南农辅导班课件：核酸的理化性质
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核酸的理化性质
第三节核酸的理化性质1一、核酸的分子大小一核酸的分子大小二、核酸的溶解度与粘度微溶于水，不溶于有机溶剂，常用乙醇来沉淀DNA ；DNA难溶于0.14mol/L的NaCl溶液，可溶于1-2 mol/L的NaCl溶液，RNA则相反，可据此分离二者。
2三、核酸的酸碱性质核酸的碱基、核苷、核苷酸均能发生解离，因此核酸是两性电解质。
p对DNA来说，碱基对在pH4.0～11.0最稳定。
3四、核酸的紫外吸收4OD260的应用1.判断核酸样品的纯度–DNA纯品: OD 260/OD 280= 1.8纯–RNA纯品: OD260/OD 280= 2.0–含杂蛋白及苯酚，降低 2. DNA或RNA的定量对于纯样相当于对于纯样品，OD 260=1.0相当于•50μg/ml双链DNA•40μg/ml单链DNA（或RNA）•20μg/ml寡核苷酸5核酸溶液紫外吸收以摩尔磷的吸光度表示，摩尔磷即相当于摩尔核苷酸。
摩尔吸光系数30.98Aε）＝ε：摩尔吸光系数A：吸收值P WL（）W：每升溶液磷重量L：比色杯内径63.判断DNA是否变性核酸在变性时，紫外吸收增加的现象称为增色效应；在一定条件下，变性核酸可以复性，紫外吸收又恢复到原来水平，这一现象称为减原来水平这现象称为减色效应。
7五、核酸的变性、复性和杂交五核酸的变性复性和杂交（一）变性P260定义：核酸受到加热、极端的pH或离子强度的定义核酸受到加热极端的H降低等因素或特殊的化学试剂作用，其双螺旋区的氢键断裂变成单链的过程。
8变性后其它理化性质变化：OD260增高粘度下降比旋度下降浮力密度升高酸碱滴定曲线改变生物活性丧失9DNA的紫外吸收光谱¾增色效应：当核酸变性时260nm处光吸收值显著增加的现象。
10¾热变性：DNA的稀盐溶液加热到80~100℃，热变性的稀盐溶液热℃几分钟后双螺旋结构被破坏，氢键断裂，两条链彼此分开形成无规则线团的现象。
11¾解链曲线：如果在连续加热DNA的过程中以温度对A260（absorbance，A，A260代表溶液在260nm处的吸光率）值作图，所得的曲线称为解链曲线。
第1314章核酸的性质及研究方法 ppt课件
2020/10/28
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(2)牛脾脱氧核糖核酸酶 （spleen deoxyribonuclease, 简称DNase II）
PPPPPPP P P
作用位点： 作用于DNA产生3’P为末端的寡聚核苷酸，平均长度6nt 需要Na2+激活,而Mg2+抑制酶活， 最适pH值4-5。
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8
牛脾磷酸二酯酶
蛇毒磷酸二酯酶
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5‘
3’
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1.核酸酶的分类
(1)按底物的专一性分类 核糖核酸酶（ribonuclease, RNase） 脱氧核糖核酸酶（deoxyribonuclease, DNase） (2)作用方式 核酸内切酶（endonuclease） 核酸外切酶（exonuclease） (3)按磷酸二酯键断裂的方式 识别3’-OH的磷酸二酯键，产生5’-核苷酸 识别5’-OH的磷酸二酯键，产生3’-核苷酸 (4)其它 如双链酶、单链酶等
（二）碱水解 • RNA的磷酸酯键易被碱水解→2’-或3’-核苷酸 • DNA对碱稳定,因为没有2’-OH
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5
碱水解
RNA
OH 水解
HOH2C
O
base
H H
H H
O
O
P
O
OH
环磷酸酯
