第10讲反刍动物蛋白质评定
反刍动物饲料蛋白质瘤胃降解率的评定技术
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降解率 3 ! 4 （515’ 4 *’ 6 7’） 8 9’ 其中： *’ 为通过十二指肠的微生物氮的数 量； 7’ 为通过十二指肠的内源含氮物质的数量； 515’ 为通过十二指肠的非氨态氮的数量； 9’ 为 。 动物的氮进食量 （单位： : 8 ;） 体内法是用真胃瘘管或十二指肠瘘管结合微 生物的天然标记物或其他标记物测定以下三项内 容： 测定十二指肠食糜流通量； 测定通过十二 !） ,） 指肠的内源含氮物质数量； 测定通过十二指肠 <） 的微生物氮的数量。通过测定得到日粮非降解蛋 白质的数量， 计算蛋白质的降解率。体内法测定 结果可靠， 能准确反应蛋白质在瘤胃的降解， 但是 这种方法既花费大量的时间， 又消耗大量的人力、 物力， 对设备要求高， 非常繁琐， 不易推广。 （ !"<.） 应用圆柱状天然丝 ,2, 尼龙袋法 =>?@ 袋研 究 饲 料 在 羊 瘤 胃 中 的 消 化。 ABC%DEF@ 等 （!"#,） 应用尼龙袋法评定甲醛处理饲料对蛋白质 在瘤胃中降解的影响； （!"#"） =GHI%J 和 *+’%@FK; 提出尼龙袋法估测蛋白质消失率的数学模型。近 年来， 尼龙袋法越来越多地用于测定饲料蛋白质 的降解率。我国已制定了尼龙袋法的试行方案。 该法是将待测饲料装入尼龙袋内， 通过瘤胃 瘘管放入瘤胃内培养， 按不同的时间取出尼龙袋， 测定饲料蛋白质在瘤胃内不同停留时间的消失 率， 再结合外流速度计算饲料蛋白质的有效降解 率。该法在活体内进行， 成本低， 简便易行， 能够 较实际的反映出瘤胃内环境条件， 可以进行大量 测定， 并且与体内法有很大的相关性。所以该法 已在世界广泛应用。但是， 许多因素影响尼龙袋 法的测定结果， 如尼龙袋的规格、 样品量、 待测样 品颗粒大小、 培养时间、 冲洗方法及时间、 日粮及 饲养水平、 动物品种及其生理状况等。 ,2< 溶解度法 溶解度法是根据饲料在缓冲液 中的溶解度评定饲料蛋白质降解率的方法。 ;D
反刍动物瘤胃蛋白质降解率的评定技术
般 都 通 过估 计 而 得。此 外， 自食 糜 流 量 和 来
刍动物蛋 白质 营 养 新体 系 。这 些 新蛋 白质 体 系 的 ＭＣ Ｐ量 测定 的 误 差， 验 动 物 样 本 大 小及 试 验动 试 共同点 就 是 把 饲 料 蛋 白质 分 成 瘤 胃可 降 解 蛋 白 物在安装瘘管后的状 态与正常动物差别等 因素导 （Ｄ ） Ｒ Ｐ 和瘤 胃非 降解蛋 白（ Ｐ 两 部分 ． 者可 被 致 的误差也难 以克 服。 ＵＤ ） 前 瘤 胃 内 的 微 生 物 降 解 并 用 于 合 成 微 生 物 蛋 白 体内法既 花 费 大 量 时 间 ． 又消 耗 大 量 的 人力 、 （ Ｐ， ＭＣ ）因此进 入反 刍动物十 二指肠 的 蛋 白质 就 由 物力． 对设备要求高． 非常繁琐， 不易推广． 所以不 Ｕ ＤＰ和 ＭＣ Ｐ组 成， 新 蛋 白质 营 养 体 系 中， 肠 能 作为通 用 的常 规 评 定方 法 。但是 由于 体 内法 最 在 小 可 消化 蛋 白质是 评 定饲 料 蛋 白 质营 养 价 值 和动 物 接 近动物 的生理条 件， 它仍 然 是评 定 和校 正 其他方 蛋 白质 需要 的基础 。而 ＭＣ Ｐ的产 生 又需 要 由饲 料 法 的参考 。此外 ， 内法还 可测 定 ＭＣ 体 Ｐ合 成效率 、 蛋 白质 在瘤 胃被降解提供 氮 源 ， 以饲 料 蛋 白质 在 碳水化台物在瘤胃中的降解率和评定能氮平衡等。 所 痼 胃中的降 解率 是 反刍 动 物 小肠 蛋 白质 新 体 系 的 ２ 尼龙袋 法 基本参 数 。经过 近 ２ ０年 的研 究， 胃蛋 白降解 率 瘤 尼龙袋法 从 ３ ０年代 被提 出 以后 。 因其 操作 简 测定手 段不 断 改 进． 其方 法 主 要有 体 内法 、 体 内 单 ， 半 耗费低 已经 在世界上 广泛 应 用于评 价 饲 料蛋 白 法（ 尼龙 袋法 ）体 外法 （ 、 酶解 法 、 解 法 、 工 瘤 胃 质的瘤胃降解率。该法是将待测饲料装入尼龙袋 溶 人
