斑点嗜蓝孢孔菌化学成分_生物活性及水提物荧光猝灭研究

M ycosystema菌 物 学 报15 May 2011, 30(3): 464-471jwxt@ISSN1672-6472 CN11-5180Q©2011 Institute of Microbiology, CAS, all rights reserved.斑点嗜蓝孢孔菌化学成分、生物活性及水提物荧光猝灭研究袁博 朱峰 陈永强 黄天姿 鞠秀云 王力 冯友建 蒋继宏*徐州师范大学江苏省药用植物生物技术重点实验室 徐州 221116摘 要：对斑点嗜蓝孢孔菌乙醇提取物进行分级萃取，利用柱层析技术得到6个单体化合物。

经核磁数据比对为β-谷甾醇(1)、麦角甾醇(2)、麦角甾-7,22-二烯-3β-醇(3)、5,8-过氧麦角甾-6,22-二烯-3β-醇(4)、3-乙酰齐墩果酸(5)、白桦脂醇(6)。

采用Alamar Blue法检测各有机相及单体化合物对NCI-H460人非小细胞肺癌细胞增殖的影响，用DPPH自由基清除法检测其抗氧化活性。

利用荧光光谱及紫外-可见光光谱研究方法在模拟人体生理条件下，研究了斑点嗜蓝孢孔菌水提物与人纤维蛋白原的相互作用，实验结果表明，斑点嗜蓝孢孔菌水提物与人纤维蛋白原的相互形成基态复合物导致人纤维蛋白原内源荧光猝灭。

关键词：斑点嗜蓝孢孔菌，化学成分，抗肿瘤活性，抗氧化活性，荧光猝灭Chemical constituents, biological activities and flourescence quenching of Fomitiporia punctata fruiting body extractYUAN Bo ZHU Feng CHEN Yong-Qiang HUANG Tian-Zi JU Xiu-Yun WANG LiFENG You-Jian JIANG Ji-Hong*Key Laboratory for Biotechnology on Medicinal Plants of Jiangsu Province, Xuzhou Normal University, Xuzhou 221116, ChinaAbstract: Different polar fractions were extracted by different reagents from the EtOH-extract of Fomitiporia punctata. Six compounds were isolated and identified as β-sitosterol (1), egosterol (2), erogosta 7,22-dien-3β-ol (3), 5,8-epidioxiergosta- 6,22-dien-3β-ol (4), 3-acetoxyoleanolic acid (5) and botulin (6) by the technology of NMR. The anti-tumor activity against NCI-460 was evaluated by Alamar Blue method, and the antioxidant activity was detected by 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) free radical scavenging method. The interactions between aqueous extract and human fibrinogen were investigated by UV/vis absorption and fluorescence spectrum methods. The results showed that the process of binding aqueous extract of F. punctata against human fibrinogen was a spontaneous molecular interaction procedure.基金项目：国家高技术研究发展计划（863计划）（No. 2007AA021506）；江苏省高校自然科学重大基础研究项目（No. 08KJA350001）*Corresponding author. E-mail: jhjiang@收稿日期: 2010-11-16, 接受日期: 2011-03-07Vol.30 No.3465菌物学报Key words: Fomitiporia punctata , chemical composition, anti-tumor activity, antioxidant activity, fluorescence quenching斑点嗜蓝孢孔菌Fomitiporia punctata (P. Karst.) Murrill ，属担子菌门，伞菌目，锈革孔菌科（Kirk et al. 2008），一般寄生于栎、槭及其他阔叶树活立木、死树、倒木和腐木上，主要分布在我国的吉林、辽宁、河北、陕西、江苏、浙江、湖北、湖南、福建等地（Cui et al. 2005，2006；Dai et al. 2006；戴玉成 2009；Dai 2010；李永鉴 1993）。

斑点嗜蓝孢孔菌是一种药用真菌，研究证明斑点嗜蓝孢孔菌具有活血通经、祛瘀止痛、抗心肌缺血、调节心率、降压等作用（戴玉成和杨祝良 2008；郭豫梅等 2007；林树钱等 1997；王静媛等 2005；吴少华等 2009；Keller et al. 1996）。

虽然市场上有将斑点嗜蓝孢孔菌作为保健品的商品和治疗冠心病的药品销售，但对斑点嗜蓝孢孔菌的化学成分及其药理研究报道甚少，缺少相应的理论支撑。

生物大分子与药物分子结合时，会使结合部位附近的生物大分子或配体内的生色团吸收参数发生变化。

从吸收光谱的变化不仅可以判断生物大分子的结合部位有什么生色团存在，而且可以得到结合情况的信息。

若药物分子与生物大分子结合前后的吸收光谱有一定差异，说明蛋白质的构象发生了变化，也可借此来判断药物分子对蛋白质作用机理（颜承农等 2005）。

为进一步开发利用斑点嗜蓝孢孔菌的药用价值，探讨其活性物质基础并初步阐明其与蛋白质大分子作用机理，本文对斑点嗜蓝孢孔菌的不同极性组分及分离得到的6个单体化合物的抗肿瘤、抗氧化活性进行了初步研究，利用荧光猝灭研究方法对斑点嗜蓝孢孔菌水提物与纤维蛋白原作用机理进行了阐述。

