常用核酸提取技术介绍复习课件.ppt
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课件
主要步骤：
第一步：细胞的裂解： 破碎细胞，并向溶液中 加入磁珠。
第二步：结合核酸：pH较 低，在高盐环境下，硅胶磁 珠带正电荷，选择性的与优 化试剂中的核酸结合。
课件
第三步：洗涤：用洗涤液 将非核酸成分冲洗分离 （为清洗干净该步骤可以 重复多次）。
第四步：核酸的洗脱：pH 升高，在低盐环境下，核 酸被洗脱下来。
课件
• 特点：操作相对简单，成本低，但 抗干扰能力差，不利于自动化操作。
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2、磁珠吸附法：（以HBV为例）
• 原理：标本经裂解消化后，释放出核酸，核酸与 磁珠结合(特异性的和非特异性的)利用磁珠分离 仪器将核酸提取纯化，作为PCR反应的模板。
• 磁珠其内核为氧化铁，直径0.5-50um不等，一 般广泛应用于DNA、RNA纯化的磁珠为硅质膜 磁珠。磁珠在高盐条件下与核酸结合，而在低盐 环境下被洗脱，可用于全血、组织、细菌、病毒、 植物的核酸纯化。
• 阴离子交换树脂
低盐高pH值结合核酸，高盐低pH值洗脱。 适用于纯度要求高的实验。
• 磁珠
磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的物，从 而达到分离目的。
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常见核酸提取方法简介
1、浓缩煮沸裂解法：（以HBV为例）
50ul浓缩液+50ul血清 12000rpm 10min
弃上清 加入20-Baidu Nhomakorabea0ulDNA裂解液吹打混匀
真核生物的染色体DNA为双链线性分子；
原核生物的“染色体”、质粒及真核细胞器DNA为双 链环状分子；
有些噬菌体DNA有时为单链环状分子；
病毒的DNA、RNA分子，其存在形式多种多样，有双 链环状、单链环状、双链线状及单链线状等。
课件
课件
核酸提取的基本思路
利用DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物 理和化学性质方面的差异提取DNA、RNA， 去除其他成分。
课件
破碎 提取 纯化
I.材料准备 II.破碎细胞或包膜－内容物释放
III.核酸分离、纯化 IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质 V.核酸溶解在适量缓冲液或水中
课件
细胞裂解方式分类：
➢ 物理方式：煮沸法、玻璃珠法、超声波法、
研磨法、冻融法、匀浆法 ➢ 化学方式：表面活性剂（SDS法）、碱裂解法 ➢ 生物方式：酶法（溶菌酶、蛋白酶K等）
纯双链DNA：OD260/OD280≈1.8 (＞1.9,表明有RNA污染；＜1.6，表明有蛋白质、酚等污染）
纯RNA：1.7 ＜OD260/OD280＜2.0 （＜1.7时表明有蛋白质或酚污染；＞2.0时表明可能有异硫 氰酸残存）
课件
核酸样品的保存：
核酸保存的主要条件是温度和介质
温度： 4℃（5℃）最佳和最简单 -70℃是长期保存的良好温度，为一次性保存 -20℃保存
课件
裂解液裂解原理：
➢Tris-HCl （pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏； ➢EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性； ➢NaCl 提供一个高盐环境，使DNA充分溶解，存在于液相中； ➢SDS是一种阴离子去垢剂，在高温（55～100℃）条件下能 裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸；
用乙醇洗干净。 • 乙醇挥发时间一定不要打折扣。 • 加热时要将样品封好口，以免过热时管子
盖崩开进水。
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核酸提取的质量控制
DNA或RNA链上碱基的苯环结构在紫光区具有较强吸收， 其吸收峰在260nm处。波长为260nm时，DNA或RNA的光密 度OD260不仅与总含量有关，也随构型而有差异。当DNA样品 中含有蛋白质、酚或其他小分子污染物时，会影响DNA吸光度 的准确测定。一般情况下同时检测同一样品的OD260、OD280 和OD230，计算其比值来衡量样品的纯度。
课件
常见样本提取方法总结：
➢ 浓盐法：
利用RNA和DNA在盐溶液中溶解度不同，将二者分离
➢ 有机溶剂抽提法：
有机溶剂作为蛋白变性剂，同时抑制核酸酶的降解作用
➢ 密度梯度离心法：
利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物
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➢ 吸附材料结合法：
• 硅质材料
高盐低pH值结合核酸，低盐高pH值洗脱。 快捷高效。
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• 特点：特异性好，抗干扰能力强， 易于实现半自动和全自动操作。
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3、硅胶柱吸附法：（以肿瘤标本为例）
• 原理：采用硅胶膜吸附核酸，而对其他生 化组分如蛋白质、多糖、脂类既不相亲也 不吸附，因而可得到纯化的核酸。
