临床PCR检验室内质控李金明
李金明 个体化医学检测质量保证指南 简
（4）样本运送和保存中的生物安全。
样本的采集、运送和保存（2）
（5）样本运送温度和时间的要求。DNA检测样本，可室温下运送， 建议8h内送至实验室。靶核酸为RNA时，10 min可室温运送，如所需 运送时间较长，则应将样本置于冰上，必须保证样本与冰屑充分接触， 且冰屑应达到样本的高度，建议采集后4h内送到。 冰冻组织样本最好 保证其在运送过程中不发生融化，石蜡包埋组织则可在室温下运送。
基因扩增仪器设备的质控
仪器设备
扩增仪
加样器 水浴箱 酶标仪
质控方法
频度
仪器校验实验 当仪器移动时
热电偶监测温度 每月一次
扩增功能检测 每 4 个月一次
程序打印
校准
温度检测
预防性维护 及校准
每次测定时 每年 2 次 每次实验 每年 2 次
失控标准
实验失败 如靶温度或温度 差异超出允许范 围
待测孔未出现扩 增，检测温度
（通过检查和提供客观证据证明，对一特 定预期用途的要求始终能得到满足）
The FDA and ISO terms for verification and are similar, with the distinction having to do with intended use. （性能验证和性能确认 FDA和ISO术语相似，差异在后者的“预期 用途”）
实验室应根据自己的检验项目、所采用的检测技术平台和工作量来决定分区的多 少及各区域的空间大小。
至少具体需要多少个区，同样是“个体化”的，以“工作有序、互不干扰、防 止污染、报告及时“作为基本原则。
临床免疫检验的室内质量控制
荷兰红十字输血服务部中心实验室（CLB） 关节炎基金会（AF）的血清学委员会与美国疾病预防和控制中心
研制者 NIBSC发布年 源自985(ad)编号 1st IS
NIBSC NIBSC
2003(adw2,genetype 00/588(2st IS) A)
2003
03/062(1st IR panel)
Sanquin NIBSC Sanquin NIBSC NIBSC NIBSC NIBSC
1977 1992 1998 1990 1958 2003 1996
临床免疫检验的室内质量控制
李金明 国家卫生健康委员会临床检验中心
Tel.010-58115061 Email: jmli@ 2018.05.22-24. 全国临床免疫检验质量保证大会 南京
?
临床免疫检验的参考物质（标准物质和质控品）? 室内质量控制（IQC）的“初心” ? 室内质量控制（IQC）的“永远在路上” ? 室内质量控制（IQC）与“性能验证”之间的关系是什么? 定性免疫检验与定量免疫检验的IQC有何异同? 室内质量控制1.0、2.0、3.0?
生物活性物质的特点
具有复杂的分子结构 不能单独使用物理化学方法定值 用于疾病的诊疗和预防
标准化组织
世界卫生组织（WHO）生物学标准化专家委员会（The Expert Committee on Biological Standardisation, ECBS）：负责建立生物 物质的国际标准及参比材料。
w1042 90/636 w1041 95/584 HS 01/600 RUBI-1-94
感染性疾病免疫测定的室内质量控制
感染性疾病免疫测定的室内质量控制
李金明
【期刊名称】《医学检验与临床》
【年(卷),期】2007(018)001
【摘要】@@ 室内质量控制(internal Quality Control,IQC):由实验室工作人员采取一定的方法步骤,连续评价本实验室工作的可靠性程度,旨在监测和控制本室常规工作的精密度,提高本室常规工作中批内、批间样本检验的一致性,以确定测定结果是否可靠、可否发出报告的一项工作.
