构建点突变质粒步骤
DNA定点突变实验具体步骤及详细说明
DNA定点突变实验具体步骤及详细说明定点突变是指通过聚合酶链式反应（PCR）等方法向目的DNA片段（可以是基因组，也可以是质粒）中引入所需变化（通常是表征有利方向的变化），包括碱基的添加、删除、点突变等。
一、引物设计每条引物都要携带有所需的突变位点，引物一般长25~45 bp，设计的突变位点需位于引物中部。
二、反应1. 使用高保真的pyrobest DNA聚合酶，循环次数少，一般为12个循环。
2. 反应体系：（1）10x pyrobest Buffer：5 ul（2）dNTP Mixture(10 mM) ：1 ul（3）模板DNA(5~50 ng) ：1ul（4）primer 1 (125 ng) ：1 ul（5）primer 2 (125 ng) ：1 ul（6）pyrobest DNA polymerase（TaKaRa）(5 U/ul)：0.25 ul（7）加无菌蒸馏水至50ul.三、产物沉淀纯化1. 加1/10 体积的醋酸钠，1倍体积的异丙醇，混匀置冰上（或-20℃冰箱）5min，离心弃上清。
2. 70~75%乙醇洗盐两次，烘干后溶于无菌水中（此步可省略，直接用DpnI 酶切）。
四、DpnI酶切1. 酶切体系（1）Buffer ：2 ul（2）BSA（100x）：0.2 ul（3）DNA ：x ul（4）DpnI：0.5 ul（5）加无菌去离子水至20 ul。
2. 30℃酶切1~4 h。
3. 65℃水浴15min 终止反应。
五、转化将酶切产物转化大肠杆菌DH5a菌株，利用抗生素筛选突变子。
六、测序验证注意事项1. 引物和质粒都准备好后，当然就是做PCR喽，不过对于PCR的酶和buffer，不能用平时的，我们做PCR把整个质粒扩出来，延伸长度达到几个K，所以要用那些GC buffer或扩增长片段的buffer，另外，要用保真性能较好的PFU酶来扩增，防止引进新的突变。
2. Quick change试剂盒分为几种不同的类型，QuikChange®、Site-Directed Mutagenesis Kit标准点突变试剂盒、QuikChange®、XL Site-Directed Mutagenesis Kit长模板单点突变试剂盒（>8kb）从原理上是一样的，只是PCR的酶和BUFFER不一样，后面用了比较适合长片段扩增的酶和BUFFER罢了，没什么特别的东西。
构建点突变质粒步骤
构建点突变质粒步骤．基因定点突变一、定点突变的目的把目的基因上面的一个碱基换成另外一个碱基。
二、定点突变的原理通过设计引物，并利用PCR将模板扩增出来，然后去掉模板，剩下来的就是我们的PCR产物，在PCR产物上就已经把这个点变过来了，然后再转化，筛选阳性克隆，再测序确定就行了。
三、引物设计原则引物设计的一般原则不再重复。
突变引物设计的特殊原则：（1）通常引物长度为25~45 bp，我们建议引物长度为30~35 bp。
一般都是以要突变的碱基为中心，加上两边的一段序列，两边长度至少为11-12 bp。
若两边引物太短了，很可能会造成突变实验失败，因为引物至少要11-12个bp才能与模板搭上，而这种突变PCR要求两边都能与引物搭上，所以两边最好各设至少12个bp，并且合成多一条反向互补的引物。
．接下来，）如果设定的引物长度为30 bp （2GC℃（Tm值，看是否达到78需要计算引物的 40%）。
含量应大于℃，则适当改变引Tm值低于78（3）如果含量应大（GC78物的长度以使其Tm值达到℃）。
于40%）设计上下游引物时确保突变点在引物（4的中央位置。
）最好使用经过纯化的引物。
（5(% of 值计算公式：Tm=0.41×TmGC)–675/L+81.5注：L：引物碱基数；% of GC：引物GC 含量。
四、引物设计实例以G CG→A CG为例：5'-CCTCCTTCAGTATGTAG G CGACTTACTT ATTGCGG-3'（1）首先设计30 bp长的上下游引物，并将A (T)设计在引物的中央位置。
Primer #1:5'-CCTTCAGTATGTAG A CGACTTACTTAT 3' TGC-Primer #2:5'-GCAATAAGTAAGTCG T CTACATACTGAA GG-3'（2）引物GC含量为40%，L为30，将这两个数值带入Tm值计算公式，得到其Tm=75.5（Tm=0.41×40-675/30+81.5）。
定点突变
1.1.1基因定点突变简介（INTRODUCTION）定点突变（site-directed mutagenesis）是指通过聚合酶链式反应（PCR）等方法向目的DNA片段（可以是基因组，也可以是质粒）中引入所需变化，包括碱基的添加、删除、点突变（单点/多点）等。
定点突变能迅速、高效的提高DNA所表达的目的蛋白的性状及表征，是基因研究工作中一种非常有用的手段。
原理上分两种：1. 搭桥法（重叠PCR）2. 一步法（全质粒PCR）►搭桥法（重叠PCR）定点突变搭桥法共需要两对引物（两端引物，中间引物）,三次PCR，其中前两次PCR可同时完成，原理如图一所示：两次PCR的产物回收，作为模板加上两端引物primer F和primer R 进行PCR3。
搭桥法定点突变PCR1：以primer F 和primer Rm 为引物对扩增PCR2：以primer R 和primer Fm 为引物对扩增实验步骤（PROCEDURE）1.两对引物的Tm值都应相当。
两端PCR引物参照普通引物设计并无特殊要求。
所需引入突变包含在中间引物互补区域内（需要在两条引物上均引入点突变），请勿将突变位点置于引物3’ 末端且突变位点距离3’ 端最少要有15个碱基，因为有非匹配碱基的存在，太短会导致引物与模板无法结合。
2.对于一对中间引物的设计，如左图所示（高亮处是突变碱基），两引物间可以是完全互补，也可是部分互补。
但两引物间互补部分的Tm值不能太低（太低导致PCR3无法配对延伸）。
