盐析法纯化免疫球蛋白
盐析法纯化免疫球蛋白
★★★★★盐析法纯化免疫球蛋白撰稿欧阳笑梅原理主要材料盐析的操作步骤影响盐析的因素(一) 原理蛋白质在水溶液中的溶解度是由蛋白质周围亲水基团与水形成水化膜的程度，以及蛋白质分子带有电荷的情况决定的。
当用中性盐加入蛋白质溶液，中性盐对水分子的亲和力大于蛋白质，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失。
同时，中性盐加入蛋白质溶液后，由于离子强度发生改变，蛋白质表面电荷大量被中和，更加导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。
(二) 主要材料1. 试剂:(1) 正常人混合血清；灭菌生理盐水。
(2) 饱和硫酸铵溶液的配制:称(NH4)2SO4(AR)400～425克，以50～80℃之蒸馏水500ml溶解，搅拌20分钟，趁热过滤。
冷却后以浓氨水(15N NH4OH)调PH至7.4。
配制好的饱和硫酸铵，瓶底应有结晶析出。
(3) 萘氏试剂配制：称HgI11.5克，KI8克，加蒸馏水至50ml，搅拌溶解后，再加入20％NaOH 50ml。
(4) 0.02M, PH7.4磷酸盐缓冲盐液(Phosphate Buffered Saline PBS)配制:贮存液:A液：0.2M Na2HPO4：Na2HPO4·12H2O 71.64克，加蒸馏水至1000ml；B液: 0.2M NaH2P4：NaH2P4·2H２O 3.12克，加蒸馏水至1000ml；应用液：取A液81ml加B液19ml混合，再以生理盐水作10倍稀释即成。
(5) 0.1M, PH7.4磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffer PB)配制:将上述A液取81ml与B液19ml混合，再以蒸馏水对倍稀释即成。
(6) 20％磺基水杨酸。
2. 器材:普通冰箱、离心机、电磁搅拌器，751桮型紫外分光光度计、扭力天平，粗天平。
透析袋、尼龙绳、细竹棒、精密PH试纸(PH5.5～9.0)、眼科镊子、小剪刀。
烧杯、量筒、吸管、滴管、灭菌小瓶、试管等。
常用的蛋白质纯化方法和原理
常用的蛋白质纯化方法和原理蛋白质的纯化是生物化学研究中非常重要的一步，纯化蛋白质可以用于结构解析、功能研究、动态过程研究等各种生物学实验。
常用的蛋白质纯化方法有盐析法、凝胶过滤法、离子交换色谱法、亲和色谱法、逆渗透法和层析法等。
下面将对这些方法的原理和步骤进行详细阐述。
1. 盐析法盐析法是根据蛋白质在溶液中的溶解性随盐浓度的变化而变化的原理进行蛋白质的纯化。
该方法是利用蛋白质在高盐浓度下与水结合能力降低，使其从溶液中沉淀出来。
应用盐析法时，需要先调节溶液的盐浓度使蛋白质溶解，然后逐渐加入盐使其过饱和，蛋白质便会析出。
最后通过离心将蛋白质的沉淀物分离，得到纯化的蛋白质。
2. 凝胶过滤法凝胶过滤法是利用凝胶的pores 来分离蛋白质的一种方法。
凝胶通常是聚丙烯酰胺（也称作Polyacrylamide）或琼脂糖。
研究者将蛋白质样品加入到过滤膜上，较小的蛋白质能够通过pores，较大的分子则被排出。
通过选择不同大小的凝胶孔径，可以根据蛋白质的大小来选择合适数目的过滤膜。
凝胶过滤法需要进行缓冲液体积的连续换流，将蛋白质与其他杂质分离开来。
3. 离子交换色谱法离子交换色谱法是利用蛋白质与离子交换基质之间静电吸引力的不同而分离的方法。
离子交换基质通常是富含正离子或负离子的高分子材料。
在离子交换色谱法中，样品溶液在特定的pH 下流经离子交换基质，带有不同电荷的蛋白质能够与基质发生反应，吸附在基质上。
为了获得纯化蛋白质，需要通过梯度洗脱，逐渐改变缓冲液pH 或离子浓度，使吸附在离子交换基质上的蛋白质逐渐释放出来。
4. 亲和色谱法亲和色谱法是利用蛋白质与特定的配体相互作用特异性进行分离的方法。
配体可以是天然物质，如金属离子、辅酶或抗体，也可以是人工合成的结构。
在亲和色谱法中，样品溶液经过含有配体的固定相，与配体发生特异性相互作用，蛋白质与其它组分分离。
然后可以通过改变某些条件（如pH、温度或离子浓度）来洗脱纯化的蛋白质。
IgG纯化指南
抗体的提取与纯化精制免疫球蛋白的方法很多。
一般采用综合技术，避免蛋白变性。
如分离IgG时，多结合使用盐析法与离子交换法，以求纯化。
提取IgM的方法也很多，如应用凝胶过滤与制备电泳法，或离子交换与凝胶过滤等。
一、盐析法1.取x ml血清加x ml生理盐水，于搅拌下逐滴加入2x ml饱和硫酸铵，硫酸铵的终饱和度为50%。