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主要步骤：
样品
化学裂解
洗涤
洗脱
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注意事项： • 二甲苯有毒且对后续试验有影响，一定要
100℃ 10min
12000rpm 5min 取上清加样
浓缩液主要成分：聚乙二醇（ PEG） 、NaCl 裂解液主要成分：Tris-HCl、ED课TA件 、 NaCl、SDS
聚乙二醇（ PEG）
• HOCH2(CH2OCH2)nCH2OH,n＞4 • PEG为有机聚合物，无毒，亲水性强，相
对分子量为6K-20K；PEG的沉淀效果主要 与其本身的浓度和分子量有关，同时还受 离子强度、溶液pH值和温度等因素的影响， 采用该方法可将病毒量浓缩10倍以上。
保存介质： TE缓冲溶液(最常用) 10mmol/L Tris-Cl pH8.0 1mmol/L EDTA pH8.0
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谢谢！
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核酸提取的原则
提取纯化核酸总的原则： ①应保证核酸一级结构的完整性； ②排除其它分子的污染。
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核酸提取应达到的要求： ①核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高 浓度的金属离子； ②其它生物大分子的污染应降低到最低程度； ③排除其它核酸分子的污染。
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核酸提取应注意的问题： ①尽量简化操作步骤，缩短提取过程。 ②减少化学因素对核酸的降解。 ③减少物理因素对核酸的降解：机械剪切力和高温 ④防止核酸的生物降解。
常用核酸提取技术介绍
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前言
核酸（nucleic acid）是遗传信息的携带者， 是基因表达的物质基础。
无论是进行核酸结构还是功能研究，首先需 要对核酸进行分离和纯化。
核酸样品质量将直接关系到实验的成败。
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核酸的存在形式
核酸包括DNA、RNA两种分子，在细胞中都是以与蛋 白质结合的状态存在；
主要步骤：
第一步：细胞的裂解： 破碎细胞，并向溶液中 加入磁珠。
第二步：结合核酸：pH较 低，在高盐环境下，硅胶磁 珠带正电荷，选择性的与优 化试剂中的核酸结合。
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第三步：洗涤：用洗涤液 将非核酸成分冲洗分离 （为清洗干净该步骤可以 重复多次）。
第四步：核酸的洗脱：pH 升高，在低盐环境下，核 酸被洗脱下来。
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• 特点：操作相对简单，成本低，但 抗干扰能力差，不利于自动化操作。
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2、磁珠吸附法：（以HBV为例）
• 原理：标本经裂解消化后，释放出核酸，核酸与 磁珠结合(特异性的和非特异性的)利用磁珠分离 仪器将核酸提取纯化，作为PCR反应的模板。
• 磁珠其内核为氧化铁，直径0.5-50um不等，一 般广泛应用于DNA、RNA纯化的磁珠为硅质膜 磁珠。磁珠在高盐条件下与核酸结合，而在低盐 环境下被洗脱，可用于全血、组织、细菌、病毒、 植物的核酸纯化。
• 阴离子交换树脂
低盐高pH值结合核酸，高盐低pH值洗脱。 适用于纯度要求高的实验。
• 磁珠
磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的物，从 而达到分离目的。
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常见核酸提取方法简介
1、浓缩煮沸裂解法：（以HBV为例）
50ul浓缩液+50ul血清 12000rpm 10min
弃上清 加入20-Baidu Nhomakorabea0ulDNA裂解液吹打混匀
真核生物的染色体DNA为双链线性分子；
原核生物的“染色体”、质粒及真核细胞器DNA为双 链环状分子；
有些噬菌体DNA有时为单链环状分子；
病毒的DNA、RNA分子，其存在形式多种多样，有双 链环状、单链环状、双链线状及单链线状等。
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核酸提取的基本思路
利用DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物 理和化学性质方面的差异提取DNA、RNA， 去除其他成分。
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破碎 提取 纯化
I.材料准备 II.破碎细胞或包膜－内容物释放
III.核酸分离、纯化 IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质 V.核酸溶解在适量缓冲液或水中
课件
细胞裂解方式分类：