5’-NNNNNNNNNNNNNNNANNNNNNNNNNNNNNNNN-3’3’-NNNNNNNNNNNNNNNTNNNNNNNNNNNNNNNNN-5’完全互补5’-NNNNNNANNNNNNNNNNNNNNNNN-3’3’-NNNNNNNNNNNNNNNTNNNNNNN-5’部分互补5’-NNNNNNANNNNNNNNNNNNNNNNN-3’3’-NNNNNNNNNNNNNNNT-5’部分互补一对中间位置的点突变引物设计3.PCR：PCR1：以primer F 和primer Rm 为引物对扩增；PCR2：以primer R 和primer Fm 为引物对扩增。
构建点突变质粒步骤
构建点突变质粒步骤
一、引言
本文旨在介绍构建点突变质粒的具体步骤。
点突变是指在DNA的序列中改变单个碱基，通常用于研究蛋白质结构和功能。
点突变可以通过PCR扩增、纯化、定向克隆和测序等技术实现。
二、材料和方法
2.1 PCR扩增
PCR（聚合酶链式反应）是指在高温下使DNA变性，然后利用Taq聚合酶进行DNA扩增。
PCR扩增需要设计两个引物，引物的长度一般为20-30bp，引物的浓度一般为0.1uM。
PCR扩增的反应条件如下：94℃变性2min→94℃ 30s→58-65℃ 30s→72℃ 1min/kb（循环30-35次）→72℃5min停止反应。
PCR扩增的产物可以通过琼脂糖凝胶电泳分离。
2.2 DNA纯化
将PCR扩增产物从琼脂糖凝胶切下，用QIAquick凝胶提取试剂盒进行纯化。
将样品加入吸附柱，再加入洗涤缓冲液将杂质洗掉，最后加入洗脱缓冲液使DNA从柱子中洗脱出来。
2.3 定向克隆
定向克隆是指利用限制性内切酶切割DNA，然后进行质粒载体的克隆。
先将PCR产物与质粒载体酶切后连接，然后转化到大肠杆菌中，通过筛选获得阳性克隆子。
在定向克隆的过程中需要注意引物的合成和酶切位点的选择，以保证克隆效率和准确性。
2.4 测序
测序是指对克隆子的DNA序列进行测定和分析。
将克隆子的DNA片段进行扩增和纯化后送到生物技术公司进行二代测序，得到测序结果后进行序列比对和分析。
三、结论
通过PCR扩增、纯化、定向克隆和测序等技术，可以实现构建点突变质粒的目的。
本文介绍了具体的步骤和注意事项，希望能够对相关科研工作者提供一定的参考。
突变体构建
突变体构建1.定点突变：快速，高效，简便设计原理：引物与模板链退火，pfu DNA聚合酶合成突变链。
DpnⅠ酶体外降解非突变型质粒模板（甲基化质粒模板）设计引物：引物包含5’端重叠区和3’端延伸区。
引物长度：除突变点之外，两条引物的长度大约为30个核苷酸，5’端重叠区包含15-20个碱基，3’端延伸区包含至少10个碱基。
突变引物：突变点位于两条引物上，分别位于正向突变引物重叠区下游、紧邻重叠区；反向突变引物5’端。
退火温度的计算不包括突变碱基。
如图：5’’3’-TACTGGTACTAATGCGGTTCGCGC G延伸区重叠区2.嵌合型突变体的构建：将一个基因与另一个基因，互换构建嵌合型突变变体，可以通过overlapping PCR的方法获得。
●原理：比如两个基因，一个命名为A，一个命名为B。
A的序列为5-atgcatgctagctagaacgct acgctgactaccccctgatc-3，B的序列为5-atgctagtagctagcccccc cc aggggataattttttaaaacg-3。
●首先我们要设计引物，假设引物的序列为：A1:5-atgcatgctagctagaacgct-3A2:5-ggggggctagctactagcat gatcagggggtagtcagcgt-3B1:5-acgctgactaccccctgatc atgctagtagctagcccccc-3B2:5-cgttttaaaaaattatcccct-3（设计引物的时候在A2的3端加入了20个B基因5端的序列，在B1的5端加入了20个A基因3端的序列。
）●步骤：（1）以A1,A2扩增A基因，B1，B2扩增B基因（2）回收A，B基因（3）以A，B为共同的模板，A1和B2为引物，扩增A+B，这样我们就利用重组PCR的方法将A+B拼接起来了。
AOPE基因定点突变质粒的构建及qPCR鉴定
AOPE基因定点突变质粒的构建及qPCR鉴定作者：覃鸿妮谢钰珍杜雅馨来源：《科技风》2018年第31期摘要：随机选取5份待检测老年痴呆症的唾液标本，等量混合后提取基因组DNA并通过PCR扩增人第19号染色体上的载脂蛋白E（AOPE）基因，再与PMD19T质粒连接构建重组质粒，转入DH5α感受态细胞中。
经菌液PCR和测序鉴定为阳性的克隆抽取其质粒，以此重组质粒为模板通过PCR对AOPE基因的rs7421位点G突变为T，构建的突变质粒经qPCR鉴定，得到相应的荧光值，不同基因型的结果分成三类聚类图：CC型（野生纯合），CR型（杂合突变）和RR型（纯合突变），将得到的荧光数据值上传到生物信息数据库当中，以此为依据可以从AOPE基因层面上对待检测对象的阿尔茨海默病发病风险做出评估。
关键词：AOPE基因；定点突变；重组质粒；qPCR鉴定阿尔茨海默病（Alzheimer disease，AD），又称老年痴呆，是一种起病隐匿的进行性发展的神经系统退行性疾病。
[1]临床上以记忆障碍、失语、失用、失认、视空间技能损害、执行功能障碍以及人格和行为改变等全面性痴呆表现为特征。
[2]近十年内，大量研究显示，对AD 的防治虽已展现出良好的发展前景，并研发出许多有效药物。
但中国的情况不容乐观，中国有将近1000多万的AD患者，未来这一数字还将不断增加。
也正因為AD问题的严峻性，早期干预，早发现，早治疗对于延缓AD病情发展甚至治愈具有极大的重要性[2，3]。
影响患者患阿尔茨海默病风险的危险因素有很多，年龄占主要位置，患阿尔茨海默病的危险随着患者年龄的每增加五岁而增加一倍，且低受教育程度可明显增加该病患病风险。
[4]基因突变居于其后，第14号染色体上的早老素Ⅰ基因、第1号染色体上的早老素Ⅱ基因、第21号染色体上的淀粉样前体蛋白基因以及第19号染色体上的载脂蛋白E基因，是目前能够确定的突变基因，与遗传性阿尔茨海默病有关的突变基因为前三者，与发散性阿尔茨海默病有关的则为aopE4基因，是最强遗传性危险因素[5，6]。
质粒构建流程
质粒构建流程一、引物设计1）取得目的基因序列，可选用数据库NCBI2）软件分析目的基因可用酶切位点。
使用primer5分析出序列不包含的酶切位点，即为可用没切位点。
3）4）选择酶切位点。
对照目的基因可用酶切位点和载体上的酶切位点，选择二者共有的作为备选。