第十章 反刍动物营养实验技术.(DOC)
第十章反刍动物营养实验技术第一节人工瘤胃技术一. 人工瘤胃技术概述人工瘤胃技术是体外研究瘤胃微生物营养与代谢的一类技术方法，又称瘤胃模拟培养法。
由于人工瘤胃技术不受试验动物的限制，可以在常规实验室条件下进行研究，因此得到了越来越广泛的应用。
早期的人工瘤胃技术主要应用于较简单的研究目的。
如Woodman和Evans(1938)，通过体外瘤胃发酵证实纤维素在瘤胃内降解的唯一中间产物是葡萄糖，终产物是VFA 和乳酸。
Quin（1943）用体外法研究了不同碳水化合物瘤胃发酵的产气量。
Pearson 和Smith（1943）用体外法研究了瘤胃微生物对尿素的利用等。
McDougall（1948）关于绵羊唾液矿物质组成的研究在人工瘤胃技术发展史上具有重要意义，之后的各种人工瘤胃系统人工唾液的配制均参照了McDougall的研究结果。
早期的人工瘤胃发酵装置比较简单，不少装置仅是在厌氧的条件下对瘤胃液进行简单的培养。
由于发酵产物在系统内的不断积累，这类系统不能用于要求长时间发酵的研究工作，通常有效的发酵时间为12～24小时。
Louw于1949年设计了一套带有透析系统的人工瘤胃装置，将瘤胃液和底物放入渗析袋或半透膜中，然后悬浮在缓冲液内。
该装置在一定程度上将底物和发酵终产物分离开，延长了有效发酵时间。
二十世纪五十年代至六十年代，人工瘤胃技术在牧草有机物和纤维素瘤胃降解研究方面得到了大量应用。
用人工瘤胃技术研究的内容包括不同牧草以及牧草与纯纤维体外降解速度比较；牧草颗粒大小对体外降解速度的影响；体外评定牧草营养价值；用体外牧草发酵测定结果预测体内发酵等。
这一阶段的人工瘤胃装置也趋于复杂，以更加接近瘤胃发酵的真实情况。
如Donfer使用的发酵装置由32个发酵瓶组成，每个发酵瓶的容积为90ml，装入的发酵液容量为50ml。
每个瓶均有进气口和出气口，以每分钟160个气泡的速度向瓶内通入二氧化碳。
二十世纪七十年代，随着反刍动物蛋白质营养研究的深入，人工瘤胃技术开始应用于饲料蛋白质的瘤胃降解率评定。
牛羊类反刍动物饲料的营养成分评定
牛羊类反刍动物饲料的营养成分评定1 饲料营养成分评定方法1.1 常规成分分析法我国目前沿用的饲料成分常规分析法是德国人Hennebery和Stohmann于1862年在Weende实验站提出的概略养分分析方法。
该方法将饲料成分划分为水分、粗蛋白质、粗纤维、粗脂肪、粗灰分、无氮浸出物6大营养成分来评定饲料的营养价值。
由于每一类都可细分且结构复杂，所以称为“粗养分”。
Weende分析方法是饲料营养价值评定的基础，自诞生以来就在饲料的营养价值评定中起着十分重要的作用，但该方法对纤维成分的划分很不明确，不能很好地区分纤维素、半纤维素和木质素。
1.2 范式纤维分析法范氏（Van Soest）分析方法是在Weende分析方法的基础上建立起来的，对粗纤维和无氮浸出物这两个指标进行了修正和重新划分。
对于反刍动物来讲，仅用常规营养成分来评价粗饲料的营养价值是不够的，因为粗饲料的消化率与纤维物质关系密切，而粗纤维并不能完全代表所有的纤维物质，粗纤维除了包含所有的纤维素外，还包含部分半纤维素和木质素。