4℃，3h以上，使其充分沉淀。
2.离心（3000rpm）,20min,充上清，以x ml生理盐水溶解沉淀，再逐滴加饱和硫酸铵x/2ml。
置4℃3h以上（此时硫酸铵的饱和度为33%）。
3.重复上述第二步过程1～2次。
末次离心后所得沉淀物为γ-球蛋白，以 pH7.4 PBS溶解至x ml装入透析袋。
4.对PBS充分透析、换液3次，至萘氏试剂测透析外液无黄色，即无NH4+为止。
5.取透析袋内样品少许作适当倍数稀释后，以751型紫外分光光度计测定蛋白含量。
影响盐析的因素很多，如蛋白质的浓度，盐的浓度，饱和度和pH，温度等都可影响盐析的结果，操作时要充分注意。
（1）蛋白质的浓度盐析时，溶液中蛋白质的浓度对沉淀有双重影响，既可影响蛋白质沉淀极限，又可影响蛋白质的共沉作用。
蛋白质浓度愈高，所需盐的饱和度极限愈低，但杂蛋白的共沉作用也随之增加，从而影响蛋白质的纯化。
故常将血清以生理盐水作对倍稀释后再盐析。
（2）离子强度各种蛋白质的沉淀要求不同的离子强度。
例如当硫酸铵饱和度不同，析出的成分就不同，饱和度为50％时，少量白蛋白及大多数拟球蛋白析出；饱和度为33％时γ球蛋白析出。
（3）盐的性质最有效的盐是多电荷阴离子。
（4）PH值一般说来，蛋白质所带净电荷越多，它的溶解度越大。
改变PH改变蛋白质的带电性质，也就改变了蛋白质的溶解度。
（5）温度盐析时温度要求并不严格，一般可在室温下操作。
血清蛋白于25℃时较0℃更易析出。
但对温度敏感的蛋白质，则应于低温下盐析。
（6）蛋白质沉淀后宜在4℃放3小时以上或过夜，以形成较大沉淀而易于分离。
血清免疫球蛋白G的分离纯化及鉴定
实验八血清免疫球蛋白G的分离纯化及鉴定为了初步掌握蛋白质的分离纯化技术，选择了从家畜血清中分离纯化免疫球蛋白G （Immunoglobulin G，简称IgG）的实验。
血清中的蛋白质有数十种之多，IgG是球蛋白的一种。
分离纯化蛋白质的方法是利用不同蛋白质的某些物理、化学性质（如在一定条件下带电的情况、分子量、溶解度等）的不同而建立起来的，其中有盐析、离子交换、凝胶过滤、亲和层析、制备电泳和超速离心等。
在分离纯化时，要根据情况选用几种方法互相配合才能达到分离纯化一种蛋白质的目的。
本实验采用硫酸铵盐析、DEAE-纤维素离子交换及凝胶过滤等方法，提取家畜血清中IgG。
其原理及操作如下：㈠硫酸铵盐析1.试剂饱和硫酸铵溶液pH7.0：称取（NH4）2SO4760g,加蒸馏水至1000ml，加热至5℃，使绝大部分硫酸铵溶解，置室温过夜，取上清液，用氢氧化铵调pH至7.0。
（内含0.15mol/L NaCl，简称PBS）：取0.2mol/L Na2HPO4磷酸缓冲溶液（0.01mol/L，pH7.0）溶液30.5ml，0.2mol/L NaH2PO4溶液19.4ml，加NaCl8.5g，加蒸馏水至1000ml。
磷酸缓冲溶液（0.0175mol/L，pH6.7）（不含NaCl，简称PB）：取0.2mol/L Na2HPO4溶液43.5ml，0.2mol/L NaH2PO4溶液56.6ml混合，用蒸馏水稀释至1000ml。
2.操作①取家畜血清5ml，加磷酸缓冲溶液（0.1mol/L，pH7.0）5ml，混匀，滴加（边摇边搅拌）饱和硫酸铵4ml（此时溶液硫酸铵饱和度约为20%）。
静置20min，以3000r/min 离心15min，沉淀为纤维蛋白（弃去），上清液中含清蛋白、球蛋白。
②取上清液，再加饱和硫酸铵溶液6ml（方法同前），此时溶液硫酸铵饱和度为50%，静置20min，以3000r/min 离心15min，上清液中含清蛋白，沉淀为球蛋白。
盐析沉淀法纯化血浆中的免疫球蛋白
实训4-1盐析沉淀法纯化血浆中的免疫球蛋白【实训目的】1、掌握盐析的原理。
2、掌握盐析的操作技术。
【实训原理】其原理是蛋白质在高浓度的盐溶液中，随盐浓度的逐渐增高，蛋白质表面的电荷被中和，水化膜被破坏，蛋白质分子相互聚集而从溶液中沉淀析出。
【实训设备、材料和试剂】1.器材离心机2.试剂血浆、磷酸盐缓冲液（0.2mol/L,PH8.0）、Na2SO4。
【实训过程】1.血浆清蛋白与球蛋白分离①取血浆10ml置于100ml烧杯中，加磷酸盐缓冲液10ml搅拌10min。
②在搅拌下，慢慢加3.6g Na2SO4使终浓度达到18%。
③加完Na2SO4后继续搅拌20-30 min以充分沉淀蛋白质。
④3500r/min离心20min，弃去上清液（主要含清蛋白），沉淀中含有各种球蛋白。
2.IgG的分离①用8ml磷酸盐缓冲液溶解上述沉淀中的各种球蛋白，并转移到50ml烧杯中搅拌20 min.②3500r/min离心10-20min，取上清液（除杂质）。