载体上两个酶切位点的距离应有几十bp以上，选实验室常用酶切位点。
5）使用primer5设计目的基因引物，目的产物应包含从启动子到终止子全部碱基。
6）根据选择的酶切位点，查找对应的酶切位点保护碱基，将对应片段添加到设计的引物两端，注意酶切位点的前后顺序。
一般选择三个保护碱基。
7）引物设计完成，送公司合成。
二、目的片段获取1. RNA提取试剂盒：Bioteke高纯总RNA快速提取试剂盒离心柱型（裂解液RL 4℃、漂洗液RW -20℃保存）准备：冰盒、4℃预冷离心机、EP管2套、吸附柱RA一套操作步骤：1）将1000 Hl裂解液RL加入细胞中，混合5min。
2）加200 Hl氯仿混合，震荡15$,室温孵育3min。
3）4℃, 12000rpm 离心 10min。
4）最上层水相转移至新EP管中（体积约550 H1）5）加入1倍体积（550 H1） 70%乙醇，混匀6）全部转移到套收集管的吸附柱RA中，4℃, 10000rpm离心45s7）弃废液，重套收集管，加500 Hl去蛋白液RE, 12000rpm离心45s8）弃废液，重套收集管，加700 H l去漂洗液RW, 12000rpm离心60s9）弃废液，重套收集管，加500 H l去漂洗液RW, 12000rpm离心60s10）弃废液，重套收集管，12000rpm空离2min11）吸附柱放入新EP管，加50 Hl RNase free water于膜上，室温放置2min12）4℃, 12000rpm 离心 60s13）点样：5Hl RNA+ 1 H l 10X14）-20℃保存2. RNA反转录试剂盒： TaKaRa primescript RT reagent kit with gDNA eraser （-20℃保存）准备：冰盒，②④⑤⑥取出解冻，①③为酶不可取出，预冷离心管操作步骤：1）基因组DNA去除（10Hl体系）② 5XgDNA eraser buffer 2Hl① gDNA eraser 1HlTotal RNA 4Hl （可根据RNA浓度调整）⑥ RNase free water 3HlPCR仪中进行，程序：42℃, 2min f4℃注：RNA的量可根据浓度调整，混合液冰上配制，酶最后加入2）反转录反应（20Hl体系）④5XprimerScript buffer 2 4ul⑤primerScript RT enzyme mix I 1ul⑥RT primer mix 1ul⑦RNase free water 4ul1）反应液10 HlPCR 仪：37℃, 15min—85℃, 5s―4℃注：可直接将第2步反混合液好后加入到第1步反应液中-20℃长期保存3.PCR扩增高保真酶primerstar扩增，50 Hl体系如下：5XPS buffer 10Hl PCR程序：dNTP 4Hl 95℃5minHl 95℃30sHl 56℃30s , 35cyclecDNA 1 H l（可变）72℃1minR-primer 1Hl 72℃10minF-primer 1 H l 注：可根据不同基因调节退货温度，延伸时点样：5Hl PCR 产物+ iHl 6X4.PCR产物纯化1）液相纯化（产物电泳结果只含目的条带）试剂盒：Microelute cycle-pure spin protocol（OMEGA bio-tek） D6293-01①②转移至HiBind MicroElution DNA柱（套收集管），室温离心10000g, imin。
定点突变操作步骤
Muta-direct™定点突变试剂盒操作方法[A] 诱导突变基因（PCR反应）以待突变的质粒为模板，用设计的引物及Muta-direct™酶进行PCR扩增反应，诱导目的基因突变。
1. 设计点突变引物。
[注]参考引物设计指导2. 准备模板质粒DNA[注]用dam+型菌株（例如DH5α菌株）作为宿主菌。
在end+型菌株中常有克隆数低的现象，但是对突变效率没有影响。
提取质粒DNA时我们建议您使用本公司的质粒提纯试剂盒。
3. [选项]对照反应体系（50μl反应体系）10×Reaction Buffer 5μlpUC18 control plasmid（10ng/μl, total 20ng）2μlControl primer mix（20pmol/μl）2μldNTP mixture（each 2.5mM）2μlO 38μl ddH2Muta-direct™ Enzyme1μl4. 样品反应体系（50μl反应体系）10×Reaction Buffer 5μlSample plasmid（10ng/μl，total 20ng）2μlSample primer (F)（10pmol/μl）1μlSample primer (R)（10pmol/μl）1μldNTP mixture（each 2.5mM）2μlddH2O 38μlMuta-direct™ Enzyme1μl5. PCR反应条件[注]按如下参数设置PCR扩增条件。
6. PCR扩增反应完成后冰育5分钟，然后置于室温（避免反复冻融）。
[注] 按下列提供的PCR条件进行扩增，控制PCR循环数。
注意当突变点位点超过4个时会发生突变率降低的现象。
Mutation Cycles1~2Nucleotide 15cycles3Nucleotides 18cycles[B] 突变质粒选择PCR反应结束后使用Mutazyme™酶消化甲基化质粒从而选择突变质粒DNA。
AOPE基因定点突变质粒的构建及qPCR鉴定
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全质粒pcr点突变怎么成环
全质粒pcr点突变怎么成环
全质粒PCR点突变成环的原因是由于PCR反应过程中引入了一定的
误差和偏差，导致在扩增过程中出现不同长度的片段。
当模板浓度过
高或其他扩增条件未得到良好控制时，PCR反应产物容易出现非特异
性扩增，导致阳性信号较弱或产生假阳性结果。
为了避免这种情况的
发生，需要在PCR反应中加入特定的控制组和设置有效的负对照组，以保证PCR反应的特异性和准确性。
针对上述问题，我们可以采取一些措施，优化PCR反应的条件，从而避免或减少产生假阳性或虚假结论的可能性，具体措施如下：
1. 调整PCR反应体系。
