核酸制备
核酸的制备
四：沉淀核酸 1.将rnp部分用滴管吸出上层清液，在低 温下加入1.5~2倍的冷95%乙醇，并轻轻 搅拌。低温放置15min，3000rpm离心 10min，弃去上清液，即得RNA颗粒状沉 淀，待定性。 2.取2支干净试管，一管加入1.5mlDNA溶 液，另一管加入蒸馏水1.5ml，向两管中 加入3ml二苯胺试剂，于沸水中加热 10min，由乳白色变为蓝色为阳性反应。
4.将匀浆置离心机中离心20min（3000rpm）。
二：分离DNP、RNP
1.上层液倾出留待抽提RNA。 2.下层用二倍体积冷的1mol/LNaCl溶液抽提1h，待分离 DNA核蛋白。
三： 沉淀核蛋白 1.上清液：0.14mol/L的NaCl抽提液（内含RNA核蛋 白）加入等体积的氯仿和1/40体积的异戊醇，置带 塞离心管中，振摇30min，此时提取液为乳白色混 悬液，以3000rpm离心15min，离心物呈三层。 2. 沉淀：将抽提1h的1mol/LNaCl匀浆悬液以 3000rpm离心20min，弃去沉淀，将其上清液倒入 带塞的离心管中，加入等体积的氯仿及1/40体积的 异戊醇振摇30min，离心20min。
五：鉴定 1.RNA的呈色反应 取2支干净试管，一管加入1.5ml RNA溶液，另一管 加入蒸馏水1.5ml，向两管中加入3ml地衣酚试剂， 于沸水中加热10min，由黄色变为绿色为阳性反应。 2. DNA的呈色反应 取2支干净试管，一管加入1.5mlDNA溶液，另一管 加入蒸馏水1.5ml，向两管中加入3ml二苯胺试剂， 于沸水中加热10min，由乳白色变为蓝色为阳性反 应。
制作人：王世贵
制备方法：盐溶法
破碎细胞 鉴定
一：破碎细胞 1.将新鲜猪肝用0.14mol/L氯化钠溶液（内含0.01mol/L柠檬 酸）清洗干净。 2.用不锈钢刀片将猪肝切成小块。
实验二细菌基因组DNA的提取
4、取上清，加入等体积（约800ul）的酚：氯仿：异戊醇（25：24： 1），混匀，离心12000rpm,5min，将上清液转至新管中。（抽提 两次）
DNA纯化（去杂质） 蛋白质： 常用苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）或氯仿：异戊醇（24：1） 抽提。 RNA ：常选用RNase消化 ，或是用LiCl来消除大分子的RNA。 酚类物质： 提取液中加少量巯基乙醇，选取幼嫩的材料。 多糖： 提取液中加1％PVP。
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12
核酸样品的保存
温度： 4℃（5℃）最佳和最简单 -70℃是长期保存的良好温度，为一次性保存 -20℃保存
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DNase抑制
①加入少量金属离子螯合剂，如0.01 mol/L EDTA 或柠檬酸钠，DNase基本可以全部失活。 ②去垢剂、蛋白变性剂及DNase抑制剂也可使 DNase失活。
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RNase抑制 ①操作要带手套。 ②所有器皿要严格消毒， ③试剂处理 ④低温操作
⑤在分离过程中要加入一定的RNase抑制剂。
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16
四、注意事项——细胞裂解
➢ 材料应适量，过多会影响裂解，导致DNA量 少，纯度低
➢ 针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式：
• 植物材料－－液氮研磨 • 动物组织－－匀浆或液氮研磨 • 组培细胞－－蛋白K • 细菌－－溶菌酶破壁 • 酵母－－破壁酶或玻璃珠
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8
核酸制备中常用的蛋白质变性剂
1.使蛋白质变性、沉淀，从核酸提取液中分离除去，以防造 成蛋白污染。
制备核酸单链
有多种方法可以用于制备核酸单链。除将双链PCR产物热变性或碱处理外，常用的方法还包括：
1）T7逆转录法。该法是在一条PCR引物5’端加上T7启动子，以纯化PCR扩增产物为模板，用T7 RNA聚合酶体外逆转录合成单链RNA（Hughes, et. al., Nat. Biotechnol., 2001, 19:342-347）。该方法虽然单链得率较高，但需两步完成，操作不便，而且需严格控制RNA酶的污染。
2）核酸外切酶法（Higuchi and Ochman, Nucleic. Acids Res., 1989, 17:5865）。由于一条PCR引物被磷酸化，PCR产物在用核酸外切酶消化时，被磷酸化的引物扩增链不被切割。消化后酶被加热灭活。该方法也需纯化PCR产物，操作不便，而且单链得率依赖于外切酶的活性。
4）磁珠捕获法。用链亲合素包被的磁珠捕获生物素标记引物的扩增链，然后用NaOH处理得到目标单链（Espelund, et. al., Nucle使用的包被磁珠较为昂贵。