③上述上清液中缓慢加入0.96g Na2SO4，使最终浓度达到12%，搅拌20min。
④3500r/min离心10-20min，弃去上清液。
⑤沉淀溶解于4ml缓冲液，搅拌20 min.⑥3500r/min离心10-20min，取上清液。
⑦上清液中缓慢加入0.48g Na2SO4，使最终浓度达到12%，搅拌20min。
⑧3500r/min离心10-20min，弃去上清液（主要含α-球蛋白和β-球蛋白）。
沉淀主要是IgG。
【思考题】1、盐析产物IgG中含有少量的Na2SO4，如何除去？2、如何测定盐析产物IgG的含量？3、用什么方法检测盐析产物IgG的相对分子质量？磷酸盐缓冲液（Phosphate Buffer, PB）试剂：NaH2PO4•2H2O Na2HPO4•12H2O配制方法：配制时，常先配制0.2mol/L的NaH2PO4和0.2mol/L的Na2HPO4，两者按一定比例混合即成0.2mol/L的磷酸盐缓冲液（PB），根据需要可配制不同浓度的PB和PBS。
血清免疫球蛋白(Immunoglobulin,IgG)的分离制备―盐析法
血清免疫球蛋白（Immunoglobulin，IgG）的分离制备―盐析法（一）原理IgG是免疫球蛋白（Immunoglobulin，简称IgG）的主要成分之一，分子量约为15万~16万，沉降生活费数约为7s。
IgG是动物和人体血浆的重要成分之一。
血浆蛋白质的成分多达70余种，要从血浆中分离出IgG，首先要进行尽可能除去其他蛋白质成分的粗分离程序，使IgG在样品中比例大为增高，然后再纯化而获得IgG。
盐析法是粗分离蛋白质的重要方法之一。
许多蛋白质在纯水或低盐溶液中溶解度较低，若稍加一些无机盐则溶解度增加，这种现象称为“盐溶”（Salting in）。
而当盐浓度继续增加到某一浓度时，蛋白质又变得不深而自动析出，这种现象称为“盐析‘（Salting out）。
这些现象的原理大致是由于蛋白质是亲水胶体，带有羧基解离的负电荷或氨基解离的正电荷，其极性基团使分子间相互排斥，同时与水分子形成水膜，这些因素保证蛋白质形成溶于水的溶胶状态。
当加入少量盐时，增多了蛋白质分子上的极性基团，因而增大了蛋白质在水中溶解度，出现“盐溶”现象。
钽当盐浓度增加到一定浓度时，一方面大量的水同盐分子结合，使得蛋白质没有足够的水维持溶解状态，破坏了维持蛋白质亲水胶的水膜，容易沉淀出来；另一方面加入的盐离子中和了蛋白质分子相互磁撞时即发生相互聚集沉淀出来，这样就出现了“盐析”现象。
由于各种蛋白质“盐析”出来所需的盐浓度也各异，盐析所需的最小盐量称做盐析浓度。
盐析法就是通过控制盐的浓度，使蛋白质混合溶液中的各个成分分步“盐析”出来，达到分离目的蛋白质。
盐析法是1878年Hammarster首次使用的，他用硫酸镁成功地将血清蛋白分成为清蛋白、球蛋白两部分。
自那以后曾使用过硫酸钠、氯化钠、磷酸钠和硫酸铵等中性盐来盐析蛋白质，其中运用最广的是硫酸铵。
因为硫酸铵有许多其他盐所不具备的优点，如在水中化学性质稳定；溶解度大，25℃时能达到4.1mol/L的浓度；溶解度的温度系数变化较小，在0~30℃范围内溶解度变化不大，如25℃时饱和溶解度为4.12mol /L，即767g/L，0℃时饱和溶解度为3.9mol/L，即676g/L。
盐析法提取卵黄免疫球蛋白的研究
基 金项 目 ： 宁省 博 士 科 研 启 动 基 金项 目（０ ４１８ ）丹 东 市 科 技 计 划 项 目（ ６ １ ） 辽 ２０ —０ ７ ， ０１２． 作 者简 介 ：冷春 玲 （９ ５） 女 ， 宁丹 东 人 ， １６ 一 ， 辽 副教 授 ， 学学 士 ， 要 从 事 生 物 技 术 研 究 ． ｍａ ：ｈ ｎｉｇｅｇ １ ３ ｃｍ 理 主 Ｅ ｉ ｃｕ ｌ ｌ ＠ ６ ．ｏ ｌ ｎ ｎ
法通 常是 在制 备 ＷＳ Ｆ后 ， 适 当的 无 机 盐 反 复 进 用
行提 取 ， 得较 高 回收率 和纯度 的 ＩＹ， 获 ｇ 再经 各种 色 谱纯 化 ， 可 获得 电泳 级 ＩＹ［ 。运 用 盐 析 法 分 离 便 ｇ ３ ］ 纯化 特异性 ＩＹ 的过程 中 ， 浓度 对特 异 性 ＩＹ 的 ｇ 盐 ｇ
Ｉ Ｙ 亦 称卵 黄抗 体 ， 母 鸡 在 卵 的 发 育过 程 中 ， ｇ） 是 由 血 清 中的 ＩＧ 有 效 转 移 至 卵黄 而成 。与 哺 乳 动 ｇ ］ 物 的 Ｉ Ｇ相 比，ｇ ｇ ＩＹ具 有价 廉 易 得 、 稳定 性 较 好 、 可 Ｖ服等优 点 ， 疾病 的 免疫 检测 和 防治 方 面具 有 良 Ｉ 在