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2′-核苷酸 3′-核苷酸
混合物
6
（三）酶水解
磷酸二酯酶
蛇毒磷酸二酯酶 牛脾磷酸二酯酶
②形成的产物具有 粘性末端或者平整末端
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•限制性内切酶的命名
EcoRI E为大肠杆菌E.coli属名的第一个字母， 第2、3个字母co为它种名的头两个字母， 第四个R表示所用大肠杆菌的菌株， 最后一个罗马字表示该菌中已分离出的这一类
核酸的组成与理化性质
由于碱基对之间的氢键性质与其解离状 态相关，而解离状态又与pH有关。所以 ，溶液的pH范围直接影响核酸结构中碱 基对间的稳定性。对于DNA，在pH4-11之 间为稳定，超越此范围，DNA将变性。
正滴定曲线I的非缓冲区较宽； 逆滴定曲线II的非缓冲区较窄；
两条曲线不能重合，反映出天然DNA与 变性DNA的滴定曲线是不同的。
1、碱基的解离
碱基中杂环分子中的N
具有结合和释放质子的
能力，既有碱性解离又
C
有酸性解离.而环外的
氨基的碱性很弱，在生
理条件下不能质子化。
A
2、核苷的解离
糖环的存在影响了碱基的解离： 增强了碱基的酸性解离，即增强了碱基上可解离基 团的酸性。 核糖中羟基解离的pK值通常在12以上，不予考虑。
NH2
OH
闭合DNA构型紧密，空间位阻最小，所以跑得最 快，而开环DNA空间位阻最大，所以跑得最慢。
二、核酸的水解
（一）酸水解 顾名思义，在酸性条件下水解； 糖苷键和磷酸酯键都能被酸水解，但糖苷键比磷酸酯键 更易被酸水解； 嘌呤碱的糖苷键比嘧啶碱的糖苷键对酸更不稳定
（更易水解）嘌呤碱的糖苷键﹥嘧啶碱的糖苷键﹥磷酸
Hale Waihona Puke NH2OHN
N
N
N
N
N
NN HOCH2 O
HH
H2N N N HOCH2 O
HH
H
H
H
H
OH OH
OH OH
腺嘌呤核苷 鸟嘌呤核苷
HO N HOCH2 O
HH
HO N HOCH2 O
HH
H
H
H
H
OH OH
OH OH
胞嘧啶核苷
核酸的重要理化性质ppt课件
4、核酸的复性
变性DNA在适当的条件下，两条彼此分开的单 链可以重新缔合成为双螺旋结构，这一过程称为 复性。DNA复性后，一系列物理、化学性质将 得到恢复。DNA复性的程度、速率与复性过程 的条件有关。
将热变性的DNA骤然冷却至低温时，DNA不可 能复性。但是将变性的DNA缓慢冷却时，可以 复 性 ， 这 一 过 程 也 叫 退 火 （ annealing)。 分 子 量越大复性越难。浓度越大，复性越容易。此外， DNA的复性也与它本身的组成和结构有关。
Tm与介质中离子强度有关：DNA的保存应在含盐的缓冲液中
A260 0.02
0.1 1.0 mol/LKCl
温度/0C
DNA变性（加热或极端 pH）
当DNA的稀盐 溶液加热到80100℃时，双螺 旋结构即发生解 体，两条链彼此 分开，形成无规 线团。
DNA变性后， 它的一系列性质 也随之发生变化， 如紫外吸收 (260 nm)值升 高, 粘度降低等。
3.DNA的热变性和解链温度（Tm）
用加热的方法使DNA变性叫做热变性 DNA的变性过程是突变性的，它在很窄的温度
区间内完成。因此，通常将DNA的变性达到 50%时，即增色效应达到一半时的温度称为 DNA的解链温度（melting temperature,Tm）,Tm也称熔解温度或DNA 的熔点。
一般DNA的Tm值在70-85C之间
RNA的T m值 tRNA的T m值
G和C的含量高，Tm值高。因而测定Tm值，可反映DNA分子中
G、 C含量，可通过经验公式计算：
（G+C)%=(Tm-69.3)X2.44
Tm大小可反映出DNA的均一性：均质DNA的熔解过程发生在 一个较小的温度范围内；异质DNA的熔解过程发生在一个较宽 的温度范围内。
化工专业生物化学课件—核酸的物理化学性质
– 只有纯的样品才能 用分光）
• 核苷酸中磷含量测定
• 摩尔磷吸光系数[ε(P)]的变化可 以判断核酸是否发生变性
– 增色效应： 核酸变性时，得到的单 链核酸的[ε(P)]要比双链核酸高出 25%，称增色效应