在评定饲草和纤维性饲料时，一旦测出饲料的NDS（中性洗涤可溶物）、ADF（酸性洗涤纤维）、NDF（中性洗涤纤维）、ADL（酸性洗涤木质素），就可以单独或配合使用这些测定值来评定饲料的营养价值。
邓卫东等研究表明，饲料干物质体外消化率与NDF呈极显著负相关(P<0.01)，与CP含量呈显著正相关，而且粗饲料干物质体外消化率（IVDMD）与CP、ADF和ADL含量之间存在显著的回归关系，回归方程分别为：Y=103.678-1.981×ADF+2034×ADL(R2=0.897)；Y=18.083+1.650×CP(R2=0.813)。
VanSoest分析方法对动物纤维性物质营养研究和高产奶牛饲料营养价值评定的发展和进步作出了历史性贡献。
但是由于反刍动物具有特殊的消化道结构及消化生理，因此仅根据化学分析很难说明反刍动物对饲料的消化和利用情况，因而不能较好地反映饲料的营养价值，在使用过程中存在一定的局限性。
反刍动物饲料营养价值的评定
体重,kg 体重,kg 400 500 600 700 Mcal 7.60 8.98 10.30 11.57 母牛维持的产奶净能需要 产奶净能 NND MJ 31.80 10.13 37.57 11.97 43.10 13.73 48.41 15.43
每kg奶的能量需要 kg奶的能量需要 乳脂率(%) 乳脂率(%) 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 产能奶净NND 产能奶净 Mcal MJ 0.60 2.51 0.65 2.72 0.70 2.93 0.75 3.14 0.80 3.35 0.84 3.52
国外的估测模型
法国INRA(1989)： 法国 ： OM消化率 = 87.9 – 2.58ADL r = 0.81 消化率,% 消化率 或=91.9 – 0.355NDF + 0.387ADF – 0.392EE r = 0.87 德国Close和Menk(1986)： 德国 和 ： OM消化率 = 91.1 – 0.88CF 消化率,% 消化率 能量消化率,% 能量消化率 = 83.3 - 0.15x – 0.0151x2， x = CF 澳大利亚CSIRO: 澳大利亚 DM消化率 = 83.58 – 0.824×(ADF,%)+2.62×(N,%) 消化率,% 消化率 × × 美国NRC: 美国 用模型分别计算各种有机物质的消化率
反刍动物饲料营养价值评价(精)
此体系将饲料的碳水化合物分为4局部：CA为糖类，在瘤胃 中可快速降解；CB1为淀粉，为中速降解局部；CB2是可利 用的细胞壁，为缓慢降解局部；CC局部是不可利用的细胞 壁。碳水化合物的不可消化纤维为木质素x2.4。将蛋白质分 为3局部：非蛋白氮〔NPN〕、真蛋白质和不可利用蛋白质。 这3局部分别被描述为PA〔NPN〕、PB〔真蛋白〕和PC 〔结合蛋白质〕。真蛋白质又被进一步分为PB1、PB2和 PB3三局部。PA和PB1在缓冲液中可溶解，PB1在瘤胃中可 快速降解，PC含有与木质素结合的蛋白质、单宁蛋白质复 合物和其他高度抵抗微生物和哺乳类酶类的成分。在酸性洗 涤剂中不能被溶解〔ADFIP〕。在瘤胃中不能被瘤胃细菌降 解，在瘤胃后消化道也不能被消化。PB3在中性洗涤剂中不 溶解〔NDFIP〕。但可在酸性洗涤剂中溶解，由于PB3与细 胞壁结合在一起，因而在瘤胃中可缓慢降解，其中大局部可 逃脱瘤胃降解。缓冲液不溶蛋白质减去中性洗涤不溶粗蛋白， 剩余局部为PB2。局部PB2在瘤胃中可被发酵，局部流入后 肠道中。
➢这些试验方法各有优缺点，但是将饲养试验、 消化代谢试验、比较屠宰试验、气体代谢试 验和绝食代谢试验相结合，是集各种方法的 优点进行综合系统分析的理想方法之一，也 是目前应用最广泛的研究方法。