对PCR反应条件进行优化，如修改引物浓度、缩短扩增时间、降低扩增温度等，以减少假阳性反应的可能性。
此外，还可采用hot-start PCR等技术减少PCR过程中异己DNA被扩增的
概率，提高特异性。
2. 加入特异性控制组。
引入特异性对照及负对照来检测扩增产物是否
真正具有特异性，以确保检测结果的真实性。
3. 检测PCR产物。
将扩增产物进行测序验证是否为特异性PCR产物，从而排除PCR反应过程中引入的误差和偏差，确保检测结果的准确性。
综上所述，针对全质粒PCR点突变成环的问题，我们可以通过合理的PCR反应条件控制、引入特异性对照组、以及扩增产物测序等方式来
保证检测结果的准确性。
这些措施不仅能够有效解决现有问题，还能
够提高PCR反应的特异性和准确性，为科研实验提供一定的指导意义。
质粒定点突变pcr原理
质粒定点突变pcr原理
质粒定点突变PCR的基本原理是利用限制性内切酶Dpn I特异性地切割双链DNA中甲基化序列Gm6ATC。
从大肠杆菌中分离的质粒已在体内的内源性Dam甲基化酶作用下被完全甲基化，因而对Dpn I的切割敏感，而半甲基化的DNA被Dpn I切割的效率较低。
相反，用四种通用脱氧核糖核苷酸体外合成的DNA没有甲基化，因而完全抵抗切割。
在定点突变后，能用Dpn I降解剩余的甲基化了的野生型模板，从而富集体外合成的未甲基化DNA。
由于Dpn I选择性地破坏亲本模板，在PCR为基础的诱变中，这一方法的主要用途是净化合成的双链DNA。
DNA定点突变实验
DNA定点突变实验标签：DNA 定点突变DNA定点突变可以：（1）研究蛋白质相互作用位点的结构、改造酶的不同活性或者动力学特性；（2）改造启动子或者DNA作用元件；（3）提高蛋白的抗原性或者是稳定性、活性、研究蛋白的晶体结构，以及药物研发、基因治疗等等方面。
详细实验方法Dpn I法实验方法原理定点突变是指通过聚合酶链式反应（PCR）等方法向目的DNA片段（可以是基因组，也可以是质粒）中引入所需变化（通常是表征有利方向的变化），包括碱基的添加、删除、点突变等。
单点突变的原理是从常规E.coli中经纯化试剂盒(Miniprep)或者氯化铯纯化抽提得到质粒。
设计一对包含突变位点的引物（正、反向），和模版质粒退火后用PfuTurbo聚合酶“循环延伸”，(所谓的循环延伸是指聚合酶按照模版延伸引物，一圈后回到引物5’端终止，再经过反复加热褪火延伸的循环，这个反应区别于滚环扩增，不会形成多个串联拷贝。
)正反向引物的延伸产物退火后配对成为带缺刻的开环质粒。
DpnI酶切延伸产物，由于原来的模版质粒来源于常规大肠杆菌，是经dam甲基化修饰的，对DpnI敏感而被切碎（DpnI识别序列为甲基化的GATC，GATC在几乎各种质粒中都会出现，而且不止一次），而体外合成的带突变序列的质粒由于没有甲基化而不被切开，因此在随后的转化中得以成功转化，即可得到突变质粒的克隆。
多点突变的原理是准备多个带突变的引物（同方向，对同一单链模版），退火后全部突变引物（不超过5个）都结合在同一环状单链模版，PfuTurbo聚合酶延伸，碰到下一个引物就停止，各片断经连接成环，和单链模版组成杂和环，Dpn I消化双链模版，也消化杂和环中的模版，只留下新合成的带多个突变的单链环（mutant ssDNA），得以转化E.coli，形成双链质粒。
资料表明，引入3个定点突变的效率为60%，5个定点突变的效率为30%。
得到的其他质粒是带有较少定点突变的质粒，以引入3个定点突变为例，就是有40% 左右的转化质粒是带有1-2个不同定点突变的质粒（因为存在1-2个引物结合模版延伸形成单链环的可能）。
突变质粒APPswe的构建
突变质粒APPswe的构建摘要：目的：将质粒APP695进行1个突变体构建。
方法：将第1785bp-1786bp （以目的基因ATG为起始）的碱基GA突变为TC，3'端去掉终止密码子TAG，克隆至pEGFP-N2载体中。
结果：构建了突变质粒APPswe。
关键词：阿尔茨海默病；APPswe；质粒前言淀粉样前体蛋白基因（amyloid precursor protein，APP）是阿尔茨海默病（AD）相关基因之一。
此基因按其转录产物的剪接方式不同可以生成至少6种 APP的亚型，其中最主要的三种为 APP695、APP751、APP770。
其中APP695蛋白主要在脑组织神经元中表达。
β淀粉样蛋白（β amyloid protein，A β）是构成 AD主要病理学特征之一，来源于APP蛋白[1][2]。
APP基因某些位点的突变可以引发某些家族的早发性 AD，瑞典家系的突变 Swedish mutations （K595N/M596L）是 APP的 595 /596位点密码子双重突变，即两个碱基对发生改变（Lys→Asn，Met→Leu），使赖氨酸被天冬氨酸置换，蛋氨酸被亮氨酸替代，从而导致 APP 的代谢过程发生改变，造成A β过度沉积〔3〕[4].实验方法：一．引物设计与合成序列（5’－3’）F01：CTCAAGCTTCGAATTCATGCTGCCCGGTTTGGCACF02：TCTGAAGTGAATCTGGATGCAGAATTCCGACR01：GCATCCAGATTCACTTCAGAGATCTCCTCCR02：GTCGACTGCAGAATTCGTTCTGCATCTGCTCAAAGP1：CCTTCTCGTTCCTGACAAP2：TGTCAATTCCGCAGGGCAP3：CTGGGGATGAGAATGAAC二．目的片段制作1.PCR扩增1-1.使用PrimeSTAR.HS DNA Polymerase（Code No.DR010S），对质粒进行PCR扩增。
PCR法突变体质粒构建
3’
5’
5’
3’
限制性内切酶的识别序列 启动子序列 定点突变 探针标记
PCR反应条件
1）PCR反应成分
（1）模板 单、双链DNA均可。 不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、
DNA结合蛋白类。 一般100ng DNA模板/100L。 模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。
（2）引物浓度
2）循环参数 (1)变性