【总页数】4页(P3-6)
【作者】李金明
【作者单位】卫生部临床检验中心
【正文语种】中文
【中图分类】R4
【相关文献】
1.反复感染性疾病患儿的免疫测定分析 [J], 史恪勤
2.反复感染性疾病患儿的体液和细胞免疫测定 [J], 黄永坤;段晶;王志光;李海林;何雯;贺湘英
3.放射免疫测定室内质量控制的应用方法 [J], 尹石华;宋世云
4.反复感染性疾病患儿的免疫测定分析 [J], 史恪勤
5.荧光免疫测定法与酶免疫测定法、放射免疫测定法对庆大霉素的测定比较 [J], 解向群
因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
临床_PCR_实验室质量管理体系的建立
临床PCR实验室质量管理体系的建立卫生部临床检验中心李金明《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》（卫医发[2002]10号）是到目前为止卫生部针对一项检验技术的临床应用管理下发的第一个法规性文件，要求临床PCR实验室，不但在实验室设置及仪器设备等硬件上要满足开展临床检验的条件，而且要求实验室在日常工作要有文件化的工作程序。
对于临床实验室来说，这是从来没有过的。
我们的检验科多少年来遵循的都是一种固定的经验管理模式，对日常检验工作，通常缺乏一个文件化的程序，只是购买到商品试剂盒以后，按照试剂盒的说明书去进行检验，对试剂盒本身也缺乏相应的质检，日常检验基本上是完成即可，至于完成的质量怎么样，心中无数，只能从临床大夫和患者投诉的多少来做判断。
做得好一点的检验科，还多少有一点室内质控，或是参加了室间质评，做得差的，很多检验项目根本就没有室内质控。
但近年来，随着临床实验室质量保证的概念逐步地进入我们的临床检验实践，我国临床检验正进入到一个规范化和标准化的时代，尤其是临床PCR实验室，起到了一个很好的领头和示范作用。
在全国，一大批从事临床PCR检验的专家和同道，在他们的日常工作和申请实验室验收过程中，总结经验，建立了不但在形式而且在实质上符合当今实验室质量管理模式的临床PCR实验室。
本处的许多叙述，有本人的一些体会和理解，但很多的概念应该说是来自于我们全国各实验室的同行们实际工作经验的启发。
一、实验室质量管理概述实验室质量管理是说起来容易，做起来难。
要说吧，其基本内容也就四句话，就是写你所应做的，做你所写的，记录你已做的和分析你已做的。
所谓写你所应做的，就是将在实验室检测中要做的事以文件化的形式表述出来，形成一个实验室的质量管理文件，通常包括质量手册、质量体系程序文件和标准操作程序（SOP）等。
质量手册的基本定义是：阐明一个实验室的质量方针，并描述其质量体系的文件。
其主要内容包括目录、批准页、前言、质量方针、组织结构、人员职责、实验室设施环境、仪器设备、溯源性、检验方法、标本管理、记录、报告等，是对上述各方面质量管理的一般性描述。
临床免疫测定的质量控制及结果的可比性-李金明
AF-CDC
AF-CDC AF-CDC
抗PM/Scl 抗体
抗SSA/Ro抗体
ANA#11（2310）
Lot#C103BG 滴度1:4~1:32
AF-CDC
CAP
乙型肝炎表面抗原国家标准物质
项目 研制者 发布年 编 号 浓 度 （IU/ml)
临床免疫测定的质量控制 及结果的可比性
李金明 卫生部临床检验中心
《卫生部办公厅关于医疗机构间医学检验、医学 影像检查互认有关问题的通知》（卫办医发 〔2006〕32号）
•
•
对于参加国家级质量控制和省级质量控制的、 稳定性好、质量比较容易控制和费用较高的检 查项目，应当组织辖区内有条件的医院间逐步 开展检查互认工作。 对于参加国家级质量控制的检查项目，有条件 的省、自治区、直辖市之间可以探索开展检查 互认；参加省级质量控制的检查项目，可以在 本省、自治区、直辖市范围内实行检查互认。
实验室设施、仪器设备及管理
实验室空间及工作流程的设计 实验室环境条件的控制：温湿度控制设 备、稳压或不间断电源 仪器设备及管理：酶标仪、洗板机、全 自动免疫分析仪、加样器等应建立技术 档案，并定期维护和校准
实验室环境条件的控制和监控
实验室温度和湿度的记录及其意义 温度和湿度计的放置
实验台（仪器设 备）
定量测定的标准物质
项目
人血清补体C1q, C4, C5, B因子，和总功能补体 CH50 人血清免疫球蛋白G，A和M(IgG, IgA and IgM) 人血清免疫球蛋白E 甲胎蛋白（AFP）
/pr oducts
编 号