– 减色效应：复性后， [ε(P)]发生降 低后的现象，称减色效应
• 03 限制性内切酶
– 主要降解外源DNA
– 大肠杆菌来源的EcoR I
– 限制性内切酶与甲基化酶（A/C）成对出现
2.核酸的酸碱性质—碱基解离（P504）
• 碱基的酸碱性质：嘧啶和嘌呤碱杂环上的氮原子（N）及 其取代基具有结合与释放质子的能力
– 尿嘧啶核苷酸碱基的碱性极弱，解离常数一般测不出
• 核苷的解离
核苷酸的解离曲线（P507）
• 尿嘧啶核苷酸碱基的碱性极弱，基本测不出其含氮杂环的 解离曲线，因此没有碱性离子状态，也无pI
3.核酸的紫外吸收-1（P507）
• 原因：
– 嘌呤和嘧啶碱具有 共轭双键，在紫外 波段具有特征吸收 （260nm）
• 作用
– DNA或RNA定量测 定
– DNA（1.8）或 RNA（2.0）纯度测 定（A260/A280）
x(G+C)=(Tm-69.3)X2.44
• 环境的离子强度
– 较低离子浓度环境中，Tm低而宽 – 较高离子浓度环境中，Tm高而窄
5.DNA的复性（P509-10）
• 复性
– 变性的两条DNA单 链在一定条件下重新 形成双链的过程
• 退火
– 热变性的单链DNA 在缓慢冷却的过程中 复性的现象
– DNA片段越大，复 性越慢
• 02 核糖核酸酶T1
– 专一性更强：只水解鸟嘌呤核苷酸（G）3端的磷酸形成的磷酯键 – 耐热、耐酸
• 核苷酸中磷含量测定
• 摩尔磷吸光系数[ε(P)]的变化可 以判断核酸是否发生变性
– 增色效应： 核酸变性时，得到的单 链核酸的[ε(P)]要比双链核酸高出 25%，称增色效应
– 减色效应：复性后， [ε(P)]发生降 低后的现象，称减色效应
• 03 限制性内切酶
– 主要降解外源DNA
– 大肠杆菌来源的EcoR I
– 限制性内切酶与甲基化酶（A/C）成对出现
2.核酸的酸碱性质—碱基解离（P504）
• 碱基的酸碱性质：嘧啶和嘌呤碱杂环上的氮原子（N）及 其取代基具有结合与释放质子的能力
– 尿嘧啶核苷酸碱基的碱性极弱，解离常数一般测不出
• 核苷的解离
核苷酸的解离曲线（P507）
• 尿嘧啶核苷酸碱基的碱性极弱，基本测不出其含氮杂环的 解离曲线，因此没有碱性离子状态，也无pI
3.核酸的紫外吸收-1（P507）
• 原因：
– 嘌呤和嘧啶碱具有 共轭双键，在紫外 波段具有特征吸收 （260nm）
• 作用
– DNA或RNA定量测 定
– DNA（1.8）或 RNA（2.0）纯度测 定（A260/A280）
x(G+C)=(Tm-69.3)X2.44
• 环境的离子强度
– 较低离子浓度环境中，Tm低而宽 – 较高离子浓度环境中，Tm高而窄
5.DNA的复性（P509-10）
• 复性
– 变性的两条DNA单 链在一定条件下重新 形成双链的过程
• 退火
– 热变性的单链DNA 在缓慢冷却的过程中 复性的现象
– DNA片段越大，复 性越慢
• 02 核糖核酸酶T1
– 专一性更强：只水解鸟嘌呤核苷酸（G）3端的磷酸形成的磷酯键 – 耐热、耐酸
2024版年度核酸的性质生物化学课件
核酸的性质生物化学课件
2024/2/3
1
目录
• 核酸基本概念与分类 • 核酸物理性质 • 核酸化学性质 • 核酸结构层次与功能关系 • 核酸在生物技术中应用 • 实验方法与技术手段
2024/2/3
2
01
核酸基本概念与分类
2024/2/3
3
核酸定义及功能
2024/2/3
核酸定义
核酸是生物体内携带遗传信息的生 物大分子物质，包括脱氧核糖核酸 （DNA）和核糖核酸（RNA）两 大类。
2024/2/3
疾病诊断与治疗
核酸在医学领域具有广泛应用价值，如基因检测可用于疾病 诊断和预防；基因治疗则通过修饰或替换患者体内缺陷基因 来达到治疗疾病的目的。
7
02
核酸物理性质
2024/2/3
8
溶解性与稳定性
溶解性
核酸通常易溶于水，且溶解度随温度升高而增加。在生理条件下，DNA和 RNA均以稳定的水溶性分子形式存在。
2024/2/3
27
06
实验方法与技术手段
2024/2/3
28
提取纯化方法比较