使双链DNA解链为单链 95oC 20-30秒 (2) 退火 温度由引物长度和GC含量决定。 增加温度能减少引物与模板的非特异性结 合;降低温度可增加反应的灵敏性。
（3）延伸 70-75oC， 延伸时间由扩增片段长度决定
（4）循环次数 主要取决于模版DNA的浓度 一般为25-35次 次数过多：扩增效率降低 错误掺入率增加
PCR法突变质粒构建
PCR的基本原理
• PCR反应条件 • PCR过程 • PCR的特点
标准的PCR反应体系
4种dNTP混合物 引物 模板DNA Taq DNA聚合酶 Mg2+
各200umol/L 各10～100pmol 0.1～2ug 2.5u 1.5mmol/L
94℃
55℃
72℃
PCR循环
PCR的基本原理
0.1-0.5 mol/L
浓度过高易导致模板与引物错配,反应特 异性下降。
（3）Taq DNA聚合酶
0.5-2.5 U/50 l
酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影 响反应产量。
（4）dNTP
dNTP浓度取决于扩增片段的长度
四种dNTP浓度应相等
浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过 低则降低反应产量
• 对标本的纯度要求低
血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组 织等组织的粗提DNA
PCR法突变体质粒构建
预期实验结果与讨论
446bp 图1：产物I 电泳
图3：产物I 回收
314bp 图2：产物II 电泳
图4：产物II 回收
思考题：图1下方比较模糊的条带成因？
预期实验结果与讨论
←736bp
←736bp
图5：全长片段电泳 图6：全长片段电泳回收 图7：全长片段酶切醇沉回收
图8：载体酶切电泳
思考题：
图9：载体酶切电泳回收
• PCR反应条件 • PCR过程 • PCR的特点
1
2
3
高温变性 低温退火 适温延伸
94
温
度 72
（℃）
55
22
DNA 2
形 成
条变
单性
链
DNA单链
子链延伸 DNA加倍
与引物复性
DNA双螺旋
重复1~3步 25~30轮
目的DNA片段 扩增100万倍以上
1
2
3
4
5
时间（min）
PCR的基本原理
• •
2）循环参数 (1)变性
使双链DNA解链为单链 95oC 20-30秒 (2) 退火 温度由引物长度和GC含量决定。 增加温度能减少引物与模板的非特异性结 合;降低温度可增加反应的灵敏性。
（3）延伸 70-75oC， 延伸时间由扩增片段长度决定
（4）循环次数 主要取决于模版DNA的浓度 一般为25-35次 次数过多：扩增效率降低 错误掺入率增加
1. 电泳胶浓度及marker选择原则？
预期实验结果与讨论
图10：小提质粒 1-3：不同单克隆 4： EcoRλ14 marker 5-8：不同单克隆
123amHI/XhoI酶切验证 1-7．不同单克隆酶切 8. DL2000 marker
体外定点突变PCR法构建abl T315I突变的重组质粒标准品
体外定点突变PCR法构建abl T315I突变的重组质粒标准品石淙;张长林;简正伟;江梅;闻芳;万腊根【期刊名称】《实验与检验医学》【年(卷),期】2013(031)002【摘要】目的利用聚合酶链反应(PCR)定点突变技术构建含人类abl基因第6号外显子片段的野生型及含T315I突变型重组质粒,作为检测abl T315I基因突变的阳性对照和阴性对照标准品.方法先设计包括突变位点的两对引物,以健康人外周血基因组DNA为模板,扩增获得野生型和突变型abl基因第6号外显子片段,将其插入pSG5M-flag载体质粒中,并将所获重组质粒分别进行酶切与测序鉴定,通过紫外分光光度计检测标本的浓度和纯度.结果 DNA测序表明在预期位点上发生突变,abl 基因第315位氨基酸密码子由苏氨酸(Thr)残基突变为异亮氨酸(Ile)残基,所构建abl基因野生型和突变型质粒,经酶切和测序鉴定与目的片段完全一致.结论 PCR技术诱导定点突变准确、高效.所构建含野生型和T315I突变的abl基因重组质粒,可为检测abl基因T315I突变提供阴性和阳性对照以及质控品,同时也为T315I突变的相关研究奠定了基础.【总页数】4页(P111-114)【作者】石淙;张长林;简正伟;江梅;闻芳;万腊根【作者单位】南昌大学第一附属医院检验科,江西南昌330006;南昌大学第一附属医院检验科,江西南昌330006;南昌大学第一附属医院检验科,江西南昌330006;南昌大学第一附属医院检验科,江西南昌330006;南昌大学第一附属医院检验科,江西南昌330006;南昌大学第一附属医院检验科,江西南昌330006【正文语种】中文【中图分类】R733.72;Q343.1+3【相关文献】1.PCR定点突变法构建人抗菌肽FALL-39基因突变体及其功能的研究 [J], 杨云霞;熊文碧;冯云;王伯瑶2.采用定点突变PCR构建c-kit D816V突变的重组质粒标准品 [J], 徐芬;张长林;简正伟;江梅;万腊根3.用PCR体外定点突变技术诱导霍乱毒素A亚基突变体的构建 [J], 司艺玲;苏堤;李付广4.利用PCR介导的基因定点突变技术构建L.plantarum P-8亚油酸异构酶突变体[J], 贾丽;赵国芬;李晨曦;张和平;包秋华5.利用PCR介导的基因定点突变技术构建L.plantarum P-8亚油酸异构酶突变体[J], 贾丽;赵国芬;李晨曦;张和平;包秋华因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
重组pCMV-N-Tudor-SN点突变质粒的构建及表达
重组pCMV-N-Tudor-SN点突变质粒的构建及表达杨文栋;苏超;张春燕;赵亚丽;任媛媛;高星杰;杨洁;何津岩【摘要】目的：构建Tudor-SN蛋白的Serine426（S426）、Serine781（S781）、Threonine240（T240）和Threonine429（T429）的点突变质粒，并使该重组质粒能够在HeLa细胞中融合表达。
方法：利用定点突变技术，对Tudor-SN蛋白进行S426A、S781A、T240A、T429A点突变，通过双酶切的方法获得Tudor-SN.Mutants片段，最后将其连入到pCMV-N-Flag载体中。