临床基因扩增检验实验室的设置及技术验收(下)
临床基因扩增检验实验室的设置及技术验收(下) 李金明 卫生部临床检验中心 100730二． 设施和环境本章包括五条。
要求实验室具备良好的工作环境，即在照明、工作空间、能 源、温控、通风等方面必须能满足检测要求，配备温湿度计和稳压电源等。
要求实验室建立实验室管理制度和措施，对实验室的进入、使用、清洁、管理、废弃血清处理和生物防护等方面作出明确规定。
本章的重点是实验室的设施和环境条件能否满足临床基因扩增检验的要求。
2.1主要是检查实验室的空间、照明、空调系统以及通风系统，各区都应有足够的空间，良好的照明，有符合要求的空调设备以及良好的通风。
2.2较为简单，就是看实验室各区是否配备有温湿度计及是否有温湿度记录本，在扩增区，扩增仪是否配备有稳压电源。
2.3是检查实验室是否有明确的标识对人员进入进行限制和控制，如人员进入控制标识、生物传染危险性标识等。
2.4则看实验室是否有实验室管理制度、实验室清洁程序以及相应的设施，即是否每一个实验区内都有其专用的清洁用具如拖把、抹布等，以及是否规定实验室的清洁亦应遵循试剂准备区→标本制备区→扩增区→产物分析区的单一流向。
2.5检查是否有生物污染物处理的程序及设施和生物防护的程序及设施等，对于设施即看是否有用于生物污染物处理的垃圾袋、消毒桶或高压锅（如果程序规定需要高压的话）；生物防护设施即为口罩、防护衣、手套、眼罩、消毒液、75%乙醇、自来水或生物安全柜等。
曾有同道问，临床基因扩增检验实验室到底需要多大面积？具体多少面积不太好界定，因为实验室可大可小，原则只有一个，就是要能满足自己的工作要求，应为实验操作人员提供一个良好舒适的工作环境，试想如果一个工作环境给你的感觉是一塌糊涂，能做好临床标本的检验吗？三．人员本章包括三条。
要求在临床基因扩增检验实验室工作的实验操作人员必须经过培训并取得上岗证，此外，实验室还应有自己的年度培训计划，保证实验室人员能不断得到培训。
实验室应保存其全部工作人员的技术业绩档案。
高通量测序技术临床应用的质量管理与标准化(李金明)
高通量测序技术临床应用的质量管理与标准化李金明国家卫生计生委临床检验中心全国cfDNA检测标准化高峰论坛2016.11.23-24 长沙基因测序技术的发展●1953年：DNA双股螺旋的发现（英国剑桥大学James Watson 和Francis Crick ）●1965年：酵母tRNA测序（美国Comell大学Rober Holley，小片段重叠法）●1971年：λ噬菌体两个粘性末端的完整序列（吴瑞博士，华裔分子生物学专家，引物延伸测序）●1975年：加减法DNA测序（英国剑桥大学Fred ）●1977年：Sanger测序（英国剑桥大学Fred Sanger）和Maxam-Gillbert DNA化学降解法测序(美国哈佛Alan Maxam &Walter Gilbert）●1996年：焦磷酸测序（瑞典皇家技术研究所Ronaghi M等）●2005年:Genome Sequencer20新一代测序仪(大规模并行焦磷酸合成测序法，454life Science公司的创始人Jonathan Rothberg)●2007年:454、Solexa公司和Agencourt（SoliD测序仪）公司分别被Roche、illumina和ABI公司收购。
新一代测序技术（next-generation sequencing）2007年被Nature Methods评为生物领域影响力最大的技术精准医学不等于高通量测序高通量测序是目前精准医学实践最为成熟的支撑技术高通量测序技术的临床应用●染色体非整倍体无创产前筛查（NIPT）●胚胎植入前遗传学筛查（Preimplantation GeneticScreening，PGS）和胚胎植入前基因诊断（Preimplantation Genetic Dignosis，PGD）●肿瘤靶向治疗基因突变检测●单基因遗传病检测●病原微生物检测：如HPV基因分型、宏基因组（Metagenomics）测序●┈┈高通量测序技术临床应用的质量管理与标准化●国家卫生计生委医政医管局高通量测序临床应用试点实验室：评审标准、评审、试点实验室基本要求、管理试点实验室●2015年增加质评调查：全国肿瘤诊断与治疗高通量测序检测●2016年新增质评计划：染色体非整倍体（21、13、18）无创产筛●2016年质评调查：肿瘤游离DNA（ctDNA）检测●2017年正式开展：全国肿瘤基因突变高通量测序（组织样本）检测质评计划批准的第一批四个专业的试点单位全面质量管理？●写你所应做的●做你所写的●记录你已做的●分析你已做的以ISO的标准如ISO15189为标志的！标准化？标准化是对实际与潜在的问题作出统一规定，供共同和反复使用，以在预定的领域内获取最佳秩序和效益的活动。
