H3亚型猪流感病毒分离与鉴定

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流感病毒实验室检测流程

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流感病毒实验室检测流程
流感病毒实验室检测流程简述如下：
→样本采集：采集患者咽拭子、鼻咽拭子或呼吸道分泌物
→标本处理：使用病毒保存液，保持样本活性，低温运送
→实验室接收：记录信息，安全条件下接收样本
→核酸提取：从样本中提取RNA
→RT-PCR检测：逆转录聚合酶链反应，检测流感病毒核酸
→结果分析：观察PCR产物，判断阴阳性
→病毒分离培养：必要时，于生物安全柜中进行鸡胚或细胞培养→病毒鉴定：通过HA试验、基因测序等确定病毒类型和亚型→出具报告：记录检测结果，及时报告给临床医生
→生物安全：全程严格遵守生物安全操作规程。

1。

H1-SIV、H3-SIV、NA-PRRSV_和EU-PRRSV_多重PCR_检测方法的建立及应用

·研究论文·Chinese Journal of Animal Infectious Diseases中国动物传染病学报摘要：猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV ）感染肺泡巨噬细胞，严重损害免疫系统，导致与其他病毒共感染现象，其中猪流感病毒（SIV ）也是病原之一。

为了快速检测和区分PRRSV 基因型与SIV 亚型，本研究针对H1、H3亚型SIV 的HA 基因和美洲型、欧洲型PRRSV 的N 、M 基因的保守序列，分别设计了4对特异性扩增引物，在引物浓度、退火温度等反应条件的系统优化下，分别对其特异性和敏感性进行验证，建立了能够快速检测以上4种病原的多重PCR 方法，并对155份临床样品进行了检测。

结果显示，该检测方法特异性好、灵敏度高，对H1-SIV 、H3-SIV 、NA-PRRSV 和EU-PRRSV 的最低检出量均低至9.86×100 copies/μL 。

以单一PCR 方法对所有临床样品进行检测后发现，检测结果与多重PCR 检测结果一致，证明这种多重PCR 方法可以用于这4种病毒的快速检测与分型鉴定。

关键词：猪流感病毒；猪繁殖与呼吸综合征病毒；多重PCR 中图分类号：S858.28文献标志码：A文章编号：1674-6422（2024）01-0135-07Development and Application of a Multiple PCR Detection Method for H1-SIV ,H3-SIV , NA-PRRSV , EU-PRRSVXU Yi §, YU Liangzheng §, LIN Shuang §, REN Tongwei, WANG Hao, ZENG Hao, GUO Jianing, GUO Jinfan, HUANG Chongqiang, OUYANG Kang, HUANG Weijian, WEI Zuzhang, CHEN Ying(Laboratory of Animal Infectious Diseases and Molecular Immunology, College of Animal Science and Technology, Guangxi University,Nanning 530004, China)收稿日期：2021-11-05基金项目：广西创新驱动发展专项资金项目（桂科AA17204057-1）作者简介：徐毅，硕士，主要从事动物流感病毒分子生物学研究；余良政，硕士研究生，主要从事动物流感病毒分子生物学研究；林霜，本科，主要从事动物流感病毒分子生物学研究；共为第一作者通信作者：陈樱，E-mali：****************.cn H1-SIV 、H3-SIV 、NA-PRRSV 和EU-PRRSV 多重PCR 检测方法的建立及应用徐毅§，余良政§，林霜§，任同伟，王豪，曾昊，郭嘉宁，郭金凡，黄崇强，欧阳康，黄伟坚，韦祖樟，陈樱（广西大学动物传染病与分子免疫学实验室广西大学动物科学技术学院，南宁 530004）2024,32(1):135-141Abstract: Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) infects alveolar macrophages, seriously damaging the immune system, leading to co-infection with other viruses, among which swine influenza virus (SIV) is also one of the pathogens. In order to rapidly detect and distinguish PRRSV genotypes and SIV subtypes, four pairs of specific primers were designed according to the conserved sequences of HA genes of H1 and H3 subtype SIV and N and M genes of the American and European PRRSVs. The primers were optimized for their concentrations and annealing temperatures and the speciﬁ city and sensitivity of this multiplex PCR method were also demonstrated for rapidly detecting these four pathogens. The detection limit of H1-SIV , H3-SIV , NA-PRRSV and EU-PRRSV was as low as 9.86×100 copies/μL. A total of 155 clinical samples were then tested using this multiplex PCR method and single PCR methods. The results were consistent among these PCR methods, indicating that this multiplex PCR method could be used for rapid detection and type identiﬁ cation of these four viruses.Key words: Swine inﬂuenza virus; Porcine reproductive and respiratory syndrome virus; multiplex PCR· 136 ·中国动物传染病学报2024年2月规模化养殖模式下，猪群间导致多种呼吸道疾病的病毒传播能力显著增强，混合感染的现象频频发生，猪流感病毒（Swine influenza virus, SIV）和猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV）混合感染的现象在全国范围内都非常普遍，对多地区猪群的调查显示SIV和PRRSV之间以及不同亚型SIV和不同基因型PRRSV之间的混合感染情况日渐严峻。