在HeLa细胞中转染该质粒，利用Western blot技术检测质粒表达效率。
结果：（1）重组质粒经双酶切鉴定，可以观察到载体与Tudor-SN.Mutants的条带。
（2）转染突变质粒后可看出HeLa细胞中有Flag蛋白表达。
结论：质粒构建成功，可以用于下一步科学研究使用。
%Objective:To construct eukaryotic Flag expressing recombinant pCMV-N-Tudor-SN.Mutants-Flag. Methods:The Serine426 (S426), Serine781(S781), Threonine240(T240)andThreonine429(T429)of Tudor-SN were transformed into Alanine by site-directed mutagenesis technique. Then the Tudor-SN.Mutants were obtained by restricting double enzyme digestion, and then inserted into pCMV-N-Flag vector. The recombinant plasmids were transfected into HeLa and observed by Western blot. Results:(1)The vector and Tudor-SN. Mutants could be observed by restricting double enzyme digestion.(2)Flag was expressed by HeLa which was transfected with recombinant plasmid. Conclusion:The recombinant plasmids of pCMV-N-Tudor-SN.Mutants-Flag are constructed successfully, and may be useful for further study.【期刊名称】《天津医科大学学报》【年(卷),期】2016(000)001【总页数】4页(P5-8)【关键词】人类Tudor-SN蛋白;pCMV-N-Flag;重组质粒;融合蛋白【作者】杨文栋;苏超;张春燕;赵亚丽;任媛媛;高星杰;杨洁;何津岩【作者单位】天津医科大学细胞生物学系，天津300070;]天津医科大学基础医学研究中心，天津300070;]天津医科大学医学生物化学与分子生物学系，天津300070;天津医科大学细胞生物学系，天津300070;]天津医科大学医学生物化学与分子生物学系，天津300070;]天津医科大学基础医学研究中心，天津300070;天津医科大学细胞生物学系，天津300070; ]天津医科大学基础医学研究中心，天津300070;天津医科大学细胞生物学系，天津300070【正文语种】中文【中图分类】Q7Abstract Objective:To construct eukaryotic Flag expressing recombinant pCMV-N-Tudor-SN.Mutants-Flag.Methods：The Serine426（S426）,Serine781（S781）,Threonine240（T240）and Threonine429（T429）of Tudor-SN were transformed into Alanine by site- directed mutagenesis technique.Then the Tudor-SN.Mutants were obtained by restricting double enzyme digestion,and then inserted into pCMVN-Flag vector.The recombinant plasmids were transfected into HeLa and observed by Western blot.Results：（1）The vectorand Tudor-SN.Mutants could beobserved by restricting double enzyme digestion.（2）Flag was expressed by HeLa which was transfected with recombinant plasmid.Conclusion：The recombinant plasmids of pCMV-N-Tudor-SN.Mutants-Flag are constructed successfully,and may be useful for furtherstudy.Key words human Tudor-SN；pCMV-N-Flag；recombinant plasmid；fusion protein人类Tudor-SN蛋白，又称SND1（staphylococcal nuclease domain containing 1）或p100，该蛋白首次以EB病毒细胞核抗原2（epstein-barr virus nuclear protein 2，EBNA2）的转录共激活因子被发现[1]。
基因定点突变全攻略
基因定点突变全攻略一、定点突变得目得把目得基因上面得一个碱基换成另外一个碱基.二、定点突变得原理定点突变就是指通过聚合酶链式反应(PCR)等方法向目得DNA片段（可以就是基因组，也可以就是质粒)中引入所需变化（通常就是表征有利方向得变化）,包括碱基得添加、删除、点突变等。
定点突变能迅速、高效得提高DNA所表达得目得蛋白得性状及表征，就是基因研究工作中一种非常有用得手段。
体外定点突变技术就是研究蛋白质结构与功能之间得复杂关系得有力工具，也就是实验室中改造/优化基因常用得手段。
蛋白质得结构决定其功能,二者之间得关系就是蛋白质组研究得重点之一。
对某个已知基因得特定碱基进行定点改变、缺失或者插入,可以改变对应得氨基酸序列与蛋白质结构，对突变基因得表达产物进行研究有助于人类了解蛋白质结构与功能得关系,探讨蛋白质得结构/结构域。