临床PCR实验室的设计及质量管理体系的建立 李金明
临床PCＲ实验室得设计及质量管理体系得建立卫生部临床检验中心李金明核酸（DＮA与ＲNA）就是生命现象得基础。
小到病毒、细菌等微生物,大到动植物与人类，都无一例外.因为主导生命活动得受体、细胞因子、酶、激素等均不过就是核酸发挥功能作用得表型,均由核酸决定，在核苷酸序列上哪怕就是单个碱基得变异，都会引起表型得完全改变,并进而影响生命功能得发挥，导致疾病得发生。
因此,在核酸或称为基因水平上检测,对临床疾病本质得揭示就要更深一步。
也正因为核酸就是生物体生命活动之源,对于感染性病原体得检测,从核酸着手,最能反映病原体在机体内得出现与消长．自从美国Ceｔｕs公司Mullis博士在19８3年发明聚合酶链反应（PＣR)这种核酸扩增技术以来，由于其极高得检测灵敏度与特异性，因而在临床感染性疾病、遗传病、肿瘤等得诊断与疗效观察上得到了广泛得应用,在器官移植得基因配型上也就是难以替代得技术。
其应用大大提高了上述疾病诊断得准确性与快速性.但临床PＣR检验必须按规范要求进行,并有严格得实验室质量管理,否则,因其极高得检测灵敏度,实验室稍有以前扩增产物得污染，或在标本核酸提取过程中标本间得交叉污染,均可导致假阳性结果得出现。
同时，也会因为试剂与实验消耗品得质量不过关、仪器设备得维护校准不到位，或操作得不规范等,也很容易出现假阴性结果．第一节临床PCR实验室得分区规划设计如何规划设计一个合格得实验室就是每一个临床PCR实验室首先要遇到得问题，因为一个实验室一旦经过设计并完成装修,如不符合要求,则会出现很大得麻烦，甚至不得不拆了重来。
那么怎样才能设计一个合格得实验室呢？简单地说,就就是十六个字,“各区独立、注意风向、因地制宜、方便工作"．同时要注意临床标本得接收问题。
对于临床ＰCR实验室得分区及其设备配置,卫生部颁发得《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》(卫医发[20０２］10号）中作了明确规定,并且卫生临床检验中心发出得配套文件《临床基因扩增检验实验室工作规范》（卫检字[20０２]８号）又对各区得功能及注意事项作了阐述。
1. 李金明-个体化医学检测实验室规范化管理(简)
HLA-B*5701 PML/RARα
抗病毒 TPMT
风湿病
肌肉骨骼疾病 精神类疾病 神经系统疾病
卡利普多
西酞普兰、安定 氯巴占 克拉匹多、普拉格雷、替格瑞洛 右兰索拉唑、艾美拉唑、奥美拉唑、泮托拉唑、雷贝拉唑 曲螺酮、乙炔雌二醇 伏立康唑 塞来昔布
CYP2C19
诊断医学
70%以上信息 来自实验室 分子诊断对 检验医学的 划时代意义！
个体化医疗 （personalized medicine) 精准医疗 （precision medicine） 移动医疗 数字医疗
预测
诊断
监测
预后
目前国内的临床分子诊断现状
绝大部分用于病原体核酸检测
较少部分用于遗传病的产前诊断
相关药物
波西普韦、聚乙二醇化干扰素α-2b、特拉匹韦 Brentuximab vedotin(SGN-35) 卡培他滨 卡马西平、苯妥英 阿巴卡韦 依维莫司、拉帕替尼、帕尼珠单抗、曲妥珠单抗 伊马替尼、舒尼替尼 白消安、达沙替尼、伊马替尼、尼罗替尼 克罗米芬 可唑替尼 地尼白介素 右兰索拉唑 伊马替尼 茚达特罗 伊立替康 异山梨醇、肼屈嗪 利福平、异烟肼、吡嗪酰胺 秦铭泽 来那度胺 马拉韦罗 霉酚酸 普伐他汀 苯乙酸钠、苯甲酸钠、苯丁酸钠
HER2/NEU
C-Kit Ph染色体 Rh基因型 ALK CD25 CYP1A2 PDGFR UGT1A1
结肠癌
心血管系统疾病 抗感染 肺部疾病 脊髓增生异常综合征 AIDS 移植 代谢及内分泌系统疾病 胃肠道疾病
分子诊断的概念
采用分子生物学方法（基因扩增、测序、杂交
、蛋白质组分析、代谢组学分析等）检测患者
体内特定遗传物质的结构或表达水平的变化而 做出的诊断。分子诊断的靶标包括DNA、 RNA、蛋白质和小分子代谢物。
PCR室室内质控标准操作程序
PCR室室内质控标准操作程序1.目的控制实验的重复性、精密度，并检测其准确度的改变，提高本室常规工作中的批间、批内标本检测的一致性。
