转基因小鼠制备
转基因小鼠的制备方法
转基因小鼠的制备方法1. 确定转基因目标首先需要确定要制备的转基因小鼠的目标。
这可能包括表达某一特定基因、缺失或激活某一基因、或者将外源基因导入小鼠基因组中。
确定目标可以指导后续制备转基因小鼠的方案和步骤。
2. 选择转基因制备方法根据目标确定适合的转基因制备方法。
常用的制备方法包括基因敲除、转基因导入、RNA干扰等技术。
选择合适的方法可以提高转基因小鼠制备成功率和效率。
3. 筛选合适的人工受精方法在制备转基因小鼠的过程中，需要进行人工受精。
选择合适的人工受精技术可以增加诞生的转基因小鼠数量和通过率。
4. 获取合适的基因材料获取适合用于转基因制备的基因材料，如合成的DNA、质粒DNA等。
同时需要对基因材料进行检测和纯化，确保其纯度和有效性。
5. 操作动物实验室在制备转基因小鼠的过程中，需要操作动物实验室，按照严格的操作规程进行。
这包括对实验室环境、设备的维护和消毒，以及对动物进行规范的喂养和饲养。
6. 采集卵巢和精子制备转基因小鼠的过程中需要采集卵巢和精子，所以需要进行手术操作。
手术前需要对手术器械和手术区域消毒和准备，同时需要准确的手术技术和配合的团队，以确保手术的成功率和安全性。
7. 受精与移植将采集到的卵巢和精子进行人工受精，通过一定的操作步骤，将受精卵移植到雌鼠子宫中。
这个过程需要对移植操作技术的掌握和实验设备的准备，同时要考虑动物的生理状态和应对可能出现的并发症。
8. 生成基因编辑电子对于基因敲除和编辑的转基因小鼠制备，需要经过足够长的时间养护和观察，以鉴定是否成功。
为了确保小鼠的转基因性，可以通过检测其DNA进行验证。
9. 鉴定转基因小鼠通过PCR、Southern印迹和Western印迹等技术对转基因小鼠进行鉴定，以确保其基因表达状态符合预期。
检测结果对于小鼠繁殖和应用阶段的进行具有重要的指导意义。
10. 培育和应用转基因小鼠在检测合格后，需要对转基因小鼠进行养育和观察。
同时对于其应用也需要依据对小鼠目标的不同，进行个性化的实验设计和数据处理。
ai14转基因小鼠原理
ai14转基因小鼠原理AI14转基因小鼠是一种常用的转基因模型，被广泛应用于生物医学研究领域。
它的原理是通过基因工程技术将外源基因导入小鼠的基因组中，从而使小鼠表达人类或其他物种的特定基因。
通过对AI14转基因小鼠的研究，科学家们可以深入探究与这些特定基因相关的生理和病理过程，为人类疾病的预防和治疗提供重要的基础。
AI14转基因小鼠的制备过程基本分为以下几个步骤：1. 选择目标基因：科学家们首先需要确定他们想要研究的特定基因，这通常是与某种生理过程或疾病相关的基因。
选择目标基因的确定是研究的关键，它直接决定了后续实验的方向和结果。
2. 构建转基因载体：转基因载体是将目标基因导入小鼠基因组的工具。
科学家们通常使用质粒或病毒载体来构建转基因载体，其中包含了目标基因的DNA序列以及一些调控元件，如启动子、终止子和增强子等。
这些调控元件可以确保目标基因在适当的组织和时间点表达。
3. 转基因小鼠的制备：一旦构建好转基因载体，科学家们就可以将其导入小鼠的基因组中。
目前常用的方法是通过胚胎干细胞技术或直接注射载体DNA进入受精卵。
这些转基因载体会在小鼠的细胞中随着细胞分裂被复制，并最终导入小鼠的生殖细胞中。
4. 筛选和鉴定转基因小鼠：为了确定哪些小鼠成功地导入了目标基因，科学家们通常会对小鼠进行筛选和鉴定。
这包括对小鼠的DNA 进行PCR分析、Southern印迹等实验技术，以确定目标基因是否成功导入小鼠的基因组中。
5. 遗传稳定性的维持：一旦获得了目标基因转基因小鼠株系，科学家们需要确保这些转基因小鼠的遗传稳定性。
为此，他们通常会进行多代交配，并对后代进行基因型分析，以确保目标基因的稳定遗传。
通过AI14转基因小鼠模型的研究，科学家们可以深入研究特定基因在生理和病理过程中的作用。
例如，他们可以观察和分析目标基因在小鼠身上的表达模式以及对生理功能的影响，进而揭示该基因的功能机制。
此外，科学家们还可以利用AI14转基因小鼠模型来研究某些疾病的发生机制，寻找潜在的治疗靶点，并评估新药物的疗效。
转基因小鼠制备方法
转基因小鼠制备方法一、引言转基因小鼠是指通过基因工程技术将外源基因导入小鼠基因组中，使其表达或缺乏特定基因，从而研究基因功能、疾病模型等方面的动物模型。
转基因小鼠制备方法是实现转基因小鼠研究的重要步骤之一，本文将详细介绍转基因小鼠制备的一般步骤和常用技术。
二、转基因小鼠制备的一般步骤1. 选择目标基因和载体转基因小鼠制备的第一步是选择目标基因和适当的载体。
目标基因可以是外源基因、特定基因的突变体或基因敲除。
载体通常是带有选择标记（如抗生素抗性基因）和目标基因的质粒。
2. DNA构建在DNA构建过程中，首先需要将目标基因和选择标记基因插入到载体的适当位点上。
这可以通过限制性内切酶切割和连接、PCR扩增等方法实现。
构建完成后，需要进行酶切鉴定和测序确认。
3. 体外培养胚胎干细胞（ES细胞）转基因小鼠制备中常用的方法是利用ES细胞技术。
首先，从小鼠胚胎中获得内源性干细胞（ES细胞），并进行体外培养。
然后，将构建好的转基因载体导入ES细胞中，通过抗生素筛选获得带有目标基因的转基因ES细胞克隆。
4. 转基因小鼠制备转基因ES细胞的制备完成后，可以进行转基因小鼠的制备。
这一步骤通常有两种方法：内源性重组和外源性重组。