1、能量的研究方法
• 能量需要的研究方法仍以饲养试验、消化 代谢试验、气体代谢试验及比较屠宰试验4 种方法为主。
• 目前主要有单一胃蛋白酶或单一纤维素酶 酶解法和蛋白酶一纤维素酶的复合酶解法。
优点• 测定ຫໍສະໝຸດ 境易于标准化，稳定性高，实验室 之间可比性强。能大批量在实验室进行操 作，效率高，成本较低，不必维持实验动 物，是有前途的实验室评定方法。
缺乏
• 由于各国研究者所采用的酶程序不同，致 使结果无法比较。酶解法只测定某一时间 点的降解率而忽略了动态降解率。而且由 于酶的特异性，用单一酶或少数几种酶构 成的复合酶很难模拟瘤胃中微生物对蛋白 质的复杂消化过程。酶解法对于能量含量 较高的饲料，可能优于尼龙袋法，但对于 粗饲料测定的重复性很差。如果对粗饲料 进行分类估测。则可明显提高酶解法与尼 龙袋法的相关。
单胃动物和反刍动物饲料蛋白质质量的评定方法
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比较反刍动物蛋白质营养价评价旧体系的特点
比较反刍动物蛋白质营养价评价旧体系的
特点
蛋白质对反刍动物来说是非常重要的营养来源,同时也是维持反刍动物正常生命活动的必需物质,适宜添加蛋白质有助促进动物的生长及发育.传统的可消化蛋白饲料评价体系或粗蛋白评价体系,虽然在动物生产应用上使用具有科学合理性,但由于反刍动物有着特殊的瘤胃消化生理结构和微生物消化方式,对反刍动物而言存在很大的不足.1977年以来,基于反刍动物独特的瘤胃消化生理结构及微生物消化方式,各国纷纷提出新的饲料蛋白营养价值评定体系,各体系中新的饲料蛋白评价体系在经过长期的科学研究中不断补充完善.因此,试验就反刍动物饲料蛋白质营养价值评定体系,饲料蛋白评定技术,评定方法进展及存在的问题进行综述.。
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（三）研究结果
1、用体外培养技术测定的uAA（Y，g/kg） 与用体内法计算的uCP（X，g/kg）之间 存在高度相关。 2、用本技术测定的饲料uAA组成与反刍动 物小肠道食糜氨基酸组成（Clark，1992） 非常接近。
400 Determined uAA (g.kg ) 300 200 100 0 0 100 200 300
-1
y = 0.95x - 1.39 r2 = 0.85, n=30
-1
400
Calculated uCP(g.kg ) Fig.1 The relationship between calculated uCP and determined uAA with rumen fluid of cow
本研究结果与他人结果比较
第十讲 反刍动物饲料蛋白质 的评定
赵广永
中国农业大学动物科技学院
一、反刍动物消化生理特点
反刍动物——肉牛
反刍动物——奶牛
反刍动物——绵羊
成年反刍动物的复胃结构
食管 瘤胃背囊
瘤胃腹囊
网胃
瓣胃
小肠
真胃
瘤胃微生物——细菌
瘤胃微生物—原虫
瘤胃微生物—厌氧真菌
饲料蛋白质在瘤胃中的代谢规律
瘤胃
（三）研究结果
用体外培养技术测定的UCP (X, g/kg)与用Lebzien等（1996）的回归公 式计算的UCP (Y, g/kg) 存在显著相关 关系。
图 1 计算uCP与24 h培养发酵uCP之间的 相关关系 400 350 300 250 200 150 100 50 0 0
计算uCP [g/kg DM]