2. 适用范围本程序适用临床基因扩增检验质量负责人和检验人员对DNA和RNA分析的室内质量控制。
3．制定依据《临床基因扩增检验技术》申子瑜李金明主编人民卫生出版社2002年第一版4. 职责实验室质量负责人和检验人员负责本规程的执行。
评估检测结果正确与否，判定当日结果是否可以被采用。
5、操作步骤5.1血清质量控制品a)质控品的来源：卫生部临检中心或试剂盒内质控品。
b)质控品与样本同时处理，排列顺序为：标准品或校准品，阴性质控品，阳性质控品，临床样本。
c)质控品的处理及分析判断。
d)实验结果的判断：实验结果合格，即发报告；实验结果不合格，报告室主任，会同有关人员，查找原因，妥善解决。
e) 记录每次检测质控结果。
f) 记录失控原因及纠正措施。
5.2室内质控图的使用方法：①描点：a）图中X线为靶线，X±2s为警告线，X±3s为失控线。
对于同一批号的质控血清不论使用几个月，其空图均不变化。
只要将图纸上方“起止日期”项填入每个月的实际起止日期即可。
b）每天将该批号质控血清按有关规定程序复融随同病人的标本同时检测。
将日期、检测结果和操作者如实记录在图下方的相应位置，并按前面的方法画出图上的对应点，用直线将该点与前一天的点连接。
c）月底计算当月全部质控血清检测结果的X、s和CV，并进行图形分析和小结，将质量控制图存入质控资料档案。
②图形分析a）如果在X±3s线以外，则为失控，应立即报告有关负责人，迅速查找原因。
必要时复测标本，然后方可发出报告，并将失控情况、查找过程及处理结果等详细记录。
b）如果在X±2s线以外，或出现连续6点以上在一侧等规律变化，均应立即向有关负责人反映，并积极查找原因。
但当天的检验结果一般可以发出。
③通过观察图形的规律性变化进行误差分析，消除误差来源a）曲线漂移：提示有系统误差，准确度发生了一次性的向上或向下改变。
定性测定的性能验证--李金明
分布)
直接概率计算方法（不呈正态分布）
室内质量控制的评价
IQC是一个集体活动，不光是对实验室一次测 定的有效性的判断，也反应了实验室测定趋势 的变化。 IQC的失控不能做为处罚的依据，应建设性的 找出失控的原因，针对其采取措施加以改进。 对IQC应定期进行评价。
50
94,050
9500/[9500+4500]=67.9% 85500/[85500+500]=99.4%
950/[950+4950]=16% 94050/[94050+50]=99.9%
样本的准备
质控品：使用商品化质控物进行，包括阴性和 阳性。
样本的采集和保存：采集时间、保存方式等必 须保证一致性。
Grayzone
5% Lower 95% Interval Cutoff
5% Upper 95% Interval
结论
临界浓度如果准确，样品重复检测应获得50%的阳性和50%的阴性结 果。 如果+20%的样本获得阳性结果的次数≥95%，并且-20%的样本获得 阴性结果的次数≥95%，那么这个范围位于或超出这种方法的95%区 间。因而，距离临界浓度≥20%的样本可用此种方法获得一致的结果。
‚批（RUN）‛的概念
在相同的条件下（地点、仪器、试剂、人员、 时间）所进行的一组测定。
定性免疫测定质控物浓度的选择
可选择S/CO值减去精密度测定中得到的三倍 批间CV（通常的ELISA测定批间变异（CV%） 在15%左右）与该S/CO值的乘积（意即三倍 SD）仍大于1的质控血清作监测重复性的室内 质控用 计算公式：S/CO（1-3CV%）=S/CO-3SD S/CO比值可在1.5~4之间。 同时选择S/CO处于1.0~1.5左右的质控血清以 判断每次测定时试剂盒测定下限的有效性。
pcr质控介绍
“即刻法”质控方法的实质是一
种统计学方法，即Grubs异常值 取舍法 ； 只要有3个以上的数据即可决定 是否有异常值的存在。
“假阳性”的统计学室内质控方法
基于日常检验的阳性率比值(呈正态
分布)
直接概率计算方法（不呈正态分布）
基于日常检验的阳性率比值
半Levey-Jennings质控图法
在增加一倍阴性质控样本的情况下重新检测。
可能的几种失控表现
曲线向上漂移：提示出现污染，污染可能 是由于某一天操作上的失误导致实验室被 污染如标本泄漏，产物泄漏，试剂被污染 等 向上的趋势性变化：可能存在累积性的产 物污染，实验室扩增产物逐渐累积，从而 使病人结果的阳性率逐渐增高。此时实验 室需要进行彻底清洁。
阴性质控样本的种类
阴性原血清样本 实验过程中带入的空管
仅含扩增反应混合液的管
阴性原血清样本的功能