5）不对称PCR。以上方法均需在PCR后进行额外的处理，而不对称PCR可在PCR扩增的同时制备DNA单链。常规不对称PCR使用两条不等量的引物，在开始的循环里进行正常扩增。随着循环的增加，量少的引物被逐渐耗尽，而超量的引物可继续直线扩增生成DNA单链（Gyllensten and Erlich, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1988, 85:7652-7656）。本实验室比较了一步法不对称PCR、磁珠捕获法、热变性和碱变性四种方法制备DNA单链进行基因芯片杂交的效果，发现不对称PCR和磁珠捕获法都具有较高的杂交灵敏度和特异性，而同样杂交条件下，热变性或碱处理可能引起假阴性的杂交结果。考虑到操作简便性和成本，不对称PCR更为实用（Gao, et al., Analytical Letters, 2003, 33:2849-2863）。但其引物的比例需优化，而且非特异扩增的机会增加，电泳时常可见弥散条带（Erdogan, et. al., Nucleic. Acids Res., 2001, 29:E36）。相比之下，使用两步法进行不对称扩增更加可靠和常用（Gorelov, et. al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1994, 200:365-369; Scott, et. al., Lett. Appl. Microbiol., 1998, 27:39-44; Guo, et al., Genome Res., 2002, 12:447-457），它是以纯化的对称PCR产物为模板，使用单条引物进行PCR循环制备单链，但其耗时和不便是显而易见的。
第二讲-核酸的制备1-2012
RNA: Base:
核酸分子具有游离5´磷酸的一端称为5 ´端，具有游离3 ´羟基的一端称为3 ´端。
A型DNA，为DNA双螺旋的一种形式，拥有与较普遍的B-DNA相似的右旋结构，
但其螺旋较短较紧密。
Z型DNA，是DNA双螺旋结构的一种形式，具有左旋型态的双股螺旋(与常见的
B-DNA相反)，并呈现锯齿形状。
然后合并上述两份杂交产物，加上新变性的Driver单链, 再次杂交, 产生 两端具有不同接头的cDNA 片段。 补齐cDNA 片段的粘性末端,利用根据接头序列设计的引物进行第一次 PCR 扩增, 这样只有含Adapter1和Adapter2R 的序列片断可以被扩增。
利用稀释后的第一次PCR 产物；加入根据接头长链序列设计的内侧引物 Nested1、 Nested2R 进行巢式PCR，进一步扩增具有差别表达的序列， 增强其特异性扩增。
成 cDNA, 然后用酶（Rsa I, oligo dT引物5‘端带有该酶切位点）切成大
小适合的具有平齐末端的 cDNA 片段。
把Tester平均分成两份, 再分别加上不同接头(Adapter1 和Adapter2R)，
通过与过量的Driver进行第一次杂交将双方的共同片段去除, 实现Tester 中差异片段的均等化，表达水平高时容易找到互补链。。
四碱基内切酶Dpn Ⅱ的一组接头，接头一侧形成该酶的粘性末端。 接头5´末端均被去磷酸化, 因而只有长片段( R -24、 J -24 和 N -24)能与Tester cDNA 酶切片段末端连接，并被作为接头专一性PCR 引物。
分别提取实验组( Tester ) 和对照组( Driver)的总RNA 或mRNA, 并反转录成 cDNA 双链。
核酸制备的一般方法和原理
核酸制备的一般方法和原理核酸制备是分子生物学中的一个重要实验技术，用于在实验室中合成DNA和RNA。
核酸制备的一般方法包括聚合酶链反应（PCR）、逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）、DNA合成和RNA合成等。
下面将介绍这些方法的原理和步骤。
PCR是一种可以在体外合成大量DNA片段的技术。
原理是通过循环反应来放大DNA片段的数量。
PCR的主要步骤包括DNA模板的变性、引物的连接、DNA 合成和循环反应。
首先，需要从细胞中提取DNA，并将其加热至95摄氏度，使双链DNA变性成为单链。
这个步骤被称为变性。
然后，在第一个循环中，混合DNA模板、引物和聚合酶。
引物是一小段具有互补碱基序列的DNA片段，用于在DNA模板上定位扩增的目标序列。
聚合酶则是一种酶类，具有在合成新DNA链上添加新碱基的功能。
接下来是DNA合成步骤，通过将DNA聚合酶与引物添加到变性的DNA模板中，让聚合酶按照引物的互补碱基序列合成新的DNA链。
PCR的最后一步是循环反应。
这个过程包括变性、连接和合成DNA的多个循环。
一般而言，前几个循环的温度较高，以变性DNA；接着的几个循环，温度会降低，以使引物连接到DNA模板上；最后的几个循环，温度会升高，以使聚合酶合成新的DNA链。
RT-PCR是一种可以将RNA转录成DNA的方法。
原理是通过逆转录酶将RNA 转录成DNA，并在PCR中进行扩增。
RT-PCR的主要步骤包括RNA提取、逆转录反应、PCR反应和扩增。
首先，需要从细胞中提取RNA，并使用酶类或化学试剂使RNA变性，以防止其进一步降解。
然后，需要逆转录反应将RNA转录成DNA。
逆转录酶是一种具有DNA聚合酶和RNA酶H活性的酶类，它能够合成DNA链，并通过降解RNA启动链来移除RNA。
接下来，PCR反应和扩增步骤与常规的PCR技术相似。
需要使用引物和聚合酶来合成新的DNA链，通过循环反应来放大RNA反转录成的DNA。
除了PCR和RT-PCR技术外，核酸制备还包括DNA合成和RNA合成。
基因工程复习资料
基因工程复习资料第一章核酸的制备1.主要步骤：分、切、接、转、筛、表2.基因工程的概念：基因工程又称基因堆叠技术和dna重组技术，就是以分子遗传学为理论基为础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种dna分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。