1 材料与方法1.1 材料、仪器和试剂1.1.1 材料：斑点嗜蓝孢孔菌Fomitiporia punctata 子实体由大连王力野生灵芝生物科技有限公司提供。

1.1.2 仪器和试剂：Spect roMax M2荧光检测仪（molecular devices ），RE-52A 型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂），F-4500荧光分光光度计（日本日立公司），TU-1201紫外可见光分光光度计（北京通用仪器有限公司），96孔细胞培养板购于Gibico 公司，人纤维蛋白原购自上海莱士血制品有限公司，RPMI 1640培养基购自Gibico 公司，胎牛血清为杭州四季青公司产品，DMSO 购自上海生工公司，Alamar blue 购自Sigma 公司，人纤维蛋白原购自北京拜尔迪生物技术公司，石油醚、乙酸乙酯和甲醇等均为分析醇（上海苏懿试剂有限公司）。

1.2 单体化合物的分离斑点嗜蓝孢孔菌干燥子实体（4kg ），经95%的乙醇回流提取3次，合并提取液，减压浓缩得浸膏（215.6g ）。

取浸膏200g ，用乙醇溶解，与300g 的硅胶（100－200目）混合，经45℃烘干，然后分别用不同极性的试剂石油醚、乙酸乙酯和甲醇进行淋洗，减压旋蒸回收试剂，得不同极性各组分。

取石油醚组分（15g ）经硅胶柱洗脱（石油醚-乙酸乙酯梯度），TLC 检测合并相同组分，再经重结晶和Sephadex LH-20纯化，得到化合物1（9mg ）、化合物2（36.7mg ）、化合物3（22mg ）、化合物4（18mg ）、化合物5（20mg ）和化合物6（15mg ）。

1.3 细胞培养与体外抗肿瘤活性试验采用Alamar Blue 法（Brigitte et al. 1993；Hamid et al. 2004）检测体外抗肿瘤活性。

NCI-H460细胞于含10% FBS 、100U/mL 青霉素、100µg/mL 链霉素的RPMI-1640培养基中，在37℃、5% CO 2、饱和湿度条件下继代培养。

取对数生长期的细胞用0.25%胰酶从培养瓶上消化下来，制成细胞悬液，96孔板中每孔加100µL （约1万个细胞），对照组加100µL 不含细胞的培养基，放入细胞培养箱中过夜，细胞贴壁。

不同极性的组分用DMSO 溶解后用培养基稀释到所需浓度（DMSO 的浓度小于0.1%），加100µL 到实验组中，对照组补加100µL 培养基。

培养48h 后，弃去培养液，用PBS 洗涤两次。

Alamar Blue 贮存液用培养基以1:10比例稀释后，每孔加200µL ，Alamar Blue 为10%，4h 后将培养板放于466 Mycosystema/jwxtcn570nm 的激发波长和590nm 的发射波长下，加入不含细胞的培养基的孔作空白值，加细胞液不加药的孔作对照值，以细胞培养孔的值减去空白值为实际值。

按照下式计算细胞存活率：细胞存活率=（对照−样品）/对照×100%1.4 抗氧化活性试验采用DPPH 自由基清除法（Orhan et al. 2007）。

不同极性的各组分用乙醇溶解稀释成一定浓度梯度的溶液作为受测液。

取100µL 的200µmol/L DPPH 乙醇溶液和10µL 的受测液（A ）加入96孔板中，混匀，室温下放置30min 后，在517nm 处测吸光度，同时测定100µL DPPH 溶液+100µL 无水乙醇混合液（B ）和100µL 受测液+100µL 无水乙醇混合液（C ）在517nm 下的吸光度。

按照下式计算DPPH 自由基清除率：DPPH 清除率=[1−（A-C ）/B ]×100%1.5 斑点嗜蓝孢孔菌水提物荧光猝灭研究用pH7.4的Tris-NaCl 缓冲的溶液配制 3.0× 10–6mol/L 的人纤维蛋白原溶液，置于4℃冰箱中保存。

称取10.0g 斑点嗜蓝孢孔菌，粉碎，过80目筛，加水20倍浸泡1h ，煮沸30min 后过滤，滤渣加10倍水煮沸20min 后过滤，再次加10倍水煮沸20min 后过滤，合并滤液，浓缩，冷冻干燥，研磨，备用。