监测实验室的以前扩增产物的“污染” 由实验操作所致的标本间的交叉污染。 具体地说，如强阳性标本气溶胶经加 样器所致的污染、强阳性标本经操作 者的手所致的污染、使用翻盖离心管 核酸提取时在较高温孵育时盖子崩开 等 扩增反应试剂的污染。
直接概率计算法
按统计学规律，一个事件发生的概率小于5%被 称为小概率事件，即发生的可能性很小。 当一个小概率事件发生时，则可能有误差存在， 有必要对其发生的原因进行分析。 对每天的日常病人结果中阳性率出现的概率进 行计算，如果这种结果出现的概率小于5%时， 则可判为失控。
根据二项式分布的概率计算
仪器设备及管理
PCR仪、离心机、加样器、恒温设备等
应建立技术档案，并定期维护;PCR仪、
加样器、恒温设备应定期进行校准
高通量测序技术临床应用的质量管理与标准化(李金明)
高通量测序技术临床应用的质量管理与标准化李金明国家卫生计生委临床检验中心全国cfDNA检测标准化高峰论坛2016.11.23-24 长沙基因测序技术的发展●1953年：DNA双股螺旋的发现（英国剑桥大学James Watson 和Francis Crick ）●1965年：酵母tRNA测序（美国Comell大学Rober Holley，小片段重叠法）●1971年：λ噬菌体两个粘性末端的完整序列（吴瑞博士，华裔分子生物学专家，引物延伸测序）●1975年：加减法DNA测序（英国剑桥大学Fred ）●1977年：Sanger测序（英国剑桥大学Fred Sanger）和Maxam-Gillbert DNA化学降解法测序(美国哈佛Alan Maxam &Walter Gilbert）●1996年：焦磷酸测序（瑞典皇家技术研究所Ronaghi M等）●2005年:Genome Sequencer20新一代测序仪(大规模并行焦磷酸合成测序法，454life Science公司的创始人Jonathan Rothberg)●2007年:454、Solexa公司和Agencourt（SoliD测序仪）公司分别被Roche、illumina和ABI公司收购。
新一代测序技术（next-generation sequencing）2007年被Nature Methods评为生物领域影响力最大的技术精准医学不等于高通量测序高通量测序是目前精准医学实践最为成熟的支撑技术高通量测序技术的临床应用●染色体非整倍体无创产前筛查（NIPT）●胚胎植入前遗传学筛查（Preimplantation GeneticScreening，PGS）和胚胎植入前基因诊断（Preimplantation Genetic Dignosis，PGD）●肿瘤靶向治疗基因突变检测●单基因遗传病检测●病原微生物检测：如HPV基因分型、宏基因组（Metagenomics）测序●┈┈高通量测序技术临床应用的质量管理与标准化●国家卫生计生委医政医管局高通量测序临床应用试点实验室：评审标准、评审、试点实验室基本要求、管理试点实验室●2015年增加质评调查：全国肿瘤诊断与治疗高通量测序检测●2016年新增质评计划：染色体非整倍体（21、13、18）无创产筛●2016年质评调查：肿瘤游离DNA（ctDNA）检测●2017年正式开展：全国肿瘤基因突变高通量测序（组织样本）检测质评计划批准的第一批四个专业的试点单位全面质量管理？●写你所应做的●做你所写的●记录你已做的●分析你已做的以ISO的标准如ISO15189为标志的！标准化？标准化是对实际与潜在的问题作出统一规定，供共同和反复使用，以在预定的领域内获取最佳秩序和效益的活动。
临床PCR检验的室内质控2017版-李金明共56页文档
谢谢！
临床PCR检验的室内质控2017版-李金明
1、合法而稳定的权力在使用得当时很 少遇到 抵抗。 ——塞 ·约翰 逊 2、权力会使人渐渐失去温厚善良的美 德。— —伯克
3、最大限度地行使权力总是令人反感 ；权力 不易确 定之处 始终存 在着危 险。— —塞·约翰逊 4、权力会奴化一切。——塔西佗
5、虽然权力是一头固执的熊，可是金 子可以 拉着它 的鼻子 走。— —莎士 比
21、要知道对好事的称颂过于夸大，也会招来人们的反感轻蔑和嫉妒。——培根 22、业精于勤，荒于嬉；行成于思，毁于随。——韩愈
23、一切节省，归根到底都归结为时间的节省。——马克思 24、意志命运往往背道而驰，决心到最后会全部推倒。——莎士比亚
临床PCR检验室内质控李金明
第三十九页，共53页。
根据二项式分布的概率计算