内源性重组是将转基因ES细胞注射到小鼠早期胚胎中，使其整合到小鼠的生殖细胞中，从而获得转基因小鼠。
外源性重组是将转基因ES细胞直接注射到小鼠的细胞团中，形成转基因胚胎，再将转基因胚胎移植到雌性小鼠子宫中，使其发育成为转基因小鼠。
5. 转基因小鼠鉴定转基因小鼠制备完成后，需要对其进行鉴定。
通常采用PCR、Southern blotting、Western blotting等分子生物学方法，检测转基因小鼠是否成功表达目标基因。
三、常用技术1. CRISPR/Cas9技术CRISPR/Cas9是一种新兴的基因编辑技术，可以实现高效、精确地对基因组进行编辑。
通过CRISPR/Cas9技术，可以直接在小鼠胚胎中进行基因编辑，从而制备转基因小鼠。
gp120转基因小鼠制备及初步鉴定
扩增 ｇｌ ｐ２ ０全长序列 ， 根据读码框架定
向连接到 ｐ Ｅ Ｐ ．ｏｔ ｌ Ｓ Ａ ２ｃｎｒ 外分泌性真核表达载体上 ， 入 Ｇ Ａ ｏ 插 Ｆ Ｐ启动 子 ， 回收含启动 子一ｐ２ － ｇ ｌ０增强 子的功能片段制备 转基 因小 酶切鉴定与测序验证均证明构建了受 Ｇ Ａ Ｆ Ｐ启动子调控 的 ｇｌ０转基 ｐ２ 因载体 ， 蛋白印迹分析显示其分泌性和组织特异性都很高 ；ＴＰ Ｒ证实转基因小鼠存在 ｇ ｌ０ｍ Ｎ Ｒ —Ｃ ｐ２ Ｒ Ａ转录。结论 成功构建 了
２ ０往 ０１
１ ２月
首 都 医 科 大 学 学 报
Ｊ ｕｎ ｌｏ ａ ｉ ｌＭｅ ｉａ Ｕ ｉｅｓ ｙ ｏ ｒ ａ ｆＣ ｐｔ ｄｃ ｎｖ ｒｉ ａ ｌ ｔ
Ｄｅ ｃ．２ ０ ０１
第 ３ 卷 第 ６ ｌ 期
Ｖｏ ＿ １ Ｎｏ ６ ｌ３ ．
［ｏ １． ６ ｊｓ ． ０－ ９． １ ０． ２ ｄｉ ０ ９ ／．Ｓ １ ６ ７５２ ０ ６０ ］ ： ３９ ｉ ０ ７ ｎ ０ ． ０
・ ＨＩ ＡＩ Ｖ／ ＤＳ基 础 与 临 床 研 究 进 展
’
ｇ ｌ０ 基 因小 鼠制 备及 初 步鉴 定 ｐ２ 转
张洪海 孙 玉 柳雅立 张 彤 吴 昊 陈德喜
（ 首都 医科大学 附属北 京佑安医院性病艾滋病实验室 ）
【 摘要 】 目的 构建 ＨＶ１ ’ Ｉ一 Ｂ 亚型 ｇｌ０ ｐ２ 转基 因载体 ， 制备 ｇｌ０ 人类免疫缺陷病毒 ；ｐ２ ； ｇｌ０ 痴呆 ； 动物模型
【 中图分类号 】 Ｑ７ ９ ８
转基因小鼠的构建
转基因小鼠的构建
转基因小鼠的构建主要涉及到显微注射法或利用DNA转座子系统提高转基因的表达阳性率。
以下是具体的步骤：
1.准备阶段：选择适合构建转基因小鼠的受体小鼠，如7~8周龄雌性小鼠，并进行相应的生理调整，
如注射PMSG和HCG。
2.受精卵的获取：通过手术从供体小鼠的输卵管中取出受精卵，并在适当的培养条件下进行培养。
3.转基因操作：在显微镜下，将线性化的外源DNA片段或构建到转座子质粒中的外源待表达的DNA
片段，通过显微注射法直接注入到受精卵的原核中，使外源基因整合到小鼠基因组中。
4.受体小鼠的准备：将受体小鼠麻醉后，进行受精卵的移植。
5.转基因小鼠的筛选和鉴定：通过PCR等方法对转基因小鼠进行筛选和鉴定，确认外源基因已经成
功整合到小鼠基因组中，并且能够过量表达。
需要注意的是，转基因小鼠的构建过程需要高度的专业知识和技术，同时还需要遵守相关的伦理和法规。
因此，在进行转基因小鼠的构建前，需要充分了解相关的知识和技术，并遵循相关的规定和指导原则。
《利用原核显微注射技术制备VEGF164转基因小鼠及其检测》范文
《利用原核显微注射技术制备VEGF164转基因小鼠及其检测》篇一一、引言随着生物医学技术的不断发展，转基因动物模型在生物学、医学等领域的应用越来越广泛。
血管内皮生长因子（VEGF）是一种重要的生长因子，对血管生成具有促进作用。
VEGF164是VEGF家族中的一种亚型，具有较高的生物活性。
本文旨在介绍利用原核显微注射技术制备VEGF164转基因小鼠的方法，并对其检测进行详细阐述，以期为相关研究提供参考。
二、材料与方法1. 材料（1）实验动物：选用C57BL/6J小鼠作为转基因实验动物。
（2）质粒：含有VEGF164基因的质粒。
（3）显微操作设备：显微操作仪、显微注射针、显微操作台等。
2. 方法（1）构建转基因载体：将VEGF164基因克隆到适当载体上，构建转基因载体。
（2）显微注射：将构建好的转基因载体显微注射到小鼠受精卵的原核中。
（3）筛选阳性小鼠：通过PCR等方法筛选出阳性小鼠。
（4）繁殖与鉴定：将阳性小鼠进行繁殖，并对后代进行基因型鉴定和表达检测。
三、原核显微注射技术制备VEGF164转基因小鼠1. 转基因载体的构建首先，将VEGF164基因克隆到适当的载体上，构建转基因载体。
这一步骤需要使用分子生物学技术，如PCR、酶切、连接等。
2. 显微注射将构建好的转基因载体显微注射到小鼠受精卵的原核中。
这一步骤需要在显微操作仪的辅助下进行，注射针需要精确地定位到受精卵的原核中，将转基因载体注入其中。
3. 筛选阳性小鼠通过PCR等方法筛选出阳性小鼠。
这一步骤需要对注射后的小鼠进行基因组DNA提取，然后进行PCR扩增和检测，以确定是否成功地将VEGF164基因整合到小鼠基因组中。
四、VEGF164转基因小鼠的检测1. 基因型鉴定对繁殖出的后代进行基因型鉴定，确定其是否为转基因阳性小鼠。
这一步骤同样需要进行PCR扩增和检测。
2. 表达检测对转基因阳性小鼠进行表达检测，以确定VEGF164基因在小鼠体内的表达情况。
Cre转基因小鼠制备技术方法
Cre转基因小鼠制备技术方法
