转基因小鼠的方法概述

转基因小鼠的应用及其制备方法学院：动物科技学院专业班级：学生姓名：学号：指导老师：时间：2015年12月17日老师，这篇文章是在图书馆《分子生物技术——重组DNA的原理与应用》书上整理下来的，没有参考文献，但是，这一万多字都是自己亲手打下来的，图也是自己用软件画的，其中的原理也都弄懂，愿老师见谅。

转基因小鼠的应用及其制备方法（西北农林科技大学动物科技学院，陕西杨凌 712100）摘要随着后基因组时代的到来，转基因动物已成为新兴的最有效的实验模型。

从上世纪80年代以来，上百个不同的基因已经转入各种品系的小鼠中。

这有助于理解基因调控，肿瘤发展，免疫特异性，发育分子遗传学以及人们感兴趣的其他生物学过程。

转基因小鼠也已在探索利用家畜进行人类治疗药物工业化生产的可能性，以及建立各种人类遗传病的转基因生物医学模型中起到重要作用。

现就制备转基因小鼠的实验方法及应用前景作简单介绍。

关键词医学模型；试验方法；应用前景Methods and Applications of Transgenic Mice(Northwest A&F University,Colledge of Animal Science and Technoledge,Yangling,Shaanxi,712100,China )Abstact:Following arrival of the post-genomics era,transgenic animals have become the most effective novel experimental the 1980’ of different genes have been transferred to the various strains of helps to understand the gene regulation,tumor development,immune specificity,developmental molecular genetics and other biological processes which people are interested mice have also been exploring the possibility of using domestic animals for the industrial production of drugs for human treatment,and they also play an important role in establishment of a variety of genetically modified biomedical model of human genetic diseases. The article here is an overview of experimental methods and the application prospect of transgenic mice.Key words:biomedical model; experimental methods; application prospect1990年人类基因组计划正式启动，经过13年的努力，人类基因组序列图绘制成功及人类基因组计划的所有目标全部实现。

人们迎来一个崭新的时代——后基因组时代，即在基因组静态的碱基序列逐步清楚之后而最基因组进行动态的生物学功能研究。

转基因动物在后基因组时代已成为生命科学研究中新作者简介：本科，动物科学专业。

；Tel：*通讯作者： E-mail：兴的最有效的动物实验模型。

小鼠是最早建立的转基因动物模型，利用转基因小鼠进行生物学或生物医学研究是当前生命科学发展的主要内容之一。

转基因小鼠是一个思维体系，所研究的问题都是在活体中进行的，类似于人体内的各种背景因素仍然存在，通过这套体系所得出的研究结论具有很高的真实性。

因此，其成为生命科学领域中的研究利器。

一、方法学1.逆转录病毒转染法1974年，Jaenisch等试图用病毒感染早期胚胎的方式将SV40 DNA肿瘤病毒基因导入小鼠体内，但是这样的基因并没有参与整个发育过程，传代的机会也很小。

1976年，Jaenisch又通过反转录病毒感染小鼠的胚胎。

在各种基因转移法中，利用逆转录病毒转染法（图1-1）能够有效地将基因整合在受体细胞基因组上。

但缺点是只能导入小片段基因（8kb左右）。

由于受到大小的限制，转移的基因可能缺少表达调控序列。

这话总方法还有一个缺陷，虽然这些载体设计为复制缺陷型，但由于产生大量载体DNA所必须的逆转录病毒品系（辅助病毒，helper virus）的基因组，可能和转移的而基因一起整合到同一个细胞核上。