如果一个实验室检测HBV DNA，平常病人结果的阳性率为10%，即 p=0.1, 在某一次检测25个样本出现6个阳性结果，19个阴性结果，则 检测过程中是存在污染的可能性可通过下述方法计算。即计算在25个 样本中出现6个或6个以上阳性结果的概率，此时的概率为1-（获得0 个或1个或2个或3个或4个或多5个阳性结果的概率）即：
论文、综述等。
第十七页，共53页。
统计质控方法
质控物浓度的选择
每次（批）测定质控物的数量及放置 质控规则
Levey-Jennings质控图方法 “即刻法”质控方法 “假阳性”的统计质控方法
第十八页，共53页。
质控物浓度的选择
定量测定：测定线性范围内的高、中、
低三种浓度 定性测定：接近方法测定下限的浓度 阴性质控物
在一个实验室中某检测项目结果的阳性率为p,计算在n个血 液样本中有k个阳性结果的概率。根据二项式分布的概 率计算公式如下： P(X=k)=n!/[k!(n-k)!]pk(1-p)n-k (1) 其中n为当次实验检测标本数，k为阳性个数，p为阳性率。
P(X=k)5%为失控。此时，阴性标本可以发出报告，所有阳
第四十页，共53页。
根据泊松分布的概率计算
在血液筛查检测中，许多实验室或检测项目如 HCV RNA 、CT、结核杆菌、淋球菌的阳性结 果率均较低，这时虽然可以使用公式（1）计
算概率，但如果标本量很大，使用泊松分布来
估计二项式分布是一种更为简便的方法。。根 据泊松分布，可使用下式计算概率：
P(X=k) =(np)ke-np/k!
第二十八页，共53页。
Levey-Jennings质控图方法
荧光定量PCR技术(李金明)
定量聚合酶链反应(Q-PCR)测定技术 及其临床应用
卫生部临床检验中心 李金明
PCR?
PCR只是一个简单的不起眼玩艺
使用竞争性内标准的定量PCR方法
使用竞争性内标既可进行相对定量也可进 行绝对定量。 相对定量具有很好的精密度和重复性。而 绝对定量，关键是要证明竞争性内标和野 生型靶核酸的扩增效率相同。亦可将竞争 性内标臵于含已知量的野生型靶核酸的样 本中同时扩增来评价。
使用竞争性内标准的定量PCR方法
PCR及有关技术的发展历史（4）
1990 Cetus科学家 D.Gelfand和S.Stoffel发明了纯 化Taq DNA 多聚酶的方法。 第一个PCR试剂盒用于HLA定量检测分析。 Cetus 科学家H. Erlich 和K. Mullis在德国临床化学领域获 得生化分析奖。 1991 TaqMan 技 术 发 表。 当年11月Hoffmann-La Roche公司从Cetus获得全球 的PCR 专利权。 Roche Molecular Systems 创建了单一耐热多聚酶rTth 进行 RT-PCR技术，并用于临床RNA病毒检测。 耐热逆转录酶首次由Cetus科学家发现并报道。
PCR及有关技术的发展历史（5）
1992 当年3月Cetus 公司获得Taq酶、热循环
扩增仪等专利；
1993 AMPLICOR HCV*首次用于临床RNA
PCR 标 准试剂盒。 Kary Mullis 因PCR的发明获得诺贝尔化 学奖。
李金明-临床分子诊断质量保证
实验室仪器设备及管理
加样器：维护、校准 扩增仪：维护、校准 杂交仪：维护、校准 测序仪：维护、校准 芯片扫描仪：维护、校准 恒温干浴仪或水浴箱：维护、校准 离心机：维护 生物安全柜：维护 冰箱：维护
理想的试剂
试剂方法的性能验证及每批试剂的质检 性能指标：
重复性 准确性（定量：回收率、标准物质等；定性：方法学比较等） 线性范围（定量） 分析特异性 测定下限 抗干扰能力
CLIA uses the term “verification”： specifically to relate to confirmation that the laboratory using a test can replicate the manufacturer’s performance claims when the test is used according to the package insert. （CLIA 性能验证术语特指使用某特定检测试剂或系统的实验室按 照所提供的试剂盒或检测系统说明书使用时，能复现生产 厂家所宣称的检测性能。）
自建方法和自配试剂
有严格的试剂制备SOP 建立相应的性能指标：重复性、准确性、特异
性、测定下限和抗干扰能力等 应做成一个试剂盒的样子：名称、方法、制备
日期、制备人、有效期等 有使用说明书
实验室质量管理的“灵魂”