第二章基因工程工具酶1.生物催化剂：核酶、抗体酶、模拟酶。
2.限制性内切核酸酶：定义：限制性内乌核酸酶就是一类能够辨识双链dna中特定核苷酸序列（辨识序列），并在识别序列上使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶。
命名：限制性内乌核酸酶通常就是以第一次抽取至这类酶的生物的种名的第一个字母和种名的第一、第二个字母命名的，有的在后面还加菌株（型）代号中的一个字母。
如果从同一种生物中先后提取到多种限制性内切核酸酶，则依次用罗马数字ⅰ、ⅱ、ⅲ表示。
并且名称的前三个字母须用斜体，第一个字母用大写。
3.dna连接酶：定义：dna连接酶也称dna黏合酶，在分子生物学中扮演一个既特殊又关键的角色，那就是连接dna链3‘-oh末端和，另一dna链的5’-p末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的dna链连成完整的链的一种酶。
种类：大肠杆菌dna连接酶、t4dna连接酶、tscdna连接酶、真核生物细胞辨认出的连接酶，例如酶ⅰ、酶ⅱ、酶ⅲ等多种类型。
4.dna片段的相连接方法：①具互补黏性末端dna片段之间的连接：可用e?colidna连接酶，也可用t4dna连接酶。
②尼奥罗末端dna片段之间的相连接：就可以用t4dna连接酶，并且必须减少酶的用量。
③dna片段末端修饰后进行连接：dna片段末端同聚物加尾后进行连接，可按互补粘性末端片段之间的连接方法进行连接；粘性末端修饰成平末端后进行连接；dna片段5′端脱磷酸化后进行连接；dna片段加连杆或衔接头后连接。
5.dna聚合酶：①定义：dna聚合酶就是指用dna单链为模板，以4种脱氧核苷酸为底物，催化剂制备一条与模板链序列优势互补的dna新链的酶。
厦门大学基因工程课后思考题
第一章核酸的制备1.名词解释：脱氧核糖核酸：核糖核酸：ccc-DNA：当两条多核苷酸链均保持着完整的环形结构时，称为共价闭合环形DNA（cccDNA）oc-DNA：如果两条核苷酸链中只有一条保持着完整的环形结构，另一条链出现一至数个缺口时，称为开环DNA（ocDNA）l-DNA,：发生双链断裂而形成线性分子（L—DNA），L构型DNA变性：双联变成单链DNA复性：单链又变成双链PCR, 模板，引物2.分别阐述用CTAB裂解法，SDS裂解法，碘化钠裂解法以及蛋白酶K裂解法和溶菌酶裂解法裂解细胞的依据。
溶菌酶：破坏细胞的细胞壁肽聚糖骨架，在内部渗透压的作用下使得细胞胀破。
CTAB裂解法：CTAB作为离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚SDS裂解法：利用中性去污剂NP-40破坏全血的红细胞膜，离心弃去溶血液，收集白细胞沉淀，加入去污剂SDS以破坏白细胞核膜，并使核蛋白解离，再加入高浓度的NaCl使DNA溶解，同时使蛋白盐析。
通过离心收集水相，加2——2.5倍体积的无水乙醇，沉淀DNA碘化钠裂解法：低渗破坏细胞，碘化钠破坏核膜蛋白酶K裂解法：蛋白酶k是一种枯草蛋白酶类的高活性蛋白酶，用于生物样品中蛋白质的一般降解3.用于检测样品纯度和浓度的方法有哪些？简述个各方法的基本原理。
电泳、OD值、荧光定量法第二章基因工程工具酶1.名词解释：限制性内切核酸酶：在DNA上核苷酸的特定连接处以特定的方式把DNA双链切开DNA连接酶：催化DNA上裂口两侧(相邻)核苷酸裸露的3＇羟基和5＇磷酸之间形成共价结合的磷酸二酯键，使断开的DNA•裂口连接起来逆转录酶：依赖于RNA的DNA聚合酶DNA聚合酶：是一类催化DNA合成的酶类，酶的作用需要DNA或RNA作为模板，合成DNA链的序列与模板的序列互补Klenow片段（Klenow酶）：大肠杆菌DNA聚合酶I经枯草杆菌蛋白酶处理,获得N端三分之二的大肽段,即Klenow 酶限制性图谱（物理图谱）：描述染色体上限制性内切酶切割位点之间距离和顺序的图谱，通常以DNA的长度来代表距离，因此为遗传物质提供了物理图谱。
核酸的合成(RNA)
3
碱基的合成可由氨基酸经过多步生化反应生成， 也可从食物中摄取。
03 RNA的合成机制
转录过程
转录是RNA合成的关键过程， 它涉及以DNA为模板合成RNA
的过程。
在转录过程中，RNA聚合酶识 别DNA上的特定启动子序列，
并开始合成RNA链。
转录过程中，RNA聚合酶沿着 DNA模板移动，并添加与DNA 模板互补的核糖核苷酸到RNA 链上。
04
转录起始、延伸和终止
在延伸阶段，RNA聚合酶沿着DNA模板移动并 合成RNA链。
转录起始、延伸和终止过程中涉及一系列复杂的调控 机制，以确保RNA合成的准确性和效率。
转录起始是RNA合成的起始阶段，涉及RNA聚 合酶与DNA模板的结合。
转录终止是RNA合成的结束阶段，涉及RNA聚 合酶从DNA模板上释放并完成RNA链的合成。
RNA的合成是指通过一系列酶 促反应，将核苷酸聚合成为 RNA分子的过程。
RNA的合成过程
RNA的合成需要经过转录和翻译两个过程。
转录是指以DNA为模板，通过RNA聚合酶的作用，将核苷酸聚合成为RNA分子的过 程。
翻译是指以mRNA为模板，在核糖体上将氨基酸按照一定的顺序连接起来，形成蛋 白质的过程。
Байду номын сангаас4 RNA合成的调节
转录水平的调节
转录起始的调节
RNA聚合酶的启动子识别和结合是转录起始的关键步骤，可以通 过调控启动子的选择和使用来调节转录。
转录延伸的调节