Cre酶是在噬菌体内发现的一种酶，它能特异性的识别LoxP序列，并把同方向排列的两个LoxP序列之间的DNA切掉。
前面说了，我们把LoxP序列放到了打算敲除基因的两侧，那么我们如果把Cre酶放到细胞核里，目的基因就被Cre酶切掉，从而实现目的基因敲除了。
于是人们制作了能够表达Cre酶的转基因小鼠。
把Cre转基因小鼠和插入了LoxP序列的小鼠交配，就可以得到同时携带Cre和LoxP序列的小鼠了。
当Cre在细胞核内遇见LoxP序列，目的基因就被敲除了。
想控制在哪个细胞或者什么时间敲除目的基因，只要控制Cre酶就可以了。
制作Cre转基因小鼠时在Cre酶前面放上特异性的启动子，那么Cre酶就在该启动子表达的细胞或组织内表达，这样就只有这个组织或细胞内的目的基因被敲除。
时间上控制基因敲除的方法更为巧妙。
人们修饰了Cre酶基因，修饰后的Cre基因可以转录为mRNA，也可以在核糖体上翻译为蛋白质。
但是这种蛋白没有穿过细胞核膜的能力，也就无法进入细胞核发挥切割DNA序列的功能。
当人们外源性给予药物他莫昔芬（tamoxifen，缩写TM，是雌激素类似物）后，修饰的Cre酶就会获得穿过细胞核膜的能力。
于是Cre进入细胞核，与基因组相遇，切割掉LoxP之间的序列。
于是人们实现了什么时候给药，什么时间敲除基因（当然得给Cre 一点时间穿过细胞核膜）。
需要注意的是，Cre是一种酶，那么和所有酶一样，它的作用效果不会是百分之百的。
也许100个细胞里表达了Cre，大约70个细胞内的基因被敲除。
转基因小鼠制备实验方法
转基因小鼠制备实验方法1.计划设计：首先确定研究目的和研究对象基因的功能。
根据目的，选择适合的转基因策略。
2.构建转基因载体：根据研究对象基因的序列，设计合成含目标基因的转基因载体。
一般可选择质粒、病毒载体或者合成RNA/DNA方式构建转基因载体。
3.构建胚胎干细胞（ES）或受精卵DNA库：通过开展反转录聚合酶链反应（RT-PCR）方式，从小鼠胚胎组织中制备出RNA，然后利用逆转录酶将RNA转化成cDNA；之后，利用特定引物扩增目标基因的cDNA片段，将其克隆到适当的表达载体中，最终构建ES细胞库或者受精卵DNA库。
4.转染、筛选和克隆：将所构建的转基因载体导入到ES细胞或者受精卵中，使其整合到其基因组中。
然后，采用药物筛选、DNA分子标记、PCR和Southern blot等方法对转染后的细胞进行筛选和鉴定，获得含有目标基因的ES细胞克隆或者转基因小鼠胚胎。
5.基因敲除或添加：6.培养和培育：将获得的转基因ES细胞或者受精卵注入到养殖母鼠子宫中进行妊娠，然后等待幼鼠出生。
根据需要，可将转基因小鼠进行进一步培养、繁殖和鉴定。
为了进行转基因小鼠的后代繁殖，需要对转基因小鼠进行基因型鉴定和表型分析。
7.基因鉴定和表型分析：通过PCR、Southern blot、Western blot、RT-PCR或者其他的基因鉴定技术，对转基因小鼠的基因型进行鉴定。
同时，可以通过行为学、生理学和病理学等方法对转基因小鼠进行表型分析。
8.数据分析与结果解读：对表型数据进行统计分析，绘制图表或者进行统计学分析。
根据实验设计和方法，对实验结果进行解读，并得出相关结论。
总结起来，转基因小鼠制备是一个复杂而严谨的实验过程。
通过设计转基因载体、构建DNA库、转染和克隆、培养和培育小鼠以及基因鉴定和表型分析，可以成功制备目标基因转基因小鼠，并用于研究其功能、调控机制以及在疾病中的作用。
小鼠转基因实验报告(3篇)
第1篇一、实验背景随着生物技术的飞速发展，转基因技术在医学、农业等领域发挥着越来越重要的作用。
小鼠作为生物医学研究中常用的实验动物，其基因编辑技术的应用为疾病模型构建、药物筛选和基因功能研究提供了有力工具。
本实验旨在通过基因编辑技术构建转基因小鼠模型，研究特定基因在小鼠体内的表达和功能。
二、实验材料1. 实验动物：C57BL/6小鼠，雄性，8周龄。
2. 基因构建材料：目的基因（GFP基因）、启动子（CMV启动子）、荧光素酶报告基因（Luc基因）、pEGFP-C1质粒载体、pGL3-Basic质粒载体。
3. 实验试剂：限制性内切酶、DNA连接酶、T4 DNA连接酶、DNA聚合酶、PCR引物、Trizol试剂、RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒、细胞培养试剂等。
4. 仪器设备：PCR仪、凝胶成像系统、实时荧光定量PCR仪、细胞培养箱、显微镜等。
三、实验方法1. 目的基因构建：将GFP基因和Luc基因分别插入到pEGFP-C1和pGL3-Basic质粒载体中，构建重组质粒。
2. 重组质粒转染：将构建好的重组质粒通过脂质体转染法转染C57BL/6小鼠胚胎干细胞（ES细胞）。
3. 转基因小鼠胚胎细胞筛选：通过GFP荧光筛选，得到阳性细胞克隆。
4. 胚胎细胞传代培养：将阳性细胞克隆进行传代培养，筛选出稳定表达的细胞系。
5. 胚胎细胞冻存：将稳定表达的细胞系进行冻存，以备后续实验使用。
6. 胚胎移植：将冻存后的胚胎细胞进行移植，获得转基因小鼠。
7. 转基因小鼠表型鉴定：通过GFP荧光显微镜观察转基因小鼠体内GFP表达情况，并通过实时荧光定量PCR检测GFP基因在转基因小鼠体内的表达水平。
四、实验结果1. 重组质粒构建：成功构建了含有GFP基因和Luc基因的重组质粒。
2. 转基因小鼠胚胎细胞筛选：通过GFP荧光筛选，得到阳性细胞克隆。