标准操作程序（SOP）是实验室的“最高标准”！
SOP等于试剂盒说明书吗？
源于一些标准文件（如仪器试剂说明书、国际国内标准文件） 和实验室实际工作经验积累。 因此高于相关标准文件！！！
[Luminex]）
PCR-Sanger测序
PCR-焦磷酸测序
PCR-新一代测序？
PCR-SSCP、RFLP、dHPLC等
临床基因扩增实验室验收要求和要点
24
标本制备区
标本制备区内的仪器设备主要有生物安全柜 、加样器、 高速台式冷冻离心机、水浴箱和/或加热模块、混匀器、 冰箱、可移动紫外灯、专用工作服和鞋、消耗品（带滤 芯吸头、一次性手套等）、专用记录本和记录笔。加样 器应定期校准。如需处理大分子DNA，应当具有超声波 水浴仪。
加热模块和水浴应使用已经校准的温度计定期对所设置 的温度进行校准。
25
1.6 扩增区 (a) 核酸扩增仪;
(b)微量加样器；
(c)可移动紫外灯；
(d)专用工作服和工作鞋；
(e)消耗品（带滤心吸头、 一次性手套等）； (f)专用实验记录本、记 号笔等。
扩增区
功能：cDNA合成、DNA扩增及检测。 扩增区的主要仪器就是核酸扩增热循环
序号
验收内容
1
实验室设置和设备
验收意见
符 基但 不 缺 暂
合 本有 符 此 不
符缺 合 项 需
合陷
考
核
评论与说明
1.1 实验室的规范化分区:原则上 应分为四个区,但如使用全自 动扩增检测仪,区域可适当合 并
1.2 各工作区的明确标记
1.3 实验室应配备开展临床基因 扩增检测所需的所有仪器设 备（包括质控物）。保证 《临床基因扩增检验实验室 管理办法》和《临床基因扩 增检验实验室工作导则》的 有关要求得到满足。
28
核酸扩增后产物的分析方法多种多样，如膜上或微孔板 或芯片上探针杂交方法（放射性核素标记或非放射性核素标 记）、直接或酶切后琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、 Southern转移、核酸测序方法、质谱分析等。本区是最主 要的扩增产物污染来源，因此必须注意避免通过本区的物品 及工作服将扩增产物带出。在使用PCR-ELISA方法检测扩 增产物时，必须使用洗板机洗板，废液必须收集至1 mol/L HCl中，并且不能在实验室内倾倒，而应当至远离PCR实验 室的地方弃掉。用过的吸头也必须放至1 mol/L HCl中浸泡 后再放到垃圾袋中按程序处理，如焚烧。
卫生部临床检验中心李金明教授解读《精准医学与临床实验室规范化》
卫生部临床检验中心李金明教授解读《精准医学与临床实验室规范化》近日，卫生部临床检验中心临床免疫室李金明主任，为大家讲述关于精准医学与临床实验室规范化的相关内容。
近年来，精准医学是一个特别热点的话题，尤其是2015年初奥巴马提出了“精准医学计划”，希望精准医学可以引领一个医学新时代。
而在此之前我们也经常听到一个概念叫“个体化治疗”，请问您认为这两个概念有哪些区别呢？李金明：这个问题其实提的非常好。
其实在我们讲精准医学之前，有一个概念叫个体化医学，英文叫“Personalized Medicine”，精准医学叫“Precision medicine”。
其实，这两个概念是一脉相承的，并且这两个概念在内容上是完全一致的。
在2008年美国总统科学与技术顾问委员会对“Personalized Medicine”这个概念有一个专门的定义，其核心含义是根据病人的遗传背景，也就是基因检测把病人分为两类。
分类是为了药物治疗，一类可以用这个药物，而另一类不适合这个药物，减少药物副作用（安全性），节省医疗资源（经济性）。
其实在2015年1月美国总统奥巴马提出了“Precision medicine”这个概念之前的5-6年，很多杂志上已经出现过这个概念。
这个概念的核心含义是根据患者的遗传背景、生活方式、环境因素等来量体裁衣的对患者用药，也是保证有效性、安全性和经济性。
所以“Precision medicine” 和“Personalized Medicine” 这两个概念是一脉相承的。
那么为什么后来欧美的学者要推动用“Precision medicine”替代“Personalized Medicine”，一个核心的原因就是怕民众造成误解。
因为“Personalized Medicine”的前身叫“Individual medicine”，说容易让民众理解为会为每一个人准备一种药物。
那么其实不是的，是把病人分类。
用“精准医学”能够更好的阐述，不容易造成误解，这是最主要的原因。