酚氯仿抽提法
利用酚、氯仿对DNA和RNA的溶解度
磁珠法
利用磁珠表面的特异性基团与核酸结
不同，将核酸从细胞中分离出来。此
合，通过磁场作用实现核酸的分离纯
方法操作简便，但需注意酚、氯仿等
化。此方法操作简便、快速，且适用
有机溶剂的使用安全。
核酸适配体技术
利用核酸适配体的高特异 性和高亲和力，实现对目 标分子的识别和调控。
17
04
核酸结构层次与功能关系
2024/2/3
18
一级结构：序列信息决定功能
2024/2/3
1
目录
• 核酸基本概念与分类 • 核酸物理性质 • 核酸化学性质 • 核酸结构层次与功能关系 • 核酸在生物技术中应用 • 实验方法与技术手段
2024/2/3
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01
核酸基本概念与分类
2024/2/3
3
核酸定义及功能
2024/2/3
核酸定义
核酸是生物体内携带遗传信息的生 物大分子物质，包括脱氧核糖核酸 （DNA）和核糖核酸（RNA）两 大类。
2024/2/3
疾病诊断与治疗
核酸在医学领域具有广泛应用价值，如基因检测可用于疾病 诊断和预防；基因治疗则通过修饰或替换患者体内缺陷基因 来达到治疗疾病的目的。
7
02
核酸物理性质
2024/2/3
8
溶解性与稳定性
溶解性
核酸通常易溶于水，且溶解度随温度升高而增加。在生理条件下，DNA和 RNA均以稳定的水溶性分子形式存在。
2024/2/3
27
06
实验方法与技术手段
2024/2/3
28
提取纯化方法比较
酚氯仿抽提法
利用酚、氯仿对DNA和RNA的溶解度
磁珠法
利用磁珠表面的特异性基团与核酸结
不同，将核酸从细胞中分离出来。此
合，通过磁场作用实现核酸的分离纯
方法操作简便，但需注意酚、氯仿等
化。此方法操作简便、快速，且适用
有机溶剂的使用安全。
核酸适配体技术
利用核酸适配体的高特异 性和高亲和力，实现对目 标分子的识别和调控。
17
04
核酸结构层次与功能关系
2024/2/3
18
一级结构：序列信息决定功能
第三节 核酸的理化性质
牛脾磷酸 二酯酶
Fig. 4-30 Snake venom phosphodiesterase and spleen phosphodiesterase are exonucleases that degrade polynucleotides from opposite ends.
• 核酸酶（nuclease）（特异性地水解核酸）
• 变性DNA粘度下降。
4. 溶解性：
• DNA、RNA微溶于水，不溶于一般有机溶剂。 • 核酸钠盐比游离酸易溶于水。
5. 特殊颜色反应
（1）地衣酚法定性、定量鉴定RNA: D-核糖 + 浓盐酸 + 地衣酚
FeCl3 ）
（2）二苯胺法定性、定量鉴定DNA:
应用：
（1）定性定量鉴定各种核苷酸 （2）核酸纯度鉴定
纯DNA: A260 / A280 > 1.8 纯RNA: A260 / A280 = 2.0
（3）核酸定量鉴定
A260 =1, 相当于 50g / ml 双螺旋DNA 40g / ml 单链DNA（RNA） 20g / ml 寡核苷酸
（4）核酸变性程度的鉴定
b: DNase Ⅱ，产物为3´- 核苷酸或以其为尾的寡核苷酸
三、核酸的酸碱性质
• 核苷酸含有磷酸基团和碱基，是两性电解质。 在pI处，核苷酸以兼性离子存在。 • DNA和RNA分子也是两性电解质。 多核苷酸中，磷酸基pK1´=1.5，因其酸性较强， 所以核酸表现为酸性。
四、核酸的紫外吸收
嘌呤碱、嘧啶碱存在共轭双键，所以碱基、
根据作用方式：
核酸内切酶 核酸外切酶
核糖核酸酶 如：牛胰核糖核酸酶（ RNaseⅠ） 根据底物： 核糖核酸酶T1
脱氧核糖核酸酶 如：牛胰脱氧核糖核酸酶（DNaseⅠ） 牛脾脱氧核糖核酸酶（DNase Ⅱ） 限制性核酸内切酶
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一.一般的物理性质
3. 粘 度
DNA溶液粘度极高 (因其分子直径小而长度大) RNA溶液粘度要小得多