3. 胚胎细胞传代培养：成功传代培养出稳定表达的细胞系。
4. 胚胎移植：成功获得转基因小鼠。
人源性抗体转基因小鼠技术(Transgenic Mouse)
人源性抗体转基因小鼠技术（Transgenic Mouse）转基因小鼠制备全人源抗体，要求人的抗体基因片段在小鼠体内必须进行较为有效的重排与表达，并且这些片段能与小鼠细胞的免疫系统信号机制相互作用，使得小鼠在受抗原刺激后，这些人抗基因片段能被选择，表达并活化 B 细胞分泌人抗体。
其基本方法是采用在鼠胚胎干细胞（ES）中的同源重组来使得鼠原有基因缺失，再通过显微注射等技术将重建的人源抗体胚系基因微位点转入小鼠体内，最终由 mAb 的杂交瘤分泌出全人序列的抗体。
转基因小鼠制备全人源抗体技术是现在全人源抗体制研究的主流，截至 2013 年，已有 5 个由转基因小鼠制备而来的全人源抗体被批准上市，20余个正处在临床试验中。
目前主要的转基因小鼠制备全人源抗体技术有HuMAb-Mouse、Xeno Mouse、VelocImmuneTM 三种方法HuMAb-Mouse： HUMab 转基因小鼠整合入人抗体基因 450kb(200kb Ig H；230kb Igk，约占人类Ig Gκ的 50％)，免疫该小鼠可以产生 0.1-5nmol／L 的抗体。
虽然该小鼠转入的人抗体基因组还是比较小，但仍获得巨大成功Xeno Mouse： Xeno Mouse 转基因小鼠也是目前最为成功、应用最广的转基因小鼠之一。
该转基因小鼠整合入大部分人抗体 VH 和Vκ基因，大小分别为1020kb 和 800kb。
重链包含 34 个 V 区基因、所有的重链 D 区和 J 区，以及Cγ2、Cμ和Cδ基因，共 66 个功能基因；轻链包含 18 个 V 区基因、所有的 5 个 J 区和Cκ基因，共 32 个功能基因。
该转基因小鼠 XMG2-KL 可以产生全人 IgM 和IgG2，亲和力达到0.1～1nmol／L。
VelocImmuneTM：不同于以往的转基因小鼠抗体筛选平台，VelocImmuneTM 产生人可变区与鼠恒定区组成的反向嵌合抗体。
制备转基因小鼠的原理
制备转基因小鼠的原理
制备转基因小鼠的原理是通过基因工程技术将外源基因导入小鼠的基因组中。
具体步骤如下：
1. 选择目标基因：根据研究需求选择要导入小鼠基因组的外源基因。
这个外源基因可以来自其他物种，也可以是已存在于小鼠中但表达量较低的基因。
2. 构建质粒：将选择的目标基因与载体DNA（如质粒）连接。
质粒通常含有特定的启动子、终止子和选择性标记基因（如抗生素抗性基因），以便检测和筛选成功导入外源基因的小鼠。
3. 体外培养：将构建好的质粒导入细胞培养物中，利用细胞的自身复制和修复机制，使质粒与小鼠细胞的染色体发生重组，将外源基因导入到小鼠的基因组内。
4. 选择性筛选：为了筛选成功导入外源基因的细胞，可以添加抗生素等选择性标记物质，只有带有外源基因的细胞能够存活下来。
5. 胚胎干细胞注射：将筛选出的带有外源基因的细胞注射到小鼠的早期胚胎中。
这些细胞会参与胚胎发育，在小鼠的成体组织中形成细胞系，继续表达外源基因。
6. 交配和繁殖：将带有外源基因的小鼠进行交配和繁殖，使外源基因在小鼠种群中得以传递和稳定遗传。
通过以上步骤，外源基因成功导入小鼠基因组，并表达在小鼠的细胞和组织中，从而达到制备转基因小鼠的目的。
转基因小鼠制备过程
转基因小鼠制备过程嘿，朋友们！今天咱就来讲讲转基因小鼠制备过程这档子事儿。
你想想啊，这制备转基因小鼠就好比是搭积木，得一块一块精心摆弄。
首先呢，得有个合适的基因，就像搭积木得有各种形状的积木块儿一样。
这基因可是关键，得选好了，不然搭出来的“小鼠大厦”可就歪了。
然后呢，把选好的基因通过一些技术手段，比如说显微注射啥的，给弄到小鼠的受精卵里去。
这就好比是把一块特殊的积木塞到了搭积木的基础里。
这可不是个简单活儿，得小心翼翼的，不能把受精卵给弄坏了呀。
接着，把这些经过处理的受精卵放回母鼠的肚子里。
哎呀呀，这母鼠就像是个“大房子”，让这些受精卵在里面好好发育成长。
等一段时间后，小老鼠就出生啦！不过这时候还不能确定是不是转基因小鼠成功了呢，还得经过一番检测才行。
这就像是搭好了积木，得看看是不是牢固，形状对不对。
如果检测发现真的是转基因小鼠，那可就太棒啦！就好像好不容易搭成了一个超级漂亮的积木造型一样，那成就感满满的！要是没成功，也别灰心，咱再来一次呗。
你说这转基因小鼠的制备是不是很神奇？就像变魔术一样，能把一个普通的小鼠变得与众不同。
而且这过程中，每一步都得仔细认真，稍微有点差错可能就前功尽弃啦。
咱再想想，要是没有这些转基因小鼠，那好多科学研究可就没法进行啦。
它们就像是科学界的小英雄，为我们探索未知的世界贡献力量呢！所以啊，这转基因小鼠制备过程虽然有点复杂，但真的超级重要的呢！咱普通人可能觉得这事儿离我们挺远的，但其实它和我们的生活息息相关呢。
说不定哪天，因为转基因小鼠的研究，就有了能治好某种疑难杂症的药呢。
总之，转基因小鼠制备过程是个既有趣又有意义的事儿，虽然有点难度，但科学家们可厉害啦，他们总能把这件事儿做好，让我们对未来充满期待！你说是不是呀？原创不易，请尊重原创，谢谢!。
转基因小鼠的制备
转基因小鼠的制备显微注射法这一方法的实验程序如下：⑴准备假孕母鼠（养母）：将可育雌鼠与输精管结扎后绝育的雄鼠交配，剌激雌鼠发生一系列妊娠变化而得到假孕母鼠作为受精卵转基因后的养母；⑵受精卵的准备：可育雌鼠注射孕马血清与绒毛膜促性腺激素（hcg）促使超排卵。