而利用定点突变技术改造基因：比如野生型得绿色荧光蛋白（wtGFP)就是在紫外光激发下能够发出微弱得绿色荧光,经过对其发光结构域得特定氨基酸定点改造,现在得GFＰ能在可见光得波长范围被激发（吸收区红移),而且发光强度比原来强上百倍,甚至还出现了黄色荧光蛋白,蓝色荧光蛋白等等。
定点突变技术得潜在应用领域很广,比如研究蛋白质相互作用位点得结构、改造酶得不同活性或者动力学特性,改造启动子或者DNＡ作用元件,提高蛋白得抗原性或者就是稳定性、活性、研究蛋白得晶体结构，以及药物研发、基因治疗等等方面．通过设计引物,并利用ＰCR将模板扩增出来,然后去掉模板，剩下来得就就是我们得PCR 产物,在PCＲ产物上就已经把这个点变过来了,然后再转化,筛选阳性克隆，再测序确定就行了．三、引物设计原则引物设计得一般原则不再重复.突变引物设计得特殊原则:(1）通常引物长度为2５~４5 bp,我们建议引物长度为3０~35 bp。
一般都就是以要突变得碱基为中心,加上两边得一段序列,两边长度至少为1１—12 bｐ。
若两边引物太短了，很可能会造成突变实验失败，因为引物至少要１1-1２个ｂp才能与模板搭上,而这种突变ＰＣR要求两边都能与引物搭上，所以两边最好各设至少12个bp，并且合成多一条反向互补得引物。
点突变实验报告
一、实验目的1. 理解点突变的概念和特点。
2. 掌握点突变实验的基本原理和方法。
3. 学习利用点突变实验研究基因功能和蛋白质结构。
二、实验原理点突变是指基因序列中单个碱基的改变，导致编码的氨基酸发生变化或终止密码子的出现。
点突变实验通常采用DNA测序、蛋白质分析等方法来研究突变对基因功能和蛋白质功能的影响。
本实验以某种基因的DNA序列为研究对象，通过人工合成带有突变碱基的DNA片段，将其导入宿主细胞，观察突变对细胞生长、蛋白质表达和功能的影响。
三、实验材料1. 实验菌株：大肠杆菌DH5α2. 基因DNA模板：某基因的DNA序列3. 突变引物：针对目标基因的突变位点设计的引物4. 限制性内切酶：用于切割基因DNA5. 连接酶：用于连接突变DNA片段和基因DNA6. 载体质粒：含有T7启动子和荧光素酶基因的质粒7. DNA聚合酶：用于DNA合成8. 氨苄青霉素：用于筛选含有突变基因的细胞9. 细胞培养试剂：LB培养基、酵母提取物、葡萄糖等四、实验方法1. 突变引物设计：针对目标基因的突变位点，设计一对突变引物，分别位于突变位点的上下游。
2. 突变DNA片段合成：利用PCR技术，以基因DNA为模板，突变引物为引物，合成突变DNA片段。
3. 基因DNA切割：利用限制性内切酶，切割基因DNA和突变DNA片段。
4. DNA连接：将切割后的基因DNA和突变DNA片段连接起来，形成含有突变基因的重组质粒。
5. 质粒转化：将重组质粒转化到大肠杆菌DH5α中，筛选出含有突变基因的细胞。
6. 蛋白质表达：在含有突变基因的细胞中表达突变蛋白，检测突变对蛋白质功能的影响。
7. 细胞生长实验：比较突变前后细胞的生长速度和生长曲线，观察突变对细胞生长的影响。
8. 荧光素酶活性检测：通过荧光素酶活性检测，观察突变对蛋白质功能的影响。
五、实验步骤1. 突变引物设计：根据基因序列，设计一对突变引物，确保突变位点的准确性。
2. 突变DNA片段合成：以基因DNA为模板，利用PCR技术合成突变DNA片段。
shRNA-resistant Gankyrin质粒的构建及鉴定
shRNA-resistant Gankyrin质粒的构建及鉴定赵青;柏兆方;徐广;刘朝山;巩伟丽;周涛【摘要】Gankyrin, an oncoprotein, has been reported to be associated with tumorigenesis. Previous study in laboratory showed that Gankyrin was highly expressed in human breast cancer tissues than in adjacent normal tissues and affected the breast cancer metastasis in many stages. A shRNA-resistant Gankyrin plasmid is constructed by PCR induced site-directed mutagenesis. Identification by restriction endonuclease digestion and sequencing analysis indicated that the resistant plasmid was constructed successfully. Moreover, the expression of shRNA-resistant Gankyrin Plasmid was detected in HEK293T cells by Western blot. An important tool is provided for the further research of Gankyrin functions and its molecular mechanism in breast cancer.%gankyrin是近年来发现的一种癌基因,研究表明其表达产物Gankyrin与肿瘤发生密切相关.实验室前期工作发现Gankyrin表达水平与临床乳腺癌转移存在正相关,并可能通过多个环节影响乳腺癌的转移.本研究利用PCR介导的定点突变技术,构建了shRNA-resistant Gankyrin抵抗型质粒.经酶切鉴定及DNA测序证实序列完全正确,抵抗型质粒构建成功；经Western Blot检测,抵抗型质粒在HEK293T细胞中正确表达,为进一步研究Gankyrin在乳腺癌转移中的作用及其分子机制提供了重要的实验材料.【期刊名称】《科学技术与工程》【年(卷),期】2013(013)012【总页数】4页(P3238-3241)【关键词】Gankyrin;定点突变;抵抗型质粒;RNA干扰回复【作者】赵青;柏兆方;徐广;刘朝山;巩伟丽;周涛【作者单位】国家生物医学分析中心,北京100850【正文语种】中文【中图分类】Q343.17每年大约有90%的肿瘤患者死于肿瘤转移［1，2］。