转录过程中，RNA聚合酶的活性受到多种因素的调节，如磷酸化、 去磷酸化等，这些调控机制可以影响转录的速率和产量。
转录终止的调节
转录终止涉及RNA聚合酶到达终止子并释放RNA的过程，可以通 过调控终止子的选择和使用来调节转录。
核酸疫苗的制备工艺研究
核酸疫苗的制备工艺研究
核酸疫苗是一种新型的疫苗，其制备工艺包括以下主要步骤：
1. 选择适当的DNA或RNA质粒：核酸疫苗使用的DNA或RNA质粒必须具有目标抗原的基因序列，并且在质粒表达时能够产生目标抗原。
2. 质粒扩增：通过细菌发酵或其他方法，扩增目标DNA或RNA质粒。
3. DNA或RNA质粒纯化：通过离心、滤膜等方法将目标DNA或RNA质粒从细菌细胞中分离出来。
4. 质粒修饰：将质粒加入适当的启动子、信号序列、多聚尾等序列，以提高表达效率。
5. 表达载体构建：将修饰后的质粒插入表达载体中，形成重组表达载体。
6. 细胞培养：将重组表达载体转染到适当的细胞系中，进行培养。
7. 目标抗原表达：在细胞培养的过程中，目标抗原基因被表达，并且可以被细胞分泌或者表面展示。
8. 疫苗制备：根据需要将目标抗原从细胞中提取或者进行纯化，加入适当的辅
助物质进行疫苗制备和包装。
9. 疫苗质量检测：通过疫苗抗原性、疫苗纯度、细菌、真菌和病毒的检测，确保疫苗符合质量标准。
通过以上步骤，核酸疫苗可以得到高效、可靠的制备和生产。
核酸的制备与鉴定项目报告
核酸的制备与鉴定项目报告项目名称：核酸的制备与鉴定班级：10食品组员：柴鲜鲜，王锦，安艳松，蒋玉丹项目实验时间：2011.09.21核酸的提取一·背景知识1·概念核酸是由核苷酸聚合而成的生物大分子化合物，为生命的最基本物质之一。
最早由米歇尔于1868年在脓细胞中发现和分离出来。
广泛存在于所有动物、植物细胞、微生物内。
生物体内核酸常与蛋白质结合形成核蛋白。
核酸由碳、氢、氧、氮、磷5种元素组成。
基本组成成分是磷酸、戊糖和碱基。
2·种类按组成成分戊糖不同分为脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸(RNA)两大类。
DNA是生物体主要的遗传物质，通过复制将遗传信息由亲代传给子代。
RNA参与蛋白质的合成，与遗传信息在子代的表达有关。
细胞中的RNA有三类：信使RNA(mRNA)，核糖体RNA(rRNA)，转移RNA(tRNA)。
3·生物合成遗传信息的传递和表达主要通过复制、转录和翻译进行。
复制（replication）是指以原来DNA分子为模板，合成出相同DNA分子的过程；转录（transcription）是以DNA分子为模板合成出与其核苷酸顺序相对应的RNA的过程；翻译（translation）是在由rRNA和蛋白质组成的核糖核蛋白体（简称核糖体）上，以mRNA为模板，根据每3个相邻核苷酸决定一种氨基酸的三联体密码规则，由tRNA运送活化的氨基酸，GTP提供所需能量，合成出具有特定氨基酸顺序的蛋白质肽链的过程。
4·应用现已发现近2000种遗传性疾病都和DNA结构有关。
如人类镰刀形血红细胞贫血症是由于患者的血红蛋白分子中一个氨基酸的遗传密码发生了改变，白化病患者则是DNA分子上缺乏产生促黑色素生成的酷氨酸酶的基因所致。
肿瘤的发生、病毒的感染、射线对机体的作用等都与核酸有关。
70年代以来兴起的遗传工程，使人们可用人工方法改组DNA从而有可能创造出新型的生物品种。
如应用遗传工程方法已能使大肠杆菌长生胰岛素，干扰素等珍贵的生化药物。
核酸的制备和提取
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（1）核酸中糖
RNA为D-核糖，DNA为 D-2-脱氧核糖，二者都 是β 型。差异：2 位羟基是否脱氧。
核酸的制备和提取
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（2）碱基：
a、嘌呤碱：腺嘌呤（Ade)、鸟嘌呤(Gua)
b、嘧啶碱：胞嘧啶(Cyt)、尿嘧啶(Ura)、胸腺嘧 啶(Thy)
核酸的制备和提取
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（3）核苷：
核糖核酸（RNA）分成以下几类：
1、信使RNA（mRNA） 2、转移RNA（tRNA） 3、核糖体RNA（rRNA） 4、其它非编码RNA (snRNA, microRNA)
核酸的制备和提取
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（二）、核酸分布：
1、DNA分布：
真核生物细胞核，线粒体亦含有DNA. 原核生物集中于核区，核外质粒 病毒含有DNA或RNA.
•识别氨基酸——其 3’末端 腺苷酸可与一氨基酸共价 连接
•识别密码子——反密码子 与mRNA中密码子碱基配 对。
核酸的制备和提取
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6、rRNA
rRNA 占 RNA 总 量 80% 以 上，核糖体由大小两个 亚基组成，大小亚基分 别几个rRNA和数十种蛋 白质组成。
rRNA与几十种蛋白质组成 细 胞 颗 粒 —— 核 糖 体 是 细胞内合成蛋白质工厂。 核糖体上催化肽键合成 是rRNA，蛋白质只是维 持rRNA构象，起辅助作 用。
早期研究仅将核酸看 成是细胞中普通化学 成份，没有些人注意 到它在生物体内有什 么功效；
核酸的制备和提取
F.Miescher
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核酸作为遗传物质发現过程