的纯度 ， Ｒ Ｄ 测定 ＩＹ含 量 ， 用 Ｉ ｇ 间接 Ｅ Ｉ Ａ 法检 测 特 异性 卵黄 抗 体 的活 性 。结 果表 明 ： ＬＳ 用饱 和 度 ５ 的硫 酸铵 盐析 一次 ， ０ 再用 １ ０ｇ Ｌ的硫 酸钠溶 液 盐析 ， 以获得 ４ 的 回收率 和 ７ 的纯度 。 ４ ／ 可 ６， ９ ６ ７ 盐析液 经超 滤膜 包超 滤后 制得 的冷 冻干燥 制品 ， 保持 了完整 的抗 体 结构 和 良好 的抗 体 活性 。这 一 结果为 ＩＹ 的进一 步分 离纯化 奠定 了基础 。 ｇ
免疫球蛋白的提取方法
免疫球蛋白的提取方法根据猪血中含有的各种蛋白质的分子大小、电荷多少、溶解度以及免疫学特征等, 从血液中提取免疫球蛋白, 常用的有盐析法、有机溶剂沉淀法、有机聚合物沉淀法、变性沉淀法等。
免疫球蛋白的提取盐析法盐析法是分离蛋白质的重要方法之一, 是利用抗体与杂质之间对盐浓度敏感程度的差异性进行的。
选择一定浓度范围的盐溶液使部分杂质呈“盐析”状态, 抗体成分呈“盐溶” 溶解状态。
离心去除盐析沉淀状态的杂蛋白, 得到的上清液再选择一定浓度范围的盐溶液使抗体成分呈盐析状态, 离心得到的沉淀物即为纯化的目标抗体。
目前常用的盐析法有饱和硫酸铵分步盐析法、辛酸沉淀法、氯化铁沉淀法、多聚磷酸盐盐析法等。
饱和硫酸铵分步盐析硫酸铵是盐析法最常用的无机盐, 主要原因是它溶解度大, 随温度变化小, 对蛋白质有保护作用, 高浓度时可抑制微生物和蛋白酶的活性, 价格也不贵。
免疫球蛋白的饱和硫酸铵分步盐析法操作简单, 对设备和操作条件要求不高, 便于工业化生产。
其具体步骤为: 取一定量血浆, 加生理盐水稀释, 边搅拌边缓慢加入饱和硫酸铵溶液至硫酸铵终浓度20%4C静置1h,4000r/min 离心10min,弃沉淀，上清液中继续加入饱和硫酸铵溶液至硫酸铵终浓度50%,浓氨水调pH值至7.0,4 C静置2h,4000r/min离心20m弃上清，将沉淀溶于生理盐水，超滤除盐浓缩, 滤液中无S2- 4为止,即得IgG粗提物。
免疫球蛋白的辛酸沉淀法辛酸沉淀法提取IgG 时, 对设备和操作条件要求较高, 在离心时, 转速为10000 r/min, 普通离心机达不到要求。
在调节溶液pH值时，要控制得当，pH值稍低或稍高对IgG的得率和纯度都有很大影响, 这些都限制了它的广泛应用。
其具体步骤为: 取一定量O.lmol调pH值至4.5;室温下边搅拌边缓慢加入辛酸（按辛酸25卩l/mL血清混合液添加）,继续搅拌30min后,10000r/min离心30min, 弃沉淀, 留上清液, 上清液用多层纱布过滤, 留滤液, 然后将滤液装入透析袋中析48h,每8~10h换一次透析液，最后超滤浓缩即得1gG粗提液。
免疫球蛋白IgG的提取-3
免疫球蛋白IgG的提取-3五、蛋白质的盐析法向蛋白质溶液中加入不同浓度的中性盐，可以把不同的蛋白质分别沉淀出来。
这种方法称为蛋白质的盐析。
利用蛋白质的盐析法，可以得到我们所需的不同的免疫球蛋白。
最常用的中性盐包括，硅酸铵、硫酸镁、硫酸钠等，其中以硫酸铵最为常用：（一）、优点1、在水中溶解度大，其饱和溶液含有大量盐；2、在水中的溶解度受温度的影响很小；3、一般不会引起蛋白变性。
（二）、缺点提取的纯度较差，所以只能用它作为粗提。
饱和硫酸铵溶液配法：取760g～800g硫酸铵，放人70～80℃蒸馏水1000mL中，搅拌约20min，室温静置过液，硫酸铵结晶析出，即上清为饱和硫酸铵，再用NH40H调pH为7.0。
六、实验内容（一）稀释血清向血清中加入生理盐水，做1�U1稀释，主要目的，以防蛋白质溶液浓度过稠，引起其它蛋白质共沉，或局部蛋白质变性。
（二）用50%饱和度硫酸铵提取免疫球蛋白将用生理盐水按l�U1稀释的动物血清置于三角烧瓶或烧杯中，在电磁搅拌器不断搅拌下，逐滴加入与稀释的蛋白液等量的饱和硫酸铵（血清1体积+生理水1体积+饱和硫酸铵2体积），搅拌的目的是为了防止局部硫酸铵浓度过高。
搅拌后，室温放置0.5～1h，或置4℃冰箱过夜，次日取出，以每分钟4000转离心30min（离心管周围加冰块或冰水），离心后弃上清（内含白蛋白等），沉淀物中即含γ和β球蛋白。
硫酸铵溶液的饱和度是指在整个溶液中所占的百分比，与原蛋白液的浓度无关。
分子量大的蛋白质先沉淀，分子量小的蛋白质后沉淀，球蛋白的分子量20～30万，而白蛋白的分子量只有69000，所以50%饱和度硫酸铵沉淀的是球蛋白，而白蛋白则留在上清液中。
（三）用33%饱和度硫酸铵提取血清中的γ球蛋白当血清中饱和硫酸铵为50%饱和度时，沉淀三次，仍含有大量的α、β球蛋白及极少量的白蛋白，当硫酸铵饱和度由50%减少到33～35%时，沉淀蛋白质中的α、β球蛋白和白蛋白的含量相应逐渐减少，而γ球蛋白的纯度逐渐提高，第三次沉淀物只含有少量的α、β球蛋白及白蛋白。