处理后与可育雄鼠交配。
次日从输卵管内收集受精卵备用；⑶基因导入：用显微注射装置将目的基因溶液导入受精卵雄性原核内；⑷胚胎移植：将已转入基因的受精卵自背部植入假孕母鼠的输卵管内，使胚胎在养母体内发育成熟；⑸对幼鼠的鉴定：①幼鼠发生断乳后自尾部提取DNA，与目的基因探针作分子杂交，鉴定外源基因是否整合，有整合的鼠称为首建鼠（founder）；②建立鼠系，将带有外源基因的小鼠与未经转基因的小鼠交配、传代后，后代有50%机率带有整合的基因供实验用。
也可将合适的组织进行细胞培养建立细胞系；③自小鼠内脏提取rna，与目的基因探针做分子杂交，比鉴定外源基因的表达和表达的组织特异性。
表达产物可以测定活性的，也可直接自血液或组织测定活性蛋白质，常用的方法如酶联免疫吸附试验（elisa）或放射免疫测定（ria）等。
亦可取胚胎进行分析。
显微注射法简化的实验过程如图23-2所示。
我国已有少数实验室（如中国医学科学院基础医学研究所）应用此法进行载脂蛋白tgm研究。
基因打靶与基因剔除技术ES细胞是从哺乳动物早期胚胎发育产生的内胚团（inner cell mass）中分离出来的。
它本身是二倍体，能在体外培养，具有高度的全能性，可以形成包括生殖细胞在内的所有组织，并且在不同的培养条件下表现出不同的功能状态。
这种细胞有两个特点，一是它本身可以分裂、增殖，形成细胞集落；另一特点是经过发育可以形成正常的动物后代。
因此，借用ES细胞系可将人们企望的某种不完整的、无功能基因直接引入到ES细胞中，通过细胞增殖、筛选可得到丧失了某种基因功能的动物后代。
正是由于ES细胞的研究成功与广泛应用，才使得基因打靶与基因剔除技术在转基因动物中的应用成为可能而且近来取得长足发展。
转基因小鼠原理
转基因小鼠原理
转基因小鼠是通过将外源基因导入小鼠的基因组中，使其具备某种特定的基因表达或功能。
下面将介绍转基因小鼠的原理。
转基因小鼠的制备主要包括以下步骤：
1. 外源基因的选择：根据研究的需要，选择具有特定表达或功能的外源基因。
这些基因可以来自于同一物种的其他个体，也可以来自于不同物种。
外源基因通常与标记基因（如荧光蛋白）连在一起，以便在小鼠体内进行检测或追踪。
2. 载体构建：将外源基因插入到合适的载体中。
这个载体通常是一个环状DNA，能够在细菌中进行复制。
载体还包括选择
性标记基因，用于筛选带有外源基因的细菌。
3. 载体的导入：将构建好的载体导入到干细胞中。
这一步通常通过细菌转化或化学方法实现。
被导入的载体被融合到小鼠的染色体中，成为其基因组的一部分。
4. 选代与筛选：经过导入外源基因的干细胞进一步进行培养和筛选，确保外源基因被稳定地遗传给后代。
5. 建立转基因小鼠系：通过转基因小鼠的选择性繁殖，建立稳定的转基因小鼠系。
这些小鼠在其体细胞中都带有外源基因。
通过以上步骤，转基因小鼠就能够被制备出来。
这些小鼠可以被用于研究基因与某种生理或疾病相关的功能和表达。
转基因
小鼠的制备对于科学研究、药物开发和疾病治疗等领域具有重要意义。
《利用原核显微注射技术制备VEGF164转基因小鼠及其检测》范文
《利用原核显微注射技术制备VEGF164转基因小鼠及其检测》篇一一、引言随着生物医学技术的飞速发展，转基因动物模型在生物学、医学和药理学等领域的应用越来越广泛。
其中，原核显微注射技术作为一种有效的基因编辑手段，被广泛应用于制备转基因小鼠模型。
本文旨在探讨利用原核显微注射技术制备VEGF164转基因小鼠及其检测方法，以期为相关研究提供参考。
二、材料与方法1. 材料（1）实验动物：选用适合实验的野生型小鼠。
（2）转基因载体：含有VEGF164基因的转基因载体。
（3）显微操作设备：显微操作仪、显微镜、显微注射针等。
2. 方法（1）构建转基因载体：将VEGF164基因插入到合适的载体中，构建转基因载体。
（2）显微注射：将转基因载体显微注射到小鼠原核中。
（3）筛选阳性小鼠：通过PCR、 Southern blot等技术检测小鼠基因组中VEGF164基因的插入情况。
（4）繁殖及传代：将阳性小鼠进行繁殖，传代后得到稳定的VEGF164转基因小鼠。
（5）检测VEGF164表达：通过免疫组化、Western blot等技术检测转基因小鼠中VEGF164的表达情况。
三、实验结果1. 转基因小鼠制备成功：通过原核显微注射技术，成功将VEGF164基因导入小鼠原核中，筛选出阳性小鼠。
2. 阳性小鼠基因检测：通过PCR和Southern blot等技术检测，证实了VEGF164基因成功插入到小鼠基因组中。
3. 稳定传代：将阳性小鼠进行繁殖传代，得到了稳定的VEGF164转基因小鼠。
4. VEGF164表达检测：通过免疫组化和Western blot等技术检测，发现转基因小鼠中VEGF164的表达情况良好。
四、讨论原核显微注射技术是一种有效的基因编辑手段，可以精确地将外源基因导入到动物基因组中。
在本文中，我们利用该技术成功制备了VEGF164转基因小鼠，并对其进行了基因和蛋白水平的检测。
实验结果表明，该技术可以有效地将VEGF164基因导入到小鼠基因组中，并在转基因小鼠中表达良好。
Vill转基因小鼠的制备的开题报告
Vill转基因小鼠的制备的开题报告题目： Vill转基因小鼠的制备及其在胰岛素抵抗性与糖尿病发病机制中的应用研究摘要：胰岛素抵抗性是糖尿病发病的关键环节，建立动物模型对于研究其发病机制和寻求治疗方案具有重要意义。