➢ 20世纪初，德国生理学家柯塞尔(Kossel)证实了核酸是 由四种不一样碱基所组成；美国科学家列文(Levene) 又确定了核酸有两种,即DNA和RNA；
核酸提取的原理及方法
核酸提取的常见方法及原理核酸提取作为分子实验中最基础的实验之一，几乎是所有实验的基本，无论后续的克隆、PCR、qPCR、建库测序等等都需要核酸才能顺利进行。
今天我们就来简单了解核酸提取的基本原理和方法。
1、什么是核酸核酸是由许多核苷酸聚合成的生物大分子化合物，为生命的最基本物质之一，分为脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA），其中RNA又可以根据功能的不同分为核糖体RNA(r RNA)，信使RNA（m RNA）和转移RNA（t RNA）。
核酸广泛存在于所有动植物细胞、微生物内、生物体内的核酸常与蛋白质结合形成核蛋白。
不同的核酸，其化学组成、核苷酸排列顺序等不同。
DNA主要集中在细胞核内，线粒体和叶绿体中，而RNA主要分布在细胞质当中。
2、核酸提取类型1、总RNA提取总RNA中，75-85%为rRNA(主要是28S-26S/23S和18S/16S rRNA)，其余的由分子量大小和核苷酸序列各不相同的mRNA和小分子RNA如tRNA、5S rRNA、5.8S rRNA、miRNA、siRNA、小核RNA（small nuclear RNA，snRNA）及核仁小分子RNA（small nuceolar RNA，snoRNA）等组成。
2、miRNA提取MicroRNAs (miRNAs)是小型的、高度保守的RNA分子，如小干扰RNAs (siRNAs)，通过与他们的碱基配对调节其同源mRNA的分子表达，以预防通过各种机制的表达。
他们已成为进行发育、细胞增殖、分化和细胞周期的重点监管机构。
3、基因组DNA提取进行基因结构和功能研究以及基因诊断，通常要求得到的片段长度不小于100～200kb。
在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素，以保证DNA的完整性，为后续的实验打下基础。
4、质粒抽提质粒抽提方法即去除RNA，将质粒与细菌基因组DNA分开，去除蛋白质及其它杂质，以得到相对纯净的质粒。
核酸的提取
核酸的提取核酸包括DNA、RNA两种分子，在细胞中都是以与蛋白质结合的状态存在，核酸提取的主要步骤为：裂解细胞去除与核酸结合的蛋白质以及多糖、脂类等生物大分子，去除其他不需要的核酸分子，如提取DNA分子时，应去除RNA，反之亦然。
沉淀核酸纯化核酸，去除盐类，有机剂等杂质(一)DNA提取的经典方法DNA提取的经典方法，即所谓的酚-氯仿提取法。
因为使用两种不同的有机溶剂交替抽提更容易将蛋白除去，提取次序为酚、酚/氯仿（1：1）、氯仿，这种方法提取的DNA纯度高、片段大、效果好，缺点是较为繁琐。
说明：回收上层水相时，一定不要接触两相的界面，以免将蛋白质等物质吸入新离心管。
沉淀DNA，无水乙醇是首选的有机溶剂。
另：异丙醇、醋酸钠等。
70%乙醇漂洗DNA，是为了去除残余的盐类，去除过量SDS和酚等杂物，因为SDS在70%的乙醇中保持溶解状态，不与DNA共沉淀，从而通过弃上清液去除这种去污剂,避免对以后PCR反应的影响。
TE缓冲液：10mmol/L Tris-Hcl1mmol/L EDTA pH 8.5或8RNA的提取RNA提取条件较DNA要求严格，主要是因为临床标本及实验室环境中，存在大量对RNA 有强烈降解作用RNase。
RNase是一类生物活性非常稳定的酶类。
这种酶耐酸、耐碱、耐高温，如煮沸也不能使之完全失活。
蛋白质变性剂可使之暂时失活，但变性剂去除后，又可恢复活性。
除细胞内RNase以外，环境中灰尘、各种实验器皿和试剂、人体的汗液及唾液中均存在RNase，因此在提取RNA 时，关键要避免RNase对标本的污染及防止RNase对提取的RNA的降解。
1．提取RNA所用器皿的处理及溶液的准备塑料制品：如试管、EP管、Tip头，使用灭菌的一次性用品。
玻璃用品：如烧杯、试管和其他用品，常被RNase污染，使用前必须于180oC干燥8小时以上，或用0.1轕C水(焦碳酸二乙酯)浸泡处理。
DEPC是RNase的强抑制剂，作用机制是通过与蛋白质中的组氨酸结合，使蛋白质变性。
核酸提取与纯化
核酸提取与纯化引言核酸提取与纯化是生物学研究中常用的操作步骤之一。
核酸提取是指从生物样本中分离出DNA或RNA分子，纯化则是指将提取得到的核酸分子除去杂质，获得纯净的核酸样品。
本文将介绍核酸提取与纯化的基本原理、常用方法以及注意事项。
核酸提取原理核酸提取的基本原理是利用生物样本中DNA和RNA分子与其他组分（如蛋白质、细胞壁等）之间的化学或物理性质的差异，将核酸分子从样本中分离出来。
常见的提取方法有有机溶剂法、盐析法和离心法等。
有机溶剂法有机溶剂法是一种常用的核酸提取方法。
其原理是利用有机溶剂（如酚-氯仿混合液）与生物样本中的其他组分之间的亲和性差异，将核酸分子从样本中提取出来。
这种方法操作简单，适用于提取DNA和RNA。
具体操作步骤如下：1.准备生物样本，如细胞培养物或组织样本。
2.加入细胞裂解缓冲液，破坏细胞膜、核膜等结构，释放核酸分子。
3.加入酚-氯仿混合液，与细胞裂解液混合，形成两相体系。
4.离心分离两相，核酸分子会在有机相中分配到有机相中，而其他杂质会在水相中。
5.取出有机相，加入异丙醇或乙醇等沉淀剂，沉淀核酸分子。
6.离心沉淀，弃去上清液。
7.用乙醇洗涤沉淀，去除残留的盐和有机溶剂。
8.干燥沉淀，加入适量的去离子水溶解核酸。