血浆IgG的分离_纯化及鉴定实验报告
血浆IgG的分离，纯化及鉴定实验报告一、实验目的掌握盐析法的原理及盐析法分离制备血浆IgG的基本过程。
二、实验原理1.血浆IgG是免疫球蛋白（简称Ig）的主要成分之一，相对分子质量为15~16万。
要从身姿中分离出血浆IgG，首先要尽可能除去其他蛋白质成分的粗分离程序，使血浆IgG在样品中比例大为增高，然后再纯化而获得血浆IgG。
2.盐析法是粗分离蛋白质的重要方法，许多蛋白质在纯水或低盐溶液中溶液度低，若稍加一些无机盐则溶解度增加，这种现象为盐溶。
而当盐浓度继续继续增加到某一浓度时，蛋白质又变得不溶而自动析出，这种现象称为盐析。
这现象的原理大致是由于蛋白质带有羟基解离的负电荷或氨基解离的正电荷，其极性基团使分子间相互排斥，同时与水分子形成水膜，这些因素保证了蛋白质不溶于水，当加入少量盐后，破坏水膜结构，增多了蛋白质的极性基团，蛋白质的溶解度增大，出现盐溶的现象，另一方面加入的盐离子中和蛋白质表面电荷，蛋白质分子相互蛋白质混合溶液中的各个成分分步盐析出来，达到分离目的蛋白质。
3.用硫酸铵分级盐析蛋白质时，盐析出某种蛋白质成分所需的硫酸铵浓度一般饱和度来表示。
实际工作中将饱和硫酸铵溶液的饱和度为100%或1。
盐析某种蛋白质成分所需的硫酸铵数量折算成100%或1的百分之几。
即称为该蛋白质盐析的饱和度。
4.饱和度可以用饱和硫酸铵溶液法计算：在蛋白质要求达到50%以下时采用：V＝V0*（C2－C1）/（1－C2）V0－－蛋白质溶液的原始体积C1－－所要达到硫酸铵饱和度C2－－原来溶液的硫酸铵饱和度三、试剂与仪器饱和硫酸铵溶液，0.01mol/l,PH7.0的磷酸盐缓冲溶液，0.0175mol/L,PH6.7的磷酸盐缓冲溶液四、实验步骤1.取1支离心管，向其中加入5ml血浆和5ml0.01mol/l,PH7.0的磷酸盐缓冲溶液，混合。
向其中加入2.5ml饱和硫酸铵溶液，使其饱和度为20%（加入过滴加边搅拌），加完后，应在4度放置15min，使之充分盐析，然后以3000r/min离心10min，弃去沉淀（沉淀为纤维蛋白）2.量取10ml清液体积，置于另一离心管，用滴管加入6ml饱和硫酸铵溶液，使其饱和度达到50%，加完后，4度放置15min，以3000r/min离心10min，弃去溶液，留下沉淀。
免疫球蛋白的制备方法及在畜禽生产中的应用
（一）在家禽和水产中的应用
口服Ig可使禽类对相应病原体引起的胃肠道感染性炎 症有被动免疫保护作用。徐奇友等(2003)将Ig用于预 防和治疗禽类的胃肠道感染性炎症和腹泻取得满意结 果。 Ig用于禽类疫病防治方面的研究报道较多，且已 有产品应用于生产中，如用于紧急预防和治疗传染性 法氏囊病(IBD)、新城疫(ND)等疫病的Ig，效果很好 (那红等，1997)。在水产动物方面，Otake等(1991) 报道通过给日本鳗鱼口服特异性Ig，可降低死亡率， 清除肠道病原菌，从而减少对肝和肾的侵害。郭本恒 等(1993)报道，给感染前或感染后的鳕鱼口服Ig，可 显著降低死亡率和肠道感染率。虹鳟鱼若在感染前4h 腹腔内注射Ig，则可获得相同的被动免疫作用。
节过程中起着重要作用，是动物体 内的免疫系统最为关键的物质之一。 大量的研究表明，Ig对许多病原微 生物和毒素有抑制作用。其生物学 功能主要表现为与相应抗原特异性 结合、激活补体、结合细胞产生多 种生物学表达、通过胎盘传递免疫 力等。
免疫球蛋白的性质
免疫球蛋白具有所有蛋白质的通性，它的活性受 到热、酸、碱等的影响。因此，在分离制备时， 应保障其在分离制备条件下的稳定性。其粗品的 免疫活力在低于57℃时，几乎没有变化，但从 57℃开始降低，将近80~C时基本失活；过酸或过 碱都会造成免疫球蛋白变性失活。杨严峻等(1996) 研究发现，免疫球蛋白的耐热性与其纯度有关， 纯度越高，其耐热性就越差。因此在分离制备Ig 时不仅要考虑温度对Ig活力的影响，纯度也是要 重点考虑的因素，而且对纯度的要求也越来越高。
实验一兔血清 免疫球蛋白分离与纯化
20ml，使成50%（NH4）2SO4溶液，边加边搅拌，充分混合后，
（3）用6ml磷酸盐缓冲液溶解沉淀，再加（NH4）2SO4饱和溶液
3ml，使成33%（NH4）2SO4溶液，充分混合，静置10min。 （4）3000r/min离心10min，弃上清。 （5）为进一步纯化，可重复步骤3 2~3次。
3 透析去盐
蛋白质工程实验课