Fig. 4 Comparison of methionine,lysine and leucine percentage in duodenal protein, in rumen microbial protein, and in incubation residues incubated with rumen fluid from sheep
-1 2
r =0.62, n=12, p<0.01
r =0.77, n=12, p<0.001
2
150.0
170.0
Nitrogenous compounds (g • d ) CP intake in vitro-uTP TP intake in vivo-uTP
(四）结论
１、Zhao and Lebzien (2000) 可用于测定绵 羊混合日粮的uTP。 ２、体内uTP可以根据体外与体内uTP之间 的关系进行估测。
四、可利用氨基酸测定技术
（一）反刍动物可利用氨基酸的概念 把到达小肠的饲料非降解蛋 白的氨基酸和瘤胃微生物蛋白的 氨基酸作为一个指标——可利用 氨基酸（UAA）测定。
（二）材料与方法
1、动物及其饲养：装有瘤胃瘘管的奶牛，以干 草作为饲料，每天饲喂两次，自由饮水。或绵 羊，饲以混合日粮，自由饮水。 2、体外发酵技术：在Zhao和Lebzien（2000）体 外方法的基础上改进。 3、饲料样品：奶牛：30种饲料；绵羊：33种饲 料。风干、粉碎过3mm网筛。 4、体外发酵时间：24小时。 5、测定方法：发酵结束时，测定pH值，将发酵 液（固体和液体）冻干。测定其中氨基酸含量 和组成，即为该饲料的可利用氨基酸。
饲料 蛋白质
Clark,1992
微生物 蛋白质
Clark,1992
小肠 蛋白质
Lebzien, 1997
试验1
试验2
蛋氨酸 赖氨酸 亮氨酸
1.9 0.9—2.4 5.1 3.1—7.3 8.8 7.6—12.8
2.6 1.1—4.9 7.9 4.9—9.5 8.1 5.3—9.7
2.0 0.6—3.0 6.7 4.7—9.5
Methionine content of incubation
residues (g.kg )
5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 0.0 15 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 29 27 28 30 31
（三）小肠蛋白质的测定技术
1、瘤胃非降解蛋白质测定技术 尼龙袋技术 2、瘤胃微生物蛋白质测定技术
装有瘤胃瘘管的奶牛
尼龙袋的固定方法
不同饲料营养成分瘤胃降解率的比较
饲料营养物质的瘤胃降解数学模型
dp = a+b（1-e-ct）
其中：
dp = 瞬时降解率，% a = 快速降解成分，% b = 慢速降解成分，% c = 慢速降解成分的降解速率，%/h t = 降解时间，h
图４含氮化合物采食量与氮沉积之间的关系
14.0
2
y=0.09x+4.52
2
y=0.04x+6.06 r =0.63, n=12, p<0.01
r =0.78, n=12, p<0.001 13.0
N retention (g • d )
-1
12.0 y=0.04x+5.73 11.0 10.0 y=0.04x+5.52 9.0 8.0 50.0 70.0 90.0 110.0 130.0
饲料非降解蛋白
流入后部消化道 日粮蛋白质
氨、 肽类、 氨基酸
微生物蛋白
二、反刍动物蛋白质评定体系
（一）反刍动物粗蛋白质评定 体系的主要特点
1、以粗蛋白质作为指标 2、没有考虑含氮化合物在瘤胃中的代 谢过程 3、没有考虑到达小肠的蛋白质数量 4、没有考虑到达小肠蛋白质的氨基酸 组成
（二）反刍动物蛋白质新体系的 主要特点 到达小肠的蛋白质= 非降解蛋白UDP+微生物蛋白MCP