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基因定点突变
一、定点突变得目得
把目得基因上面得一个碱基换成另外一个碱基。
二、定点突变得原理
通过设计引物,并利用PCR将模板扩增出来,然后去掉模板,剩下来得就就就是我们得ＰCＲ产物,在PＣR产物上就已经把这个点变过来了,然后再转化,筛选阳性克隆，再测序确定就行了。
三、引物设计原则
引物设计得一般原则不再重复。
突变引物设计得特殊原则：
(１）通常引物长度为２5～４5 bｐ,我们建议引物长度为30～35bp。
一般都就就是以要突变得碱基为中心,加上两边得一段序列,两边长度至少为11-12ｂp。
若两边引物太短了,很可能会造成突变实验失败,因为引物至少要1１-12个bp才能与模板搭上,而这种突变PＣＲ要求两边都能与引物搭上,所以两边最好各设至少12个ｂp,并且合成多一条反向互补得引物。
(2）如果设定得引物长度为30 bp,接下来需要计算引物得Tm值,瞧就就是否达到78℃(GC含量应大于４0%)。
(3)如果Tｍ值低于７8℃,则适当改变引物得长度以使其Ｔm值达到78℃（GC含量应大于4０%）。
(4)设计上下游引物时确保突变点在引物得中央位置。
(5）最好使用经过纯化得引物。
Ｔm值计算公式:Tm＝0、4１×(% oｆGC)–675/L+81、5
注:Ｌ：引物碱基数;%oｆGC:引物ＧＣ含量。
四、引物设计实例
以ＧＣG→ＡＣG为例：
５’-CCTCＣTTCAGTATGTAＧGＣGＡCTTACＴTAＴTGＣGＧ－3’
(1）首先设计3０bp长得上下游引物,并将A (T)设计在引物得中央位置。
Primeｒ#1: ５’-CCＴTCAGＴＡTGTAＧA CGACTTAＣTTAＴTGＣ－3’
Prｉｍｅr ＃2:５’－GCAAＴAAＧＴAAGＴCG T CTACATＡＣTGＡAGG-3’
(２)引物GC含量为40%,L为３０,将这两个数值带入Ｔm值计算公式,得到其Tm＝75、5(Ｔm=０、41×40－675/3０+８1、5)。
通过计算可以瞧出其Ｔm低于78℃,这样得引物就就是不合适得,所以必须调整引物长度。
(3)重新调整引物长度。
Primｅｒ#１: ５’-CCTＣＣＴTCAGTATGTＡG AＣGACTＴAＣTTATTGC GＧ－3’ Prｉmeｒ#2:5’-CＣGCAＡＴＡAGＴＡAGTＣG TＣTACATACTGAAGG AGG-３’
在引物两端加5mｅr（斜体下划线处),这样引物得GＣ含量为４５、7%,Ｌ值为35,将这两个数值带入Ｔｍ值计算公式,得到其Tm为80、９52(Tm＝0、41×47、5－67５/3５＋81、５）,这样得引物就可以用于突变实验了。
五、突变所用聚合酶及Bｕffer
引物与质粒都准备好后，当然就就就是做PＣR喽，不过对于ＰＣR得酶与buffeｒ，不能用平时得，我们做PＣR把整个质粒扩出来,延伸长度达到几个Ｋ,所以要用那些GC buｆｆｅｒ或扩增长片段得ｂｕffer，另外,要用保真性能较好得PFU酶来扩增,防止引进新得突变。
除了使用基因定点突变试剂盒,如Stratagene与塞百盛得试剂盒,但价格昂贵。
可以使用高保真得聚合酶,如博大泰克得金牌快速ｔａq酶、Takara得PriｍeＳTＡＲＴM HS DNA po ｌymeraｓe。
六、如何去掉ＰＣＲ产物
最简单得方法就就就是用DｐnI酶,ＤｐnI能够识别甲基化位点并将其酶切，我们用得模板一般都就就是双链超螺旋质粒,从大肠杆菌里提出来得质粒一般都被甲基化保护起来(除非您用得就就是甲基化缺陷型得菌株）,而ＰＣＲ产物都就就是没有甲基化得,所以DpｎI 酶能够特异性地切割模板(质粒)而不会影响PCＲ产物，从而去掉模板留下PCR产物，所以提质粒时那些菌株一定不能就就是甲基化缺陷株。
DｐnＩ处理得时间最好长一点,最少一个小时吧，最好能有两三个小时,因为如果模板处理得不干净,哪怕只有那么一点点，模板直接在平板上长出来，就会导致实验失败。
七、如何拿到质粒
直接把通过DｐnI处理得PＣＲ产物拿去做转化就行了,然后再筛选出阳性克隆，并提出质粒，拿去测序,验证突变结果。
八、图示
九、定点突变操作步骤
［Ａ] 诱导突变基因(PＣＲ反应)以待突变得质粒为模板,用设计得引物及Mｕtａ-diｒｅct™酶进行PCR扩增反应,诱导目得基因突变。
1、设计点突变引物。
[注]参考引物设计指导
２、准备模板质粒DN A
[注]用dam+型菌株(例如DH5α菌株)作为宿主菌。
在end+型菌株中常有克隆数低得现象，但就就是对突变效率没有影响。
提取质粒DNＡ时我们建议您使用本公司得质粒提纯试剂盒。
3、[选项］对照反应体系(50μｌ反应体系)
10×RｅactiｏｎBuffer ５μｌ
ｐUC1８conｔrol ｐlａsｍid(１0ng/μl，
2μl
total 20nｇ)
Coｎtrｏl primｅr mix(２０pｍoｌ/μl) 2μｌ
dNTP mｉxturｅ（eacｈ2.5mＭ）2μｌ
dH２O 38μl
Muta-direｃt™ Enzymｅ1μｌ
4、样品反应体系(50μl反应体系)
５、PＣR反应条件
[注]按如下参数设置PCＲ扩增条件。
6、PCR扩增反应完成后冰育5分钟，然后置于室温(避免反复冻融)。
［注] 按下列提供得PＣR条件进行扩增,控制ＰＣR循环数。
注意当突变点位点超过4个时会发生突变率降低得现象。
[B] 突变质粒选择
PCR反应结束后使用Mｕtａzｙme™酶消化甲基化质粒从而选择突变质粒DNA。
1、准备ＰCR反应产物
2、加入1μｌ(10Ｕ/μl)Mｕtaｚyｍｅ™酶37℃温育1小时。
[注]当质粒DNＡ用量过多时Mutazymｅ™酶可能发生与样品反应不完全得现象。
因此我们建议为了保证突变率请严格遵照实验步骤进行操作。
如果突变率低,可以适当延长反应时间或增加Muｔazyｍe™酶用量。
[Ｃ]转化
反应完毕后在质粒DNＡ上会产生缺口，当把这个质粒ＤＮA转入E、cｏlｉ中时请选择ｄａm+型菌株,例如DH5α。
1、将１0μｌ样品加到５0μl感受态细胞里，然后放置在冰上３0分钟。
2、接下来可以参照一般得转化步骤进行。
序列分析
通常当LＢ平板上出白色菌落则表明发生了突变。
为了证实这一结果,我们建议对白色单菌落进行测序分析。