盐析法盐析法是利用核酸分子与盐溶液中的离子交互作用的原理进行分离。
该方法适用于高含量的核酸样本（如DNA或RNA）。
其操作步骤如下：1.准备生物样本，如细胞裂解液。
2.加入适量的盐溶液，使盐浓度达到一定程度。
3.离心分离沉淀，核酸分子会与高浓度盐溶液结合形成沉淀，而其他杂质会在上清液中。
4.取出沉淀，用盐溶液洗涤核酸，去除杂质。
5.干燥沉淀，加入适量的去离子水溶解核酸。
离心法离心法是一种快速分离核酸的方法。
其原理是利用离心力将核酸分子从样本中沉淀下来。
离心法适用于小样本量和快速提取的情况。
具体步骤如下：1.准备生物样本，如细胞裂解液。
2.加入高盐缓冲液，增加核酸与其他组分之间的亲和性差异。
简述核酸疫苗制备过程
简述核酸疫苗制备过程核酸疫苗又称基因疫苗，是指将编码某种抗原蛋白的外源直接导入动物细胞，在宿主细胞中表达并合成抗原蛋白,并激起机体一系列类似于疫苗接种的免疫应答；起到预防和治疗疾病的目的。
自1990年Wolff等人意外发现核酸疫苗后，其相关的研究得到了广泛的重视，并得以迅速发展，誉为“第三次疫苗革命”。
本文就核酸疫苗的构建、特性、免疫机制、接种方式、影响因素、研究现状和前景作一综述。
一核酸疫苗的构建核酸疫苗是由编码病原体抗原的基因和作为真核细胞表达载体的质粒DNA 组成。
病原体抗原的编码基因可以是一组相关基因或单一病原体免疫保护性抗原基因,也可以是编码抗原决定簇的一段DNA序列，其表达产物应是病原体的有效成分,可以引发保护性免疫。
用于构建核酸疫苗的载体质粒多以pUC或pBR322质粒为基本骨架，主要包括启动子、增强子和3’端多聚A。
巨细胞病毒（CMV）启动子和ROUS肉瘤病毒（RSV）的启动子都可在哺乳类细胞内表达。
另外也有人采用来自哺乳动物和禽类的启动子。
Fynan等1993年将编码流感病毒血凝素H或H7的CDNA片段插入CMV质粒的转录调控元件的下游，构建了抗流感病毒的核酸疫苗,另外,乙型肝炎病毒、人免疫缺陷综合症病毒、脑膜炎病毒等基因均被成功地克隆到含CMV启动子的真核表达载体上，并表现了免疫活性。
用于构建核酸疫苗的病毒载体包括流感病毒载体、腺病毒载体、腺病毒相关载体、脊髓灰质炎病毒等。
1994年Castrucci-MR［6]把可以引起保护性免疫反应的致死性淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒（LCMV ）的表位基因片段克隆到流感病毒（H1N1)的基因组中制备核酸疫苗，免疫小鼠后，可使小鼠抵抗致死性淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒的攻击，其免疫效果可维持4个月以上。
二核酸疫苗的特点与传统的灭活疫苗、弱毒疫苗和基因工程疫苗相比,核酸疫苗具有如下特点：(1)免疫效果好,基因疫苗能在宿主细胞中产生外源性蛋白,此种蛋白比原核生物表达系统中产生的蛋白更象天然分子，其抗原识别递呈过程与自然感染十分相似，从而引起几乎等同于感染这些病原体或弱毒疫苗免疫后所产生的免疫应答，并且避免了基因重组技术在体外合成的蛋白质抗原表位丢失或改变。
核酸的分离和纯化
RNA制备前的准备
玻璃器皿 在使用前应180℃烤至少4小时 塑料器皿 用0.1% 焦碳酸二乙酯（DEPC）或用氯仿洗涤 电泳槽 用去污剂洗涤，水冲洗，乙醇干燥，再浸泡于
3%H2O2 液中10分钟，然后0.1%DEPC处理水彻 底冲洗。 配制的溶液应用0.1% DEPC在37℃处理12小时以上，再高 压灭菌去除 DEPC。 不能高压灭菌的溶液用
EDTA/0.1 SDS的试管收集洗脱的RNA溶液。
35
6）按步骤2重新平衡柱子，重复步骤2-4的poly(A)选 择吸附和洗脱过程。
7）调整收集的RNA溶液的乙酸钠浓度至 0.3mol/L, 加2.5倍体积乙醇，移至2个硅化的SW-55离心管 中，-20℃放置过夜 。
8）4℃离心, 30, 000g 30分钟沉淀RNA（极稀浓 度 ）。弃去乙醇，晾干沉淀，重溶于150微升无 RNA酶的TE缓冲液，合并样品。取5微升在70℃ 加热5分钟后，在1%琼脂糖凝胶电泳中检查RNA 的质量。
31
方法 一、异硫氰酸胍法制备总RNA
二、TRIzol试剂提取细胞总RNA
步骤：
1） 组织标本需在预冷的碾钵中捣碎，收获1x106-5x106细
胞, 移入1.5 ml管中。
2） 加TRIzol试剂1 ml，混匀，冰浴5 mins。
3） 加氯仿0.2毫升，混匀，冰浴10 mins。
4） 4℃,10, 000g离心5 mins。
288 kb
痘病毒
196 kb
质体 几~100以上kb
线粒体
藻类 线状
15kb
酵母 环状
19~78 kb
植物 环状 100~150 kb
动物(扁虫到人)环状 15~18 kb
锥虫 网状
第九章核酸的分离与提纯
核酸得种类
脱氧核糖核酸(DNA):细胞核,单链或双链
核糖体RNA
核糖核酸(RNA) 转运RNA 信使RNA
细胞质, 单链或双链
但无论哪核酸,在生物体中一般以核蛋白得形式存在, 因此,为了提取制备核酸,必须将核蛋白解联(即利用接
联剂将核蛋白裂解为核酸和蛋白)并去除蛋白, 同时必须维持核酸得天然性状,不使核酸发生变性或降
常与其她方法结合使用。
5、高通量得RNA分离技术
(1)微量移液法(micropipeting)
由Karrwer等人于1995年建立得一种方法。 特点:此法借助毛细管或微量移液管直接提取细
胞得内含物,进行RNA抽提。
操作过程
用激光移液管拉伸器(1aserpipette puller)将毛细石 英管拉成孔径为l0um得微量移液管,将其顶端弯曲23°, 以便穿透细胞壁。