Vill转基因小鼠是一种本质上过表达小肠进食激素瘦素受体（LEPR），具有高胰岛素水平、胰岛素抵抗性和脂代谢紊乱等特征，与人类糖尿病发病机制具有高度相似性。
本研究将建立Vill转基因小鼠模型，研究其在胰岛素抵抗性和糖尿病发病机制中的应用。
一、研究背景糖尿病是一种常见的代谢性疾病，其主要病理特征是胰岛素分泌和利用双重缺陷，导致血糖升高和组织受损。
糖尿病的发病机制十分复杂，包括多种遗传和环境因素的相互作用。
胰岛素抵抗性是糖尿病发病的重要路径，在病理生理学和药理学领域得到广泛的研究。
动物模型是研究疾病发生和发展机制的基础，Vill转基因小鼠模型作为一种新兴的胰岛素抵抗性小鼠模型，已证明能够模拟糖尿病的一些病理特征，具有较高的研究价值。
但是目前对于其在糖尿病发病机制中的应用和相关机制的研究还相对较少，因此本研究将致力于建立Vill转基因小鼠模型，并在胰岛素抵抗性和糖尿病发病机制中开展深入的应用研究。
二、研究内容和方法1. 建立Vill转基因小鼠模型选用C57BL/6J小鼠，构建Vill-CreER/CAG-flox/flox-LEPR转基因体系，利用高通量测序筛选转基因细胞系，并进行体内胚胎注射、外显子杂交筛选、IVF、养殖等操作，建立Vill转基因小鼠模型。
通过PCR、Western blot等方法进行诊断。
2. 分析转基因小鼠的生理和代谢特征按年龄和性别分组，对转基因和野生型小鼠进行体质量、组织/器官大小、血液多项生化指标、胰岛素水平、组织病理及免疫组化等检测，分析转基因小鼠胰岛素抵抗性和糖代谢紊乱等生理和代谢特征。
3. 研究Vill转基因小鼠的糖尿病发病机制通过体内和体外实验方法，包括葡萄糖耐受试验、胰岛素敏感性实验、转录组学、蛋白质组学、代谢组学、关联分析、基因敲除/过表达等技术手段，研究Vill转基因小鼠在胰岛素抵抗性和糖尿病发病机制中的应用和相关机制。
Plcd1转基因小鼠的制备
基金项 目： 国 家 自然科 学 基金 项 目（ ３ １ ０ ７ １ ０ ９ ２ ） ； 浙 江 省 公 益 性 技 术 应 用 研 究 计 划 项 目（ ２ ０ １ ２ Ｃ ３ ７ ０ ８ ４ ） ； 浙 江 省 大 学 生 科 技 创 新 活 动计 划 （ 新苗人才计划） ２ ０ １ １ Ｒ ４ ２ １ ０ ２ ９ ．
１ 材 料 与方 法
１ ． １ 材 料
１ ． １ ． １ 质粒、 细 胞 和 动 物
ｐ ＭＤ１ ９ 一 Ｔ载体 购于 Ｔａ Ｋａ Ｒａ ； ＤＨ５ ａ大肠 杆菌 购 于上海 生 工 ； ｐ Ｅ Ｆ ６ ／ Ｖ５ 一 Ｈｉ ｓ — Ｌ ａ ｃ Ｚ表达 载 体 由 中科 院
收 稿 日期 ： ２ ０ １ ２ — １ ０ — １ ５
注射 ６ ８ １枚 受 精 卵 ， 在８ ２只 仔 鼠 中获 得 转 基 因 阳性 首 建 鼠 ｌ ５只 ， 其中 １ ３只 稳 定 遗 传 并 建 系 ． Ｐ Ｌ Ｃ Ｄ１ 一 ＨＩ Ｓ融 合
蛋 白在 睾 丸 组 织 中表 达 ， 在 皮 肤 组 织 中无 表 达 ． Ｐｌ ｃ ｄ ｌ转 基 因小 鼠为 Ｐ ｌ ｃ ｄ ｌ功 能 研 究 奠 定 了基 础 ．
第 ｌ ２卷第 １ 期
２ ０ １ ３年 １月
杭州 师范 大学 学报 （ 自然科学 版 ）
Ｊ ｏ ｕ ｒ ｎ ａ ｌ ｏ ｆ Ｈ ａ ｎ ｇ ｚ ｈ ｏ ｕ Ｎ ｏ ｒ ｍ ａ ｌ Ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ （ Ｎ ａ ｔ ｕ ｒ ａ ｌ Ｓ ｃ ｉ ｅ ｎ ｃ ｅ Ｅ ｄ ｉ ｔ ｉ ｏ ｎ ）
磷脂 酶 Ｃ （ ｐ ｈ ｏ ｓ ｐ ｈ ｏ ｌ ｉ ｐ ａ ｓ ｅ Ｃ，Ｐ Ｌ Ｃ ） 是 磷 酸 肌 醇 途 径 的关 键 酶 之 一 ． 它水解磷脂酰肌 醇 ４ ， ５ 一 二 磷 酸
转基因小鼠的制备
转基因小鼠的制备显微注射法这一方法的实验程序如下：⑴准备假孕母鼠（养母）：将可育雌鼠与输精管结扎后绝育的雄鼠交配，剌激雌鼠发生一系列妊娠变化而得到假孕母鼠作为受精卵转基因后的养母；⑵受精卵的准备：可育雌鼠注射孕马血清与绒毛膜促性腺激素（hcg）促使超排卵。
处理后与可育雄鼠交配。
次日从输卵管收集受精卵备用；⑶基因导入：用显微注射装置将目的基因溶液导入受精卵雄性原核；⑷胚胎移植：将已转入基因的受精卵自背部植入假孕母鼠的输卵管，使胚胎在养母体发育成熟；⑸对幼鼠的鉴定：①幼鼠发生断乳后自尾部提取DNA，与目的基因探针作分子杂交，鉴定外源基因是否整合，有整合的鼠称为首建鼠（founder）；②建立鼠系，将带有外源基因的小鼠与未经转基因的小鼠交配、传代后，后代有50%机率带有整合的基因供实验用。
也可将合适的组织进行细胞培养建立细胞系；③自小鼠脏提取rna，与目的基因探针做分子杂交，比鉴定外源基因的表达和表达的组织特异性。
表达产物可以测定活性的，也可直接自血液或组织测定活性蛋白质，常用的方法如酶联免疫吸附试验（elisa）或放射免疫测定（ria）等。
亦可取胚胎进行分析。
显微注射法简化的实验过程如图23-2所示。
我国已有少数实验室（如中国医学科学院基础医学研究所）应用此法进行载脂蛋白tgm研究。
基因打靶与基因剔除技术ES细胞是从哺乳动物早期胚胎发育产生的胚团（inner cell mass）中分离出来的。
它本身是二倍体，能在体外培养，具有高度的全能性，可以形成包括生殖细胞在的所有组织，并且在不同的培养条件下表现出不同的功能状态。
这种细胞有两个特点，一是它本身可以分裂、增殖，形成细胞集落；另一特点是经过发育可以形成正常的动物后代。