综合实验一 兔血清免疫球蛋白 分离与纯化
主讲教师：申慧芳
岳续朋
生物工程教研室
实验课要求
预习 不迟到、早退、不旷课、有事请假 穿白大褂、注意自我防护 不能喧哗，不做与实验无关的事 认真完成实验报告 值日要求：擦桌子、拖地、擦黑板、倒 垃圾、关灯和门窗
实验一 兔血清免疫球蛋白分离
蒸水煮沸10min）、饭盒（装碎冰）等。
4. 仪器：搅拌器、离心机等。
5. 溶液配制
三、实验试剂
饱和硫酸铵溶液的配制： 称（NH4）2SO4400～425克，以70～80℃之 蒸馏水500ml溶解，搅拌20分钟，趁热过滤。 冷却后以浓氨水（28%氨溶液）调PH至7.4。 配制好的饱和硫酸铵，瓶底应有结晶析出。
柰氏试剂
HgI 11.5g，KI 8.0g，加双蒸水至50ml； 搅拌溶解后过滤，滤液中再加入浓度为 20%的溶液NaOH 50ml。
四、实验步骤
1 兔免疫血清的制备
2 硫酸铵分级沉淀
（1）取制备好的血清20ml，逐滴加入（NH4）2SO4饱和溶液 静置10min。 （2）3000r/min离心10min，弃去上清。
二、实验原理一 盐析
当用中性盐加入蛋白质溶液，中性盐对水分子的亲和
力大于蛋白质，于是蛋白质分子周围的水化膜减弱甚
牛血清免疫球蛋白的盐析法提取与纯化
牛血清免疫球蛋白的盐析法提取与纯化
牛血清免疫球蛋白的盐析法提取与纯化是一个复杂的过程，包括多个步骤。
以下是一个基本的流程：1. 盐析：首先，需要将牛血清中的免疫球蛋白通过盐析的方法进行提取。
这一步通常使用饱和硫酸铵溶液，通过调节溶液的pH值和离子强度，使得免疫球蛋白在盐析过程中沉淀下来。
2. 洗涤：将沉淀的免疫球蛋白进行洗涤，去除其中的盐分和其他杂质。
3. 溶解：将洗涤后的免疫球蛋白溶解在适当的缓冲液中，以保持其生物活性。
4. 纯化：通过凝胶过滤、离子交换等层析技术对免疫球蛋白进行纯化，去除其中的杂质和不同种类的免疫球蛋白。
5. 浓缩和干燥：将纯化的免疫球蛋白溶液进行浓缩，然后进行干燥处理，得到最终的产品。
需要注意的是，具体的提取和纯化步骤可能会因为实验条件、设备、原材料等因素而有所不同。
同时，为了保证免疫球蛋白的生物活性，需要在整个过程中保持适当的pH值、温度和离子强度等条件。
提纯伽马球蛋白实验报告
一、实验目的1. 了解伽马球蛋白的生物学特性及其在临床医学中的应用。
2. 掌握伽马球蛋白的提纯方法，提高对生物分离纯化技术的认识。
3. 培养实验操作技能，提高实验数据的分析和处理能力。
二、实验原理伽马球蛋白（γ-Globulin）是一种免疫球蛋白，主要由B淋巴细胞分泌，具有增强机体免疫功能的作用。
本实验采用盐析法对血清中的伽马球蛋白进行提纯，其原理如下：1. 盐析法：在溶液中加入一定浓度的盐，使蛋白质发生盐析，从而实现蛋白质的分离纯化。
2. 蛋白质变性：在实验过程中，蛋白质可能发生变性，影响实验结果。
因此，在实验过程中需注意控制温度、pH等条件，以保持蛋白质的稳定性。
三、实验材料1. 实验动物：健康小鼠2. 试剂：生理盐水、硫酸铵、NaCl、Tris-HCl缓冲液、考马斯亮蓝G-250染色剂、考马斯亮蓝R-250染色剂、丙酮、甲醇、磷酸盐缓冲盐溶液（PBS）3. 仪器：离心机、恒温水浴锅、移液器、试管、烧杯、玻璃棒、滤纸等四、实验方法1. 收集小鼠血清：将小鼠麻醉后，无菌操作采集血清，置于4℃冰箱保存。
2. 稀释血清：取适量血清，用Tris-HCl缓冲液稀释至适当浓度。
3. 盐析：向稀释后的血清中加入硫酸铵，使硫酸铵浓度达到40%，充分搅拌后，静置30分钟。
4. 离心：将混合液以3000r/min离心10分钟，收集上清液。
5. 透析：将上清液置于透析袋中，用PBS缓冲液透析，去除硫酸铵。
6. 蛋白质定量：采用考马斯亮蓝法测定透析液中蛋白质含量。
7. 丙酮沉淀：将透析液置于4℃冰箱中，加入丙酮，使蛋白质沉淀，静置过夜。
8. 离心：将沉淀物以3000r/min离心10分钟，收集沉淀。
9. 洗涤：用冷丙酮洗涤沉淀物，重复2次。
10. 干燥：将沉淀物置于干燥箱中，干燥至恒重。
11. 溶解：将干燥后的沉淀物溶解于适量Tris-HCl缓冲液中，得到提纯的伽马球蛋白。
五、实验结果与分析1. 蛋白质含量：经考马斯亮蓝法测定，提纯的伽马球蛋白含量约为2mg/mL。
实验二免疫球蛋白的提取
凝胶过滤法
凝胶过滤主要是利用具有分子筛效应的多孔网状 凝胶作介质，按照各物质分子量的不同、分子形 状和水化作用的不同，在层析柱上进行分离。
一些小分子物质可以进入凝胶粒子内部，洗脱时 速度较慢，大分子物质被阻于凝胶粒子外，洗脱 较快。
常用的凝胶有交联葡聚糖凝胶、交联聚丙酰胺和 琼脂糖凝胶等。