分离总RNA
分离细胞器DNA RNA poly(A)RNA 特异DNA
感染或转染细胞(病毒型) 转化细菌细胞(质粒型)
分离病毒颗粒
培养转化细胞、收集菌体
病毒载体DNA分离与纯化
破碎细胞
பைடு நூலகம்
质粒DNA分离与纯化
大家学习辛苦了，还是要坚持
继续保持安静
(3)防止核酸得生物降解
细胞内外各种核酸酶可作用于磷酸二酯键,直接破坏核酸得 一级结构,使其降解;
DNA酶需要Mg 2+、Ca 2+得激活,因此实验中常加入 EDTA、柠檬酸盐,以络合核酸酶作用时所必需得Mg 2+离 子,以抑制DNA酶得活性;
制备RNA则需克服核糖核酸酶(RNase)得降解作用。因为 RNase不但分布广泛,极易污染,而且耐高温,即使加热到蛋 白变性, Rnase得活力也不会完全丧失,且具有惊人得回复 力,而细胞内得核蛋白又总就是和她联在一起,若去除不彻底, 她将部分恢复活力,导致RNA降解。
核酸标准品制备
核酸标准品制备
核酸标准品制备是指根据已知浓度和纯度的核酸样品，制备出一系列不同浓度和纯度的标准品，用于验证和校准实验室测定核酸浓度的方法和仪器。
核酸标准品的制备一般包括以下几个步骤：
1. 核酸样品准备：选择已知浓度和纯度的核酸样品，如DNA 或RNA，并进行质量检测和纯化处理，以确保样品的质量和纯度。
2. 稀释：根据需要制备的不同浓度标准品，将核酸样品按照一定比例稀释，得到一系列浓度递增的稀释液。
3. 保存：将制备好的核酸标准品分装到适当的容器中，并储存于低温冰箱或液氮罐中，以防止降解和氧化。
4. 验证和校准：使用制备好的核酸标准品验证和校准实验室测定核酸浓度的方法和仪器。
需要注意的是，核酸标准品的制备需要严格控制样品的质量和纯度，避免污染和降解。
同时，制备过程中要注意配制溶液的严密，避免任何外源性核酸污染。
另外，制备的核酸标准品也需要经过严格的验证和校准，以确保其准确性和可靠性。
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DNA电泳 琼脂糖凝胶浓度和有效分离范围 凝胶浓度（%） 0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0 线性分子大小 （kb） 5~60 1~20 0.8~10 0.5~7 0.4~6 0.2~4 0.1~3
DNA电泳上样缓冲液 为防止样品上漂和指示样品的迁移，DNA样品需要与适当的上样缓冲液 (Loading buffer)混合后上样。
2.肝素 0.1~10mg/ml 37℃时能抑制95%的RNA酶活力 多胺 如精胺、亚精胺等对RNA酶有一定作用 去除蛋白的物质： 蛋白质变性剂 酚、氯仿： 通过变性蛋白质作用， 抑制RNA酶活力 蛋白酶K: 水解蛋白质 去垢剂 SDS、十二烷基肌氨酸钠( sarkosyl)、脱氧胆酸钠(DOC)。 SDS在Na+浓度大于摩尔水平时，容易析出。可以改用sarkosyl。 DOC在乙醇中的溶解度大于SDS。
一般电泳后回收DNA片段，应在360nm波长的紫外灯下操作。
提取方法植物总RNA的一种方法——CTAB法 缓冲液： 2% CTAB 100mmol/L Tris-HCl 20mmol/L EDTA 2% pvp 1.4 mol/L NaCl 0.5g/L 亚精胺 1% 巯基乙醇
方法： 研磨→在缓冲液中裂解5~15min→氯仿抽体两次
0.5-2mol/L LiCl沉淀RNA，4℃过夜 ↓ 离心收获沉淀→0.5%SDS溶解沉淀→氯仿抽提 ↓ 乙醇沉淀 晾干沉淀后，溶于无Rnase的水中 质量要求： 完整RNA电泳应见2~3条带, 28s rRNA、18s rRNA 5s rRNA； 28s rRNA 亮度应约为18s rRNA的两倍。
DNA定量 核酸最大吸收波长在260nm。在260nm紫外光下，光密度值 为1OD时，双链DNA浓度为50ug/ml 。
DNA质量 分子量：高 颜色：白色，酚类物质易氧化后与DNA形成不可逆的复 合物呈褐色，在缓冲液中加抗氧化剂巯基乙醇 、 pvp、 抗坏血酸等 纯度：不含小分子有机物，酚和乙醇的残留可能会对后 继实验步骤产生不利影响。 样品中的RNA可用RNase处理去除。 进一步纯化可用试剂盒，通过亲和层析柱纯化。 DNA保存：TE缓冲液或水中，-4℃或-20℃保存。
贮备液(mol/L) 终浓度(mol/L） 常用无机盐：NaAc 3.0 (pH5.2) 0.3 MgCl2 1.0 0.01 NH4Ac 10.0 2.0-2.5 NaCl 5.0 0.2
准备工作： 压灭提取缓冲液 121℃ 15min 压灭离心管，Tip头等器具 流程： 液氮中研磨 缓冲液中育温( 65-80℃) 酚、氯仿抽提 乙醇、异丙醇沉淀 70%洗沉淀 晾干 破碎细胞壁、细胞膜 破坏细胞膜，变性蛋白 去除蛋白质 收获DNA 去除无机盐、异丙醇 去除乙醇
酚的pH与DNA和RNA分配有关，pH低时DNA容易进入酚相， 抽提DNA的酚溶液的pH值可定在7以上。 在酚溶液中加8-羟基喹啉有以下优点： 减少酚的氧化 提供颜色指示 抑制RNA酶活力 螯合金属离子，抑制DNA酶
沉淀： 去无机小分子，收获DNA 乙醇70%， 阳离存在 下DNA收缩 沉淀 (两倍体积乙醇) 室温、 –20度、 –70度 异丙醇 0.6-1倍体积，不易挥发
生物技术
第三章 核酸样品的制备
1 DNA的制备 DNA的物化性质： 核酸溶于水，不溶于有机溶剂，在细胞核内DNA与蛋白质结合 形成脱氧核糖核蛋白(DNP)。