核酸变性或降解后，粘度降低
二. 两性解离
核酸既含有酸性的磷酸基团，又含有弱碱性
的碱基，故可发生两性解离。其解离状态随溶液
的pH值而改变。
由于磷酸基团的酸性很强，所以pI较低，整
个分子相当于多元酸。
使氢键断裂，破
化学因素：
过酸（酸变性）
坏碱基堆集力，从 而引起核酸二级结 构的破坏。
过碱（碱变性）
有机溶剂 尿素……
(一) 变 性
3. 增色效应
变性后的DNA对260nm的紫外光吸收值比变性 前明显升高，这种现象称为增色效应。 这是由于变性的DNA双螺旋解体，藏于螺旋内 部的碱基暴露出来。
增色效应常可用来衡量 DNA变性的程度。
RNA的变性
RNA含局部双螺旋，也可发生变性。
特点： 变性效应不如DNA明显 增色效应的跳跃较平缓 Tm值较低
四.变性与复性
（二） 复性
1. 复性的概念
变性DNA在适当条件下，又可使两条彼此分开的 链重新缔合成为双螺旋结构，此过程成为复性。 退火：热变性的DNA在缓慢冷却的条件下的复性过程。
四.变性与复性
(一) 变 性
4. 热变性曲线(熔解曲线)
在DNA发生热变性的过程中，A260随温度的变化曲线。
变性百分率 A260
不 同 DNA 的 熔 解
100
曲线不同，但很
类似。都是 —— S 形曲线
50
0
温度
(一) 变 性
5. 解链温度(Tm值) ( melting temperature) 又称 熔解温度、熔点
变性百分率 A260
指DNA的变性达
到50%，即增色效 应达到一半时的 温度 DNA的Tm值一
100
50
般在70~85℃之间
0
Tm
温度
(一) 变 性
5. 解链温度(Tm值)
影响Tm值的因素：
DNA分子中GC碱基对的含量
DNA分子中GC含量高，则Tm值大
DNA的溶液环境
如离子强度、pH
(一) 变 性
纯的RNA：A260/ A280 =2.0
四.变性与复性
(一) 变 性
1. 变性的概念 核酸在某些物理或化学因素的作用下，其空 间结构发生改变，从而引起理化性质的改变及生
物活性的降低或丧失。
A260值升高
粘度下降 沉降系数加快 ……
(一) 变 性2Βιβλιοθήκη 引起变性的因素物理因素：
热（热变性）
紫外、辐射等
核酸的杂交广泛应用于分子遗传学中。
基因（gene)：DNA分子上具有遗传效应的特定核苷酸序列， 其编码产物是多肽链或RNA。 基因组(genome)：一种生物体的全部基因或染色体。 基因组学(genomics)：一门涵盖了对所有基因进行基因组 作图、核苷酸序列分析、基因定位和功能分析的科学。包 括 结 构 基 因 组 学 (structural genomics) 和 功 能 基 因 组 学 (fuctional genomics )。 生物信息学(bioinformatics)：将计算机科学和数学应用于 生物大分子信息的获取、加工、存储、分类、检索与分析， 以达到理解这些生物大分子信息的生物学意义的交叉学科。
核酸的理化性质
一.一般的物理性质 1. 形 态
DNA —— 白色纤维状固体
RNA —— 白色粉末状固体
一.一般的物理性质 2. 溶解性
微溶于水 不溶于乙醇、乙醚和氯仿等一般的有机溶剂 RNA核蛋白体(RNP)易溶于0.14mol/L的NaCl溶液
DNP可溶于高浓度(1~2mol/L)的NaCl溶液
（二） 复性
2. 减色效应
当变性的DNA经复性以重新形成双螺旋结构时， 其溶液的A260值则减小，这种现象称为减色效应。 减色效应常可用来衡量DNA复性的程度。
四.变性与复性
（二） 复性
3. 分子杂交
不同来源的DNA分子放在一起热变性，然后慢慢冷却， 让其复性。这些异源DNA（RNA)之间有互补的序列或部分 互补的序列，则复性时会形成“杂交分子”。
利用核酸的两性解离可以通过调节核酸溶液
的pH来沉淀核酸，也可通过电泳分离纯化核酸。
三. 紫外吸收性质 嘌呤和嘧啶具有共轭双键，能强烈吸收 紫外光。在260nm处有最大吸收峰。对于纯 的DNA或RNA，可以通过测得A260来推测其 核酸含量。 A260/ A280值可以反映核酸的纯度。
纯的DNA：A260/ A280 =1.8