离子交换层析法
离子交换层析是利用蛋白质带电部分与具有相反 电荷的离子交换剂的吸附和解吸附原理进行的。
常用的离子交换剂有DEAE纤维素（ 球蛋白）和 QAE-交联葡聚糖A-50（IgG），二者都是碱性阴 离子交换剂，当溶液PH高于蛋白质等电点时，其 阳离子基团可与蛋白质的阴离子基团交换吸附。 当溶液PH接近蛋白质等电点时，蛋白质静电荷变 为零，不能吸附，被洗脱下柱。
盐析法
在蛋白质胶体溶液中加入中性盐可以使蛋白质分 子从溶液中析出，这一过程称为盐析。中性盐离 子大量进入蛋白质胶体溶液时，影响水分子与蛋 白质分子极化部分的相互作用而减少其亲水性， 并中和其电荷，最后使蛋白质分子聚集沉淀。
各种蛋白质聚集沉淀所需要的中性盐浓度不同， 控制盐的浓度，能将血清中免疫球蛋白分离出来。
4000rpm离心15-30min，取沉淀用10 ml生理盐水 溶解，搅拌下逐滴加入5 ml饱和硫酸铵，室温 10min或更长（4℃静置3h或过夜，充分沉淀）。离 心，取沉淀。重复沉淀三次可提高分离物纯度。
方法步骤
（2）脱盐：用透析法（或用凝胶过滤法）
用少量生理盐水将沉淀溶解，用毛细滴管将其移 入透析袋中，两端扎紧，将透析袋浸没于大烧杯 中，先对蒸馏水透析12小时，换液两次，再对生 理盐水透析，换液三次以上，直至透析液中无
硫酸铵盐析法提纯血清 中的免疫球蛋白
免疫球蛋白的提取方法
免疫球蛋白的提取方法根据猪血中含有的各种蛋白质的分子大小、电荷多少、溶解度以及免疫学特征等,从血液中提取免疫球蛋白,常用的有盐析法、有机溶剂沉淀法、有机聚合物沉淀法、变性沉淀法等。
免疫球蛋白的提取盐析法盐析法是分离蛋白质的重要方法之一,是利用抗体与杂质之间对盐浓度敏感程度的差异性进行的。
选择一定浓度范围的盐溶液使部分杂质呈“盐析”状态,抗体成分呈“盐溶”溶解状态。
离心去除盐析沉淀状态的杂蛋白,得到的上清液再选择一定浓度范围的盐溶液使抗体成分呈盐析状态,离心得到的沉淀物即为纯化的目标抗体。
目前常用的盐析法有饱和硫酸铵分步盐析法、辛酸沉淀法、氯化铁沉淀法、多聚磷酸盐盐析法等。
饱和硫酸铵分步盐析硫酸铵是盐析法最常用的无机盐,主要原因是它溶解度大,随温度变化小,对蛋白质有保护作用,高浓度时可抑制微生物和蛋白酶的活性,价格也不贵。
免疫球蛋白的饱和硫酸铵分步盐析法操作简单,对设备和操作条件要求不高,便于工业化生产。
其具体步骤为:取一定量血浆,加生理盐水稀释,边搅拌边缓慢加入饱和硫酸铵溶液至硫酸铵终浓度20%,4℃静置1h,4000r/min离心10min,弃沉淀,上清液中继续加入饱和硫酸铵溶液至硫酸铵终浓度50%,浓氨水调pH值至7.0,4℃静置2h,4000r/min离心20m弃上清,将沉淀溶于生理盐水,超滤除盐浓缩,滤液中无S2- 4为止,即得IgG粗提物。
免疫球蛋白的辛酸沉淀法辛酸沉淀法提取IgG时,对设备和操作条件要求较高,在离心时,转速为10000 r/min,普通离心机达不到要求。
在调节溶液pH值时,要控制得当,pH值稍低或稍高对IgG的得率和纯度都有很大影响,这些都限制了它的广泛应用。
其具体步骤为:取一定量0.1mol调pH值至4.5;室温下边搅拌边缓慢加入辛酸(按辛酸25 μl/mL血清混合液添加),继续搅拌30min 后,10000r/min离心30min,弃沉淀,留上清液,上清液用多层纱布过滤,留滤液,然后将滤液装入透析袋中析48h,每8～10h换一次透析液,最后超滤浓缩即得1gG粗提液。
检验技师考点：IgG纯化
检验技师考点：IgG纯化检验技师考点：IgG纯化盐析法只能部分纯化抗体，更高纯度的抗体制剂可用层析法制备。
IgM五聚体相对分子质量达9.7×10，比血清中任何其他蛋白都大，用分子筛层析很容易将其纯化。
IgG在PH 8.0时带负电荷，能与DEAE 纤维素上的阳离子结合，因此可用离子交换层析来纯化IgG.IgG纯化最常用的方法为亲和层析。
IgG与葡萄球菌A蛋白和链球菌G蛋白具合高度的亲和性，可用这两种蛋白质交联亲和层析柱将IgG纯化。
大部分IgG与蛋白A结合PH为8—9，洗脱PH为2—4;而与蛋白G的'结合PH为5—7，洗脱PH为9—10.C蛋白更适合于IgG的纯化，不但反应条件为温和的弱酸性或弱碱性，并且与IgG的结合力高于A蛋白。
G蛋自能与大部分动物种类的IgG结合，而A蛋白对小鼠IgG1、大鼠IgG2b、人IgG3、马和绵羊IgG结合力弱或不能结合G蛋白和A 蛋白均不能与鸡IgG结合。
生理作用：IgG的功能作用主要在机体免疫中起保护作用，大多数抗菌、抗病毒;应对麻疹、甲型肝炎等，能有效地预防相应的感染性疾病。
IgG是唯一可以通过胎盘的免疫球蛋白。