DNA分子是两性电解质，在生理pH值和碱性条件下磷酸中的H 解离，使DNA带负电荷。 DNA在pH5-9范围内稳定，过酸的条件下DNA会脱嘌呤，脱嘌 呤处易产生断裂，过碱的条件会使DNA解链，DNA提取缓冲 液的pH在7.5-8。 DNA分子易受剪切力而断裂。 DNA 分子在高于90℃时变性。 DNA溶液在260nm处有吸收峰
2 总RNA的制备
RNA制备的原理与制备DNA相似，但RNase不易抑制，容易在 RNA制备过程中造成RNA的降解或不完整，是制备RNA中的主 要障碍，制备RNA主要考虑的问题是如何抑制内源和外源RNase 的活性。
RNA酶： 来自真核、原核细胞。 核糖2位羟基使RNA易水解，RNA酶不需要辅酶， EDTA不能 抑制RNA酶活性。 生物活性非常稳定，耐热、耐酸、耐碱。 空气中、手上、唾液中都带有RNA酶。 蛋白变性剂可使RNA酶暂时失活，去除变性剂后，其活性可 恢复。
6x Loading buffer 0.25% 溴酚蓝 0.25% 二甲苯青 40% 蔗糖 贮存温度 4℃
I
II
0.25% 0.25% 15% 0.25% 0.25% 30%
0.25% 40%
溴酚蓝 二甲苯青 聚蔗糖400 溴酚蓝 二甲苯青 甘油
溴酚蓝 蔗糖
室温
III
4℃
IV
4℃
溴乙锭 (ethidium bromide, EB) 荧光染料，可嵌入双链核酸配对碱基之间，在紫外激发 下，发红色荧光。核酸吸收260nm 紫外线后将能量传给溴乙 锭，溴乙锭本身主要吸收300nm 和360nm 的紫外线的能量， 这二方面能量激发溴乙锭发射出波长为590nm 的红色荧光。 EB-DNA 复合物发出的荧光比游离在凝胶中的 EB 本身发射 的荧光强10 倍。不需洗净背景就能观察到带型。 染色 在凝胶中加入0.5ug/ml EB 0.5ug/ml EB水溶液中浸泡20分钟 DNA最低检出量20ng, RNA最低检出量100ng EB见光分解，存于棕色瓶中4℃保存。
去垢剂 ： SDS、 CTAB 等，破坏细胞膜，解离DNP，变性 蛋白，抑制DNA酶活性
EDTA ： 螯合镁离子， 镁离子是核酸酶的辅酶。 抗氧化剂 ： pvp 、抗坏血酸等、ß -巯基乙醇（变性蛋白质 的作用） NaCl： 调节离子强度、 变性蛋白， 对CTAB法与核酸沉淀有关 DNA提取缓冲液通常在65℃预热、提取过程中缓冲液在65℃ 下 温育20min至数小时。
电泳缓冲液
TAE (Tris.醋酸)：缓冲能力低，阴极易变为碱性，阳极变为酸性。
TBE (Tris.硼酸): 有较好的缓冲能力。硼酸能与琼脂糖形成复合 物而产生电渗。
TPE (Tris.磷酸): 有较好的缓冲能力，回收的DNA片段含较高的 磷酸盐，易与DNA共沉淀，影响一些酶的反应。 E表示EDTA，起保护核酸的作用。
无RNA酶环境的建立
1. 去除外源性RNA酶的污染 带手套、口罩， 在洁净的环境中操作。 器皿、溶液和去离子水等需用0.1%二乙基焦碳酸盐 (diethyl pyrocarbonate, DEPC)处理， 37℃过夜→压灭 20min Tris溶液和饱和酚要用DEPC处理的去离子水配制
DEPC 与蛋白质中组氨酸结合，使蛋白质变性。 能与RNA或单链DNA反应，破坏嘌呤环。 在Tris溶液中，易分解为CO2和乙醇。 DEPC不稳定，高温压灭使其分解成CO2和乙醇。
核酸电泳： pH 8.0~8.3时磷酸全部解离，核酸分子带负电荷，在电场中向正 极运动。DNA和RNA凝胶电泳常用琼脂糖凝胶作为支持物，起 分子筛的作用，琼脂糖含液体量大，可达98-99%，近似自由电 泳，但是样品的扩散度比自由电泳小。
琼脂糖凝胶透明，且不吸收紫外线，可以直接用紫外检测仪作 定量测定。 区带易染色，样品易回收，有利于制备。
操作流程：提取→纯化→沉淀→分析、保存
设备： 离心机 电泳仪、电泳槽 紫外灯 水浴锅 高压灭菌锅 提取： 碎细胞壁 破碎细胞膜，使核酸释放到提取缓冲液中。常用方法 是在液氮中研磨。
低温保存(-70℃)的材料 新鲜材料 粉末 提取缓冲液
DNA提取缓冲液: 缓冲剂： Tris.Cl, Tris是强碱 加浓盐酸调pH至7.5-8.0。
解偶剂(胍类) 异硫氰酸胍、盐酸胍，强蛋白质变性剂，可溶解蛋白质使蛋白 质二级结构消失。在4mol/L异硫氰酸胍和巯基乙醇存在下， RNA酶活性受到极度抑制。可从富含RNA酶的细胞中分离出完 整的RNA。 RNA酶的特异抑制剂(用于cDNA合成) RNasin能与RNA酶非共价结合, 从而抑制RNA酶活力。RNasin 对工具酶无影响，常用于反转录反应。 氧钒核糖核苷复合物 能与多种RNA酶结合，几乎可以完全抑制RNA酶活性。使用浓 度10mmol/L，质量能满足反转录实验的要求。
3种不同波长紫外线在相同条件下照射EB-DNA复合物的结果
光损害效应 产生断链缺口 形成嘧啶二聚体 多 较少 (254的1/15) 多 254的1/84
波长(nm) 灵敏度 254 300
褪色效应 严重 轻微
较高 最高 (254的1.5倍)
366
低 (254的1/5)
最少 (254的1/75)
无
几乎不褪色
经典的纯化方法： 去除蛋白质—— 酚、氯仿抽提 使核蛋白与核酸解聚，使蛋白质变性 去除无机盐——乙醇、异丙醇沉淀
酚/氯仿抽提： 加入等体积 酚/氯仿(1:1), 颠倒离心管使溶液呈乳状，12000g离 心， 取上相。重复抽提过程至有机相与水相界面清楚→等体 积氯仿抽提→ 沉淀。 酚: 酸性、易氧化， 需用Tris.Cl缓冲液平衡。加 0.1% 8-羟基喹啉 ， –20度保存。 酚溶液无色，加入8-羟基喹啉后呈黄色，如溶液 黄色消失或呈粉色，表明有分氧化物存在，不能再用。