尽管有特殊的预防措施，转基因生物仍有可能产生辅助病毒。

但是，在应用转基因生物合成商业产品或直接作为食品过程中，必须绝对保证没有逆转录病毒的污染。

转基因已有其他可行的方法，因此很少用逆转录病毒转染法来产生具有商业用途的转基因动物。

2.DNA显微注射法由于逆转录病毒转染法存在的缺点，近来DNA显微注射法是一种建立转基因小鼠的更好的方法。

1980年底，Gordon等[4]首次通过显微注射将纯化的外源基因转入到小鼠的受精卵原核，为建立转基因小鼠奠定了基础。

1982年，美国学者Palmiter等将大鼠生长激素基因导入小鼠受精卵，培育的21只子代小鼠中有7只含融合基因，其中6只加速生长，即“超级小鼠”诞生了。

这种方法的过程由以下步骤组成[图2-1]①对供体母鼠进行超数排卵处理，增加用于显微注射的受精卵数。

其方法是先给母鼠注射怀孕母鼠的血清，大约48 h后，在注射人绒毛膜促性腺激素。

经过处理的小数能产下35枚左右的卵，而正常情况下只有5～10枚。

②与雄鼠交配后杀死这一超数排卵的母鼠，冲洗并收集输卵管中的受精卵。

③通常立即进行受精卵显微注射。

注射的外源基因一般是线性结构且不含有原核生物载体的DNA 序列。

哺乳动物中，精子进入卵细胞后，精子细胞核（雄原核，male pronucleus）与卵细胞核独立存在。

在卵细胞核经过减数分裂成为雌原核后（female pronucleus）,才会发生核融合（karyogamy）。

雄原核一般比雌原核大，使用街铺显微镜就能确定位置。

在显微注射中受精卵可以进行显微操作、定位及固定。

将接种后的20～40个受精卵利用显微外科的方法植入受体母鼠体内，这种母鼠与切除输精管的雄鼠交配后进入假孕状态。

对于小鼠来说，交配是已知能使子宫为植入受精卵做好准备的唯一方法。

移植3星期后，养母便繁殖出从接种受精卵发育而来的幼鼠。

为了鉴定转基因动物，从小鼠的尾巴提取的DNA进行Southern杂交或者PCR，可以确定转基因的存在。

转基因小鼠之间交配以确定转基因是否存在首建鼠（founder）的生殖细胞中，随后，进一步杂交培育出纯合转基因品系。

这种方法虽然简单，但需要许多实验步骤。

即使是一个操作熟练的工作人员，最多只能使5%的移植受精卵发育成转基因动物[图2-2]。

在这个过程中，没有一个步骤的效率可达100%，因此必须使用大量的受精卵进行显微注射。

以小鼠为例，注射后大约有66%的受精卵能够存活，25%的移植卵能够发育成小鼠，而其中约有25%的小鼠是转基因个体。

因此从1000个受精卵中，只能产生30～50个转基因小鼠。

另外，这种方式注射的DNA随机整合到基因组中，并且常在同一位点以多拷贝的形式存在，所以并不是所有的转基因小鼠都具有预期的特性。

某些个体中，由于整合位点的缘故可能使转基因不表达；另一些个体中，拷贝数过多可能导致过量表达，因而扰乱了动物正常的生理功能。

尽管这种方法效率那很低，但DNA显微注射法还是建立有功能的转基因小鼠品系的常规方法。

图1-1 利用逆转录病毒载体建立图2-1 利用显微注射的方法构转基因小鼠品系转基因小鼠品系3.工程化胚胎干细胞从发育的小鼠胚胎中获得的胚胎期（blastocyst stage）细胞,能够在细胞培养基中繁殖，并在导入另一个胚泡时，保持分化成其他各种类型细胞（包括生殖系细胞）的能力，这类细胞称为全能性胚胎干细胞（ES）。

培养的ES细胞易于进行遗传工程改造而不改变其全能性。

利用这个系统，有功能的转基因可以整合在ES细胞的基因组中某个非必须基因的特定位点。

然后，选择和培养这些基因工程细胞，并用来产生转基因动物[图3-1]。

采用这种方法，就可以避免DNA显微注射法和逆转录病毒转染法中随机整合的缺点。

利用染色体特意位置整合的DNA载体转染培养的ES细胞时一些细胞中的DNA整合发生在非靶位点（错误位点），另一些细胞中整合发生在靶位点（正确位点），而大多数ES细胞中根本没有发生整合。

采用一种正负选择方法，来富集正确整合的ES细胞。

其策略是采用正选择获得正确整合的细胞，而负选择剔除错误整合的细胞。

靶位点必须位于基因组的非必需基因中，这样才能在外院DNA整合后，对细胞发育和功能没有影响。

另外，转基因还必须整合在基因组中正常转录的部位。

研究人员一直在寻找这种位点。

正负选择方法中应用的DNA载体通常包括：①与靶位点的两个位置同源的两个DNA序列区（HB1和HB2）；②转入的基因（transgene）赋予受体新的功能；③化合物G-418的抗性基因（Neor）；④来自I 型、Ⅱ型单纯疱疹病毒（HSV-tk1和HSV-tk2）编码胸苷激酶（thymidine kinase）的两个不同基因（tk1和tk2）[图3-2（a）].这一序列的组合是这一方法中的关键元素。

在于靶位点同源的两个DNA序列间是转基因的G-418抗性基因（Neor gene），两个同源区外是HSV-tk1和HSV-tk2基因。

如果整合发生在错误位点（不在HB1和HB2上），HSV-tk基因很可能与其他序列整合[图3-2(a)]。

相反，如果整合是通过靶位点双交换的基因重组，HSV-tk基因将被剔除，只有转基因和Neor基因整合在基因组上[图3-2(b)]。

转染的细胞在G-418存在情况下生长时，缺少Neor基因的细胞将被杀死。

因此，只有整合了目的DNA的细胞才能存活，这是正选择。

同时加入更昔洛韦[9-(1,3,-二羟基-2-丙氧甲基)-鸟嘌呤]和G-418时，由于胸苷激酶能将更昔洛韦转变为杀死细胞的毒素，所以表达胸苷激酶的细胞就会死亡，这是负选择。

双重选择下存活的就是正确整合的细胞。

虽然并不是很简单，但这种正负选择方法能从ES 细胞群体中富集在染色体特定位点整合转基因的细胞。

更为直接判断ES细胞是否在染色体靶位点携带转基因的方法是采用PCR鉴定。

这种情况下，DNA 载体含有两段与靶位点同源的DNA区段，分别位于转基因和一段克隆的细菌基因（或人工合成的特有基因，在小鼠基因组中不存在）的两侧[图3-3]。