因此，借用ES细胞系可将人们企望的某种不完整的、无功能基因直接引入到ES细胞中，通过细胞增殖、筛选可得到丧失了某种基因功能的动物后代。
正是由于ES细胞的研究成功与广泛应用，才使得基因打靶与基因剔除技术在转基因动物中的应用成为可能而且近来取得长足发展。
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1. 基因准备2. 实验用鼠的饲养小鼠品系的选择需结合实验要求，如果必须使用规定的品系，则可按规定或特定要求进行。
用于转基因实验的小鼠根据其作用可分为供体鼠、受体鼠、结扎公鼠、种质公鼠。
供体鼠是提供受精卵的母鼠，为了得到更多的受精卵，通常要对其进行激素注射；受体鼠是用于胚胎移植的假孕母鼠，以后生育转基因小鼠；结扎公鼠是有交配能力，但没有繁殖生育能力的公鼠；种质公鼠用于与供体母鼠配种。
本项试验将全部应用C57/BL6 ×DBA杂交的F1代小鼠。
转基因实验需要定期提供相当数量的母鼠作为受精卵供体和假孕母鼠，以及一批相对稳定的正常公鼠与结扎输精管的公鼠（简称结扎公鼠）。
这些鼠可由实验动物中心提供，在实验前做好这些鼠与转基因相关的管理与饲养。
2.1 供体鼠一般说来，杂交子一代鼠较纯系鼠产卵多，受精卵显微注射后两细胞分裂率较高，产仔较好。
作为供体母鼠的种系，自然产卵数与超排卵数均应较高。
一般用4～6周产仔更多但卵细胞膜脆性较大，在操作过程中易破裂；而6周以后母鼠产卵逐渐减少。
2.2 受体鼠（即假孕母鼠）母鼠在正常发情期与结扎公鼠交配即产生假孕母鼠，假孕母鼠作为显微注射后受精卵的受体及其后代的养母。
这种母鼠以6周龄至5个月龄较适宜，体重最好大于20克。
母鼠一般4～5天为一个发情周期，因此在1个较大的母鼠群中约有20～25％进入发情期，如进入发情母鼠数与结扎公鼠数相近，可将每个公鼠笼内放1只母鼠；如母鼠数显著多于公鼠，可于每个公鼠笼内放2～3只母鼠。
也可不考虑发情期，随机将每个公鼠笼内放2～4只母鼠。
一般准备较多的假孕母鼠以防移卵失败。
未使用的假孕母鼠可在阴栓产生两周后重复使用。
2.3 结扎公鼠结扎公鼠与母鼠交配以后产生假孕母鼠和供体母鼠。
用作母鼠假孕的结扎公鼠需8周龄以上，对种系无特殊要求。
在作正式实验以前，每只结扎公鼠至少需要和3只母鼠交配，使母鼠只产生阴栓而均不怀孕，方可投入正式实验。
结扎公鼠可每晚与母鼠交配，但最好是隔日一次。
结扎公鼠使母鼠产生阴栓的能力可维持两年。
每只结扎公鼠最好有使母鼠产生阴栓的记录，如经4～6次都不能使母鼠产生阴栓，则所用结扎公鼠必须更换。
如每月作9次显微注射，每次需4～8只假孕母鼠，则需结扎公鼠20只。
2.5 超数排卵3～8周龄供体母鼠在12～14小时光照周期(上午6:00至下午6:00或上午7:00至下午7:00)的动物房内饲养3～5天，即可超数排卵。
一般都采用PMSG 和HCG联合使用进行超排。
用量每只母鼠都为5至7.5国际单位。
一般为冰冻干燥的粉剂，均用生理盐水或PBSG溶解500国际单位／ml，分装于1.5ml离心管中，每管0.1ml，贮存于-20℃，有效期至少一个月。
使用前加0.9ml生理盐水稀释至50IU/ml，每只供体母鼠腹腔注射0.1～0.2ml(即5～10个国际单位)。
PMSG与HCG注射的间隔时间，二者与动物房光照周期关系均影响超排卵效。
一般PMSG与HCG注射间隔46～48小时，排卵发生于注射HCG后10～13小时。
为精确地控制排卵时间，HCG的注射必须在内源LH释放之前。
PMSG 刺激内源LH的释放受动物房光照周期的调节。
内源LH的释放随种系而异，对大多数种系其释放在PMSG注射笫2个暗周期的中点之后16～20小时。
如暗周期是晚6点至早6点，PMSG在下午1～2点注射，46～48小时后注射HCG，这一注射时间约在内源LH释放之前2～3小时。
腹腔注射PMSG后，供体母鼠仍置原笼内，待两日后注射HCG，注射HCG 后每只母鼠置于1个单笼饲养的结扎公鼠笼内，次晨检查阴栓。
3. 小鼠胎儿成纤维细胞培养体系的建立3.1 材料DBA公鼠与C57母鼠配种怀孕13.5d的小鼠胎儿。
细胞培养板(六孔)、低速台式离心机、CO2培养箱、净化工作台、冷冻管、10mL玻璃离心管。
DMEM/F12、胎牛血清。
0.05%胰酶+0.04%EDTA消化液：称取0.04gEDTA完全溶解于100mL D-Hank`s液，用1mol/L的NaOH调PH至7.2-7.4，然后称取0.05g胰酶溶解其中，过滤除菌后分装，-20℃保存。
细胞培养液：DMEM/F12+FBS(终浓度为10%)+PS。
D-Hank`s液：NaCl8g+KCl 0.4g+Na2HPO4 0.05325g+KH2PO4 0.06g+NaHCO3 0.35g，加水至1000mL，调PH=7.2，高压灭菌，4℃保存。
3.2 方法3.2.1 小鼠胎儿成纤维细胞的原代培养(消化法)(1)手术取13.5日龄胎儿置于盛有D-Hank`s液的广口瓶中。
(2)用加PS的D-Hank`s液冲洗2~3遍，移入另一个平皿。
(3)去除胚胎的头、四肢、内脏，将剩余部分转移至另一平皿。
(4)将眼科剪将其尽量减碎，加入D-Hank`s液吹打散开，吸去漂浮的脂肪组织等，并吸尽液体。
再吸入适量D-Hank`s液冲洗1遍，再剪，再用D-Hank`s液冲洗，直至冲洗液清亮。
(5)将剪碎的组织放入一10mL玻璃离心管中，再加入约组织量5倍的消化液进行消化，反复吹打。