来自母体的IgG在出生后数月对防御白喉、麻疹、脊髓灰质炎等感染起着重要作用，母体传递给胎儿的IgG于生后6个月几乎全部消失，而婴儿自身产生IgG从3个月时才逐渐增多，故6个月后易患感染。
3-5岁是渐接近成人水平。
生理性变化：胎儿出生前可从母体获得IgG，在孕前期22~28周间，胎儿血IgG浓度与母体血IgG浓度相等，出生后母体IgG逐渐减少，到第3、4月胎儿血IgG降至最低，随后胎儿逐渐开始合成IgG，血清IgG逐渐增加，到16岁前达到成人水平。
【检验技师考点：IgG纯化】。
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重复上述第二步过程1?次。将末次离心后所得沉淀物以0.02M
PH7.4 PBS溶解至Xml装入透析袋。
│对PBS充分透析、除盐换液3次，
↓至萘氏试剂测透析外液为无黄色
1. 蛋白质的浓度：盐析时，溶液中蛋白质的浓度对沉淀有双重影响，既可影响蛋白质沉淀极限，又可影响蛋白质的共沉作用。蛋白质浓度愈高，所需盐的饱和度极限愈低，但杂蛋白的共沉作用也随之增加，从而影响蛋白质的纯化。故常将血清以生理盐水作对倍稀释后再盐析。
2. 离子强度:各种蛋白质的沉淀要求不同的离子强度。例如当硫酸铵饱和度不同，析出的成分就不同，饱和度为50％时，少量白蛋白及大多数拟球蛋白析出；饱和度为33％时γ球蛋白析出。
(二) 主要材料
1. 试剂:
(1) 正常人混合血清；灭菌生理盐水。
(2) 饱和硫酸铵溶液的配制:
称(NH4)2SO4(AR)400～425克，以50～80℃之蒸馏水500ml溶解，搅拌20分钟，趁热过滤。冷却后以浓氨水(15N NH4OH)调PH至7.4。配制好的饱和硫酸铵，瓶底应有结晶析出。
B液: 0.2M NaH2P4：NaH2P4·2H２O 3.12克，加蒸馏水至1000ml；
应用液：取A液81ml加B液19ml混合，再以生理盐水作10倍稀释即成。
(5) 0.1M, PH7.4磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffer PB)配制:
将上述A液取81ml与B液19ml混合，再以蒸馏水对倍稀释即成。
将透析袋内样品取少许作适当倍数稀释后，以751-G紫外分光光计测蛋白含量。
方法如下:
蛋白含量(mg／ml)＝(1.45×OD280nm-0.74×OD260nm)×样品稀释度。
注：式中1.45与0.74为常数，nm为波长。
(四) 影响盐析的因素
(6) 20％磺基水杨酸。
2. 器材:
普通冰箱、离心机、电磁搅拌器，751桮型紫外分光光度计、扭力天平，粗天平。
透析袋、尼龙绳、细竹棒、精密PH试纸(PH5.5～9.0)、眼科镊子、小剪刀。
烧杯、量筒、吸管、滴管、灭菌小瓶、试管等。
(三) 盐析的操作步骤
3. 盐的性质：最有效的盐是多电荷阴离子。
4. PH值：一般说来，蛋白质所带净电荷越多，它的溶解度越大。改变PH改变蛋白质的带电性质，也就改变了蛋白质的溶解度。
5. 温度：盐析时温度要求并不严格，一般可在室温下操作。血清蛋白于25℃时较0℃更易析出。但对温度敏感的蛋白质，则应于低温下盐析。
(3) 萘氏试剂配制：
称HgI11.5克，KI8克，加蒸馏水至50ml，搅拌溶解后，再加入20％NaOH 50ml。
(4) 0.02M, PH7.4磷酸盐缓冲盐液(Phosphate Buffered Saline PBS)配制:
贮存液:
A液：0.2M Na2HPO4：Na2HPO4·12H2O 71.64克，加蒸馏水至1000ml；
6. 蛋白质沉淀后宜在4℃放3小时以上或过夜，以形成较大沉淀而易于分离。
取正常人混合血清加等量生理盐水，于搅拌下逐滴加入与
稀释血清等量的饱和硫酸铵[终浓度为50％饱和(NH4)2SO4]
↓4℃，3小时以上，使其充分沉淀
离心(3000rpm), 20分钟，弃上清，以生理盐水溶解沉淀至Xml。
再逐滴加饱和硫酸铵Ｘ/２ml
原理
主要材料
盐析的操作步骤
影响盐析的因素
(一) 原理
蛋白质在水溶液中的溶解度是由蛋白质周围亲水基团与水形成水化膜的程度，以及蛋白质分子带有电荷的情况决定的。当用中性盐加入蛋白质溶液，中性盐对水分子的亲和力大于蛋白质，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失。同时，中性盐加入蛋白质溶液后，由于离子强度发生改变，蛋白质表面电荷大量被中和，更加导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。