y = 0.85x + 18.0 r2 = 0.84
50 100 150 200 250 300 350 400 体外uCP [g/kg DM]
（四）结论
1、体外培养24小时（X，g/kg）的uCP与 根据体内法计算的uCP（Y，g/kg）相关 关系最密切： Y=0.85X +18.0， r2=0.84， p<0.001 2、该体外培养技术可用于测定单一饲料或 混合饲料的可利用粗蛋白。
图１体外uTP和体内uTP之间的关系
9.0
8.0
y = 0.45x + 1.23 r = 0.87, n =12, p<0.001
2
In vivo -uTP (% DM)
7.0
6.0
5.0
4.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 14.0 In vitro -uTP (% DM)
图２含氮化合物与体外uTP之间的关系
14.0 y=1.17x+0.54 r =0.94, n=12, p<0.001
2
In vitro -uTP (% DM)
12.0
10.0 y=1.04x-0.25 r =0.93, n=12, p< 0.001 8.0
2
6.0 5.0 7.0 9.0 11.0 13.0 Nitrogenous compounds (% DM) CP TP
图３含氮化合物与体内uTP之间的关系
9.0 y=0.52x+1.59 r =0.78, n=12, p<0.001
2
8.0
In vivo -uTP (% DM)
7.0
6.0 y=0.46x+1.26 5.0 r =0.77, n=12, p<0.001
2
4.0 5.0 7.0 9.0 11.0 13.0 Nitrogenous compounds (% DM) CP TP
-1
26
32
33
Lysine content of incubation residues
12.0
(g.kg )
-1
9.0 6.0 3.0
1 2 3 4 6 5
7 10 9 8 11 12 13 14 15 16
17 19 18 20 21 22 23 26 24 25 27
28 29 30 31 32
-1
（四）结论
1、我们提出的体外培养技术可用于反 刍动物饲料可利用氨基酸的测定。 2、分别用奶牛（饲喂干草）和绵羊 （饲喂混合日粮）瘤胃液测定的可 利用氨基酸结果存在高度相关。因 此，为节约成本可用绵羊作为瘤胃 液供体。
五、可利用真蛋白的研究
（一）研究背景 uCP测定方法简单, 成本低，但不够精确； uAA精确但测定成本高；uTP测定简单，且比 较精确。 （二）材料与方法 １、动物：三只成年绵羊 ２、12种典型日粮 ３、四个３×３拉丁方设计 ４、双标记物（PEG, Cr2O3) （三）结果
微生物蛋白质测定技术
1、二氨基庚二酸法（DAPA法） 2、十二指肠核酸法（RNA法） 3、应用同位素35S、15N、32P作为标记 物测定微生物氮 4、应用尿液嘌呤衍生物估测瘤胃微生 物氮的产量
（四）反刍动物蛋白质新体系的不足
1、UDP用尼龙袋法测定, 而尼龙袋法 难以进行标准化。 2、MCP用RNA、DAPA或同位素等标 记物法测定, 费时、费力。
2.1 1.6—2.3 7.2 3.9—9.4
2.2 1.6—3.5 7.6 4.5—10.7 9.0 7.9—12.5
9.3 8.6 6.8—11.9 7.6—11.3
Zhao and Lebzien，2002
Methionine content of incubation
residues (g.kg )
33
Leucine content of incubation residue
15.0