温保存。
2.2.6 电泳检测2.2.6.1 玻璃板清洗首先用去污粉将电泳用玻璃板、胶垫、梳子等反复清洗；然后用Ⅲ级蒸馏水漂洗2～3次，直至玻璃板表面出现均匀水膜，既不聚成水滴，也不成股流下；再用超纯水漂洗1次，晾干；最后用无水乙醇擦拭，晾干备用[74]。
DNA非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳银染配方及步骤
D N A非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳银染配方及步骤(总3页) -CAL-FENGHAI.-(YICAI)-Company One1-CAL-本页仅作为文档封面，使用请直接删除DNA非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳银染配方及步骤最近需要做DNA非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,需要用银染显示条带,但是找不到具体的配方和步骤,不知和蛋白PAGE电泳银染有什么差别,哪位师兄师姐有配方可否发一份,十分感谢!一、电泳试剂：1、30％聚丙烯酰胺(29:1)丙稀酰胺29克，Bis1克，水100ml。
2、10％过硫酸胺过硫酸胺1克，水10ml。
3、TEMED4、5xTBETris 27克，硼酸13.75克，0.5M EDTA(pH 8.0) 10ml，定容至500ml。
二、银染试剂1、固定液：100ml无水乙醇，5ml冰醋酸，定容至1000ml。
2、0.2% AgNO3：AgNO3 1克，水500ml。
3、1.5% NaOH：NaOH 7.5克，水500ml。
4、37％甲醛。
三、配胶(6%)：30％聚丙烯酰胺(29:1) 8ml，5xTBE 8ml，定容至40ml，加10％过硫酸胺 200ul；TEMED 20ul。
室温凝固时间>1小时。
四、银染：1、固定液固定10m。
2、水洗2m x3次。
3、0.2% AgNO3 100ml ＋37％甲醛50ul，混匀，避光染色30～50m。
4、水洗 20秒x2次。
5、1.5% NaOH 100ml，加37％甲醛 0.5ml，混匀，显色3～10m。
6、水洗若干次，终止显色。
电泳时间：150v x3h，溴酚兰的位置相当于40bp。
银染后胶面积将膨胀10％。
在终止显色过程中，将依惯性继续显色，所以不等显色到位即可进行终止显色。
显色到位后立即拍摄，水浸泡过夜将使背景加深转贴！！！聚丙烯酰胺凝胶电泳是分子生物学常用的一种技术。
我们实验室应用该项技术进行基因组甲基化的筛选，取得了一定结果。
因为全基因组的筛选需要很高的灵敏度，背景干扰降到最低，因此在对凝胶进行染色时，往往采用同位素法或银染法，而且配制的胶往往很大，我们配制的是大约40×35cm的胶，0.4mm厚。
SSR引物的筛选步骤
SSR引物的筛选步骤（1）利用琼脂糖凝胶电泳对引物可扩增性进行筛选通过反复摸索Tuber indicu m的PCR反应体系和扩增条件，确定以下程序进行扩增。
25µl反应体系：30 ng DNA样品，2.0 mM MgCl2，0.2 mM dNTP，0.1 µM引物，1.0U Taq DNA聚合酶，1 × PCR缓冲溶液。
扩增条件：94℃预变性2.5min，随后94℃30s，45℃～60℃（依引物的退火温度而定）30s，72℃30s，循环30～40次，最后在72℃延伸20 min。
（可根据自己的实验改变反应条件）利用以上扩增产条件，选取三个居群的三个体，对引物的可扩增性进行筛选，并经1%的琼脂糖凝胶电泳检测。
（2）利用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对引物的多态性进行筛选试剂配制：8%非变性聚丙烯酰胺凝胶配制（25ml）：15ml的去离子水H2O，5ml 的5×TBE，5ml 的40%（W/V）聚丙烯酰胺溶液，180ul的10%（W/V）过硫酸铵（APS），16 ul的TEM ED。
5×TBE的配制：54g的Tr is base，27.5g的硼酸，20ml0.5 mol/L的EDTA，最后定容至1L。
40%（W/V）聚丙烯酰胺的配制（100ml）：38.5g丙烯酰胺（Acryla mide），1.5g甲叉双丙烯酰胺（Bis-acryla mide），加100ml去离子水搅拌溶解，棕色瓶4℃保存。
10%（W/V）过硫酸铵（APS）的配制（20ml）：2gAPS加20ml去离子水后搅拌溶解，于4℃保存，可保存2周，超过期限会失去催化作用。
实验步骤：顺序安装聚丙烯酰胺凝胶电泳仪各部件，灌胶并凝聚2小时。
在电压105V，电流43mA条件下电泳3.5个小时，取下凝胶并进行以下步骤。