➢ 物理方式：煮沸法、玻璃珠法、超声波法、
研磨法、冻融法、匀浆法 ➢ 化学方式：表面活性剂（SDS法）、碱裂解法 ➢ 生物方式：酶法（溶菌酶、蛋白酶K等）
纯双链DNA：OD260/OD280≈1.8 (＞1.9,表明有RNA污染；＜1.6，表明有蛋白质、酚等污染）
纯RNA：1.7 ＜OD260/OD280＜2.0 （＜1.7时表明有蛋白质或酚污染；＞2.0时表明可能有异硫 氰酸残存）
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核酸样品的保存：
核酸保存的主要条件是温度和介质
温度： 4℃（5℃）最佳和最简单 -70℃是长期保存的良好温度，为一次性保存 -20℃保存
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裂解液裂解原理：
➢Tris-HCl （pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏； ➢EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性； ➢NaCl 提供一个高盐环境，使DNA充分溶解，存在于液相中； ➢SDS是一种阴离子去垢剂，在高温（55～100℃）条件下能 裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸；
用乙醇洗干净。 • 乙醇挥发时间一定不要打折扣。 • 加热时要将样品封好口，以免过热时管子
盖崩开进水。
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核酸提取的质量控制
DNA或RNA链上碱基的苯环结构在紫光区具有较强吸收， 其吸收峰在260nm处。波长为260nm时，DNA或RNA的光密 度OD260不仅与总含量有关，也随构型而有差异。当DNA样品 中含有蛋白质、酚或其他小分子污染物时，会影响DNA吸光度 的准确测定。一般情况下同时检测同一样品的OD260、OD280 和OD230，计算其比值来衡量样品的纯度。
课件
常见样本提取方法总结：
➢ 浓盐法：
利用RNA和DNA在盐溶液中溶解度不同，将二者分离
➢ 有机溶剂抽提法：
有机溶剂作为蛋白变性剂，同时抑制核酸酶的降解作用
➢ 密度梯度离心法：
利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物
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➢ 吸附材料结合法：
• 硅质材料
高盐低pH值结合核酸，低盐高pH值洗脱。 快捷高效。
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• 特点：特异性好，抗干扰能力强， 易于实现半自动和全自动操作。
课件
3、硅胶柱吸附法：（以肿瘤标本为例）
• 原理：采用硅胶膜吸附核酸，而对其他生 化组分如蛋白质、多糖、脂类既不相亲也 不吸附，因而可得到纯化的核酸。
课件
主要步骤：
样品
化学裂解
洗涤
洗脱
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注意事项： • 二甲苯有毒且对后续试验有影响，一定要
100℃ 10min
12000rpm 5min 取上清加样
浓缩液主要成分：聚乙二醇（ PEG） 、NaCl 裂解液主要成分：Tris-HCl、ED课TA件 、 NaCl、SDS
聚乙二醇（ PEG）
• HOCH2(CH2OCH2)nCH2OH,n＞4 • PEG为有机聚合物，无毒，亲水性强，相
对分子量为6K-20K；PEG的沉淀效果主要 与其本身的浓度和分子量有关，同时还受 离子强度、溶液pH值和温度等因素的影响， 采用该方法可将病毒量浓缩10倍以上。
保存介质： TE缓冲溶液(最常用) 10mmol/L Tris-Cl pH8.0 1mmol/L EDTA pH8.0
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谢谢！
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核酸提取的原则
提取纯化核酸总的原则： ①应保证核酸一级结构的完整性； ②排除其它分子的污染。
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核酸提取应达到的要求： ①核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高 浓度的金属离子； ②其它生物大分子的污染应降低到最低程度； ③排除其它核酸分子的污染。
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核酸提取应注意的问题： ①尽量简化操作步骤，缩短提取过程。 ②减少化学因素对核酸的降解。 ③减少物理因素对核酸的降解：机械剪切力和高温 ④防止核酸的生物降解。
常用核酸提取技术介绍
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前言
核酸（nucleic acid）是遗传信息的携带者， 是基因表达的物质基础。
无论是进行核酸结构还是功能研究，首先需 要对核酸进行分离和纯化。
核酸样品质量将直接关系到实验的成败。
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核酸的存在形式
核酸包括DNA、RNA两种分子，在细胞中都是以与蛋 白质结合的状态存在；