(6)当溶液出现明显浑浊后，静置一段时间后将上层浑浊液吸入到新的10mL 玻璃离心管中，1500rpm，5min。
(7)去上清，用D-Hank`s液重悬离心2次，1500rpm，5min。
(8)去上清，加成纤维细胞培养液重悬，进行细胞计数，铺六孔细胞培养板，置于37℃、5% CO2培养箱中培养。
(9)步骤(6)中微小化沉淀物加消化液进行第2次消化，重复步骤(6)- (9)，至步骤不再消化(吹打液不再浑浊)。
3.2.2 小鼠胎儿成纤维细胞的继代培养(1)待培养皿中90%铺满单层细胞时，吸去原有培养液，用D-Hank`s冲洗细胞2次。
(2)加入0.05%胰酶+0.04%EDTA消化处理并置于37℃培养箱直到贴壁的胎儿成纤维细胞基本变圆。
(3)加入成纤维细胞培养液终止消化。
收集细胞混悬液，1500rpm离心5min，除去上清。
(4)用培养液重悬细胞，吸取悬液铺入六孔板中，置37℃、5%CO2的培养箱中继续培养。
细胞反复消化培养3代至培养孔中杂细胞基本消失。
3.2.3 细胞的冻存与复苏冻存：弃去旧培养液，用D-Hank’s清洗两遍。
加消化液约2min，吹打悬浮细胞，移入离心管，1500rmp，离心3min。
D-Hank’s液洗一遍，弃废液，再用配好的冻存液（含20%FBS，含10%DMSO的DMEM/F12）细胞，加入冻存管中。
-4℃15min，-20℃2h，然后放入-75℃冰箱过夜，最后放入液氮中保存。
复苏：从液氮瓶中取出快速放入37℃中水浴。
融化后加入10倍左右的DMEM/F12培养液，离心（1000rpm/min）10min，去上清，加入培养液，最后稀释使细胞浓度为1×106个/ml。
放置在37℃，饱和湿度，5%CO2的培养箱中，细胞贴壁后更换培养液。
5. 基因转染胎儿成纤维细胞及细胞株的建立5.1 材料Multiporator（effendorf，德国）、低速台式离心机、CO2培养箱、倒置显微镜、细胞培养六孔板、单人双面净化工作台、自动双重纯水蒸馏器、数码凝胶图像处理系统、DNA扩增仪。
DMEM/F12、G418、LUTEOTROPICHormone、Hypoosmolar buffer。
其它试剂为国产分析纯级，分别购自南京科威公司、上海华美公司、上海生工公司、上海药剂等。
0.05%胰酶+0.04%EDTA消化液：称取0.04gEDTA完全溶解于100mL D-Hank`s液，用1mol/L的NaOH调PH至7.2-7.4，然后称取0.05g胰酶溶解其中，过滤除菌后分装，-20℃保存。
G418筛选培养液：DMEM/F12 100ml+G418 10.000g，过滤除菌，分装1ml/管，-20℃保存。
D-Hank`s液：NaCl8g+KCl 0.4g+Na2HPO40.05325g+KH2PO40.06g+NaHCO30.35g，加水至1000mL，调PH=7.2，高压灭菌，4℃保存。
5.2 方法5.2.1 细胞对G418的耐受性实验(1)选择生长均匀、形态正常的细胞消化后，计数。
取两块6孔细胞培养板，的加湿培养箱中向每孔中接种 1ml含2～5×105个细胞的培养液，37℃、5%CO2培养至 50%～70%汇合。
(2)分别向1至8孔中加入 G418。
每孔浓度分别为100µg/ml、200µg/ml、300µg/ml、400µg/ml、500µg/ml、600µg/ml、700µg/ml、800µg/ml。
第9、10、11、12孔作为空白对照。
(3)每两天换培养液一次，每天观察细胞的生长情况并记录。
5.2.2 电转染用电压、脉冲时间的优化电转染时电压和脉冲时间是影响细胞存活率和转染率的最主要因素，许多研究表明，电转染后细胞存活率在50%左右的电学参数就是较为理想的转染参数。
本实验以电压100V、150V、200V、250V和脉冲时间60µs、80µs、100µs、120µs分别电击P3代小鼠胎儿成纤维细胞，电穿孔结束后将电转染液转移至六孔细胞培养板中并补加正常的乳腺上皮细胞培养液后置培养箱中培养24小时，然后消化贴壁细胞计数细胞数，计算出细胞存活率。
5.2.3 基因电转染小鼠胎儿成纤维细胞(1)弃去原培养液，用D-Hank`s液冲洗2遍。
加入0.05%胰酶+0.04%EDTA消化液消化，2min左右后弃去大部分消化液。
(2)待大量细胞变圆时，用含10%FBS的DMEM/F12培养液终止消化。
轻轻吹打分散细胞，并加入1mL左右D-Hank`s液一起移入离心管中。
同时，吸取少量悬液进行细胞计数。
其余的细胞悬液在室温条件下，1500rpm离心5min。
(3)将细胞计数板平放于显微镜台上，立即从计数板边缘轻轻滴加细胞悬液，使之充满计数板和盖玻片之间的空隙。
在镜下观察细胞，根据细胞数量调整细胞密度，使细胞密度达到200个~500个/10mm2。
(4)在显微镜下对细胞进行计数，活细胞胞体完整，透明不着色，凡着色者均为死细胞。
计算四角大方格内的细胞数，压线者只计算左线和上线者，右线和下线不计算在内。
然后按下列公式计算：细胞数/毫升原悬液=（4大格细胞总数/4）×10000×稀释倍数(5)离心后，弃去上清。
加入1mLHypoosmolar Electroporation Buffer悬浮细胞，1500rpm离心5min，弃上液。
(6)将细胞重悬于Hypoosmolar Electroporation Buffer，使细胞达到1~3×106cells/mL。