转基因小鼠技术

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小鼠的历史
4. 1900年 -- 从宠物鼠到实验鼠
Abbie Lathrop----饲养宠物鼠 1902年，William Ernest Castle购买老鼠，用于遗传 学研究。哈佛大学---老鼠的毛色进行观察，以检测 孟德尔法则的正确性。
5. 1905年 -- 孟德尔老鼠
通过对黄白相间的杂色鼠进行研究，法国遗传学家 Lucien Claude Cuéno 发现，两个携带黄色皮毛基因 的老鼠之间交配，其子代老鼠中黄色老鼠和白色老 鼠的数量比总是2:1。--这是报道的第一个等位纯合 致死的基因。
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4、体细胞核移植法
显微法和克隆法效率比较
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1997 Nature 385, 810–813
4、体细胞核移植法
优点
➢减少受体动物的数目,不需要用受体母畜来承担那 些非转基因的胚胎,表现了强大的生命力。
➢事先在细胞中进行基因转移和对阳性细胞进行筛 选,简化了转基因动物生产的许多环节,节约了人力, 具有很大的优越性。
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4、体细胞核移植法
✓首先将目标基因转移到体外培育的动物体细胞中,筛选 出阳性转基因细胞并进行繁殖,制备出供移植用的细胞核 供体。然后将转基因细胞核供体移植到去核的卵母细胞 中,重构胚胎经过激活和培养后,移植到代孕小鼠中
✓1997 年, 英国Roslin 研究所的Wilmut等利用成年绵 羊乳腺上皮细胞作为核供体,成功获得了体细胞克隆绵羊 多莉(Dolly) ,拉开了动物体细胞克隆技术的序幕。
需要载体，目 因表达水平； 整合在生殖 因的单个拷 的基因的长度 可以使用定 细胞中的比 贝； 可达100Kb 点整合技术 例也很高。
该方法简 单、方便
缺 精密仪器， 供体细胞易 ES细胞株不 插入的基因 应用 有些结果
点 技术操作较难，衰老
易建立，长 有大小限度； 具有 不能重复
易造成宿主动
期培养后出 嵌合性很高； 一定
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3、逆转录病毒感染法
主要是利用反转录病毒的长末端重复序列(LTR)区域 具有转录启动子活性的特点,将外源基因连接到LTR 下游进行基因重组后,再包装成为高滴度病毒颗粒, 去直接感染受精卵或显微注入囊胚腔中,携带外源基 因的反转录病毒DNA可以整合到宿主染色体上。
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3、逆转录病毒感染法
优点 ➢由于反转录病毒的高效率感染和在宿主细胞DNA中的 高度整合特性, 大大提高基因转移的效率 ➢细菌质粒和噬菌体载体只能将目的基因运载至细菌中 扩增和表达。病毒载体是较理想的真核基因工程载体 缺点 ➢获得纯合体的转基因动物的机会少 ➢病毒载体构建复杂 ➢转入的外源基因的大小受到限制, <10kb ➢转入病毒自身基因的复制表达
缺点
➢体细胞克隆技术近年来发展势头十分迅猛,但在基 础理论和实验技术上还需进一步探索。
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5、精子载体法
✓将精子与外源DNA进行预培养之后,使精子有能 力携带外源基因进入卵中,受精后进行胚胎移植, 这样产生的动物也会使外源基因得到表达。
✓精子携带DNA的途径 外源DNA与精子共孵育 电穿孔导入法 脂质体转染法
物基因组的插
现分化现象； 外源DNA 在 局限
入突变
生产的转基 动物各种组 性
因动物都是 织中的分布
嵌合体
不均
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Electroporation
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பைடு நூலகம்
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5、精子载体法
优点 ➢基因转化方法简便,效率高 ➢动物育种不经过嵌合体,实验周期短 缺点 ➢目的基因整合的随机性 ➢无法早期验证修饰事件 ➢成功率不高、效果不稳定
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6、YAC法（人工酵母染色体法）
优点：
➢克隆百万碱基对(Mbp) 级的大片段外源DNA 的能力,可以保 证巨大基因的完整性; ➢保证所有顺式作用因子的完整并与结构基因的位置关系不变; ➢保证较长的外源基因片段在转基因动物研究中整合率的提高; ➢鉴于基因的完整性,目的基因上下游的侧翼序列可以消除或 减弱基因整合的位置效率。 缺点： ➢不稳定，制备工艺繁琐。
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小鼠的历史
6. 1909年 -- 实验鼠的诞生
Clarence Cook Little是一个来自于William Castle 实验室的哈佛大学生物学家，他培育 出了第一个近亲繁殖的小鼠株系――DBA。
染色体定位；
➢可稳定遗传，易于操作。
BAC文库：基因组酶切后100～300kbDNA+BAC大肠杆
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基因转移方法的比较
方 显微注射 法
核移植
胚胎干细胞 逆转录病毒 基因 精子介导 敲除
优 外源基因整合 转基因效率 外源DNA的 可在整合点 点 效率较高，不 高；预测基 整合率高； 整合转移基
基因打靶的简易程序
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胚胎干细胞（ES细胞）法
优点： ➢ 外源基因整合情况的可控性高 ➢ 可预先在细胞水平检测外源基因的拷贝数、定位、
表达的水平及插入的稳定性 ➢ 外源基因导入ES细胞的方法多样，细胞鉴定及筛
选方便 缺点： ➢ ES细胞系建立及培养困难 ➢ 维持ES细胞的未分化及多向分化潜能不易 ➢ 所得个体为嵌合体
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转基因小鼠技术
---转基因小鼠在科研中的应用
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小鼠的历史
1. 7500万－1.25亿年前 -- 人鼠始祖
2. 19世纪 -- 宠物鼠---实验鼠的“先驱” 3. 1897年 -- 重组表型
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7、BAC法（人工细菌染色体法）
建立在大肠杆菌的F因子上的BAC载体：外源DNA可>300kb。
F因子（F质粒）是一种“性质粒”，可转移至F-宿主细胞。 100kb,近百个蛋白质。
➢可构建BAC文库；
➢有单一的loxp位点，利于图谱分析（借助标记loxp和cre
重组酶；
➢ BAC载体两端有Sp6和T7 引物序列利于测序，确定基因的