H3亚型猪流感病毒抗原捕捉ELISA检测方法的建立

纯化，建立了以多抗作为包被抗体，ＭＡｂ作为检测抗体的Ｈ３亚型ＳＩＶ抗原捕捉ＥＬＩＳＡ（ＡＣ．ＥＬＩＳＡ）方法。并对
该方法的特异性和敏感性进行了分析，其敏感性是血凝试验的４倍，与猪繁殖与综合征病毒、猪圆环病毒、猪瘟
病毒、猪细小病毒以及ＨＩ、Ｈ５、Ｈ９亚型ＳＩＶ均没有明显的交叉性反应，批间和批内重复试验变异系数均小于１０％。应用建立的ＡＣ．ＥＬＩＳＡ方法对８４份Ｈ３亚型ＳＩＶ实验室感染样品进行检测与鸡胚滴定病毒结果符合率达
第３５卷第７期
２０１３年７月
中国预
防兽
医学报
Ｖｏ１．３５．Ｎｏ．７
Ｊｕ１．２０１３
ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｒｅｖｅｎｔｉｖｅＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＭｅｄｉｃｉｎｅ
Ｈ３ＳＩＶａｓｄｅｔｅｃｔｏｒａｎｔｉｂｏｄｙ，ａｎｄｔｈｅｐｏｌｙｃｌｏｎａｌｎｔａｉｂｏｄｙａｓｃａｐｔｕｒｅａｎｔｉｂ பைடு நூலகம் ｄｙ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅＡＣ．ＥＬＩＳＡｗａｓ４ｔｉｍｅｓ
Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＴｏｄｅｖｅｌｏｐｅｄｔｈｅｒａｐｉｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｆｏｒＨ３ｓｕｂｔｙｐｅｓｗｉｎｅｉｎｌｆｕｅｎｚａｖｉｅｓ（ｒｓｉｖ），ａｌｌａｎｉｔｇｅｎ．ｃａｐｔｕｒｅｅｎｚｙｍｅ。ｌｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙ（ＡＣ — ＥＬＩＳＡ）ｗａｓｄｅｖｅｌｏｐｅｄｗｉｈｔｈｅｔｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙ（ＭＡｂ）４Ｅ８ａｇａｉｎｓｔＨＡｐｒｏｔｅｉｎｏｆ

1株H3N2亚型猪流感病毒的分离鉴定

1株H3N2亚型猪流感病毒的分离鉴定齐海涛;闫军霞;粟硕;黄震;曹楠;谭力凯;孔维立;张桂红【摘要】为了解广东猪流感病毒(SIV)的流行变异情况,2010年11月从广东某规模猪场采集流感症状的猪鼻拭子60份,接种10日龄SPF鸡胚,分离到1株猪流感病毒,通过流感分型RT-PCR和HI试验鉴定为H3N2亚型SIV,命名为A/swine/Guangdong/L22/2010(H3N2),进行全基因序列测定及相似性分析发现,该分离株有低致病性流感分子特征,该毒株的8个基因片段连同最近广东猪群流行的流感毒株与2000年前后H3N2人流感病毒有较高的同源性.系统遗传演化显示,该病毒分离株可能是由1999年人源H3N2流感病毒A/Moscow/10/99(H3N2)进化而来.【期刊名称】《中国兽医杂志》【年(卷),期】2012(048)012【总页数】4页(P24-27)【关键词】H3N2;猪流感病毒;分离鉴定【作者】齐海涛;闫军霞;粟硕;黄震;曹楠;谭力凯;孔维立;张桂红【作者单位】华南农业大学兽医学院,广东广州 510642;华南农业大学兽医学院,广东广州 510642;华南农业大学兽医学院,广东广州 510642;华南农业大学兽医学院,广东广州 510642;华南农业大学兽医学院,广东广州 510642;华南农业大学兽医学院,广东广州 510642;华南农业大学兽医学院,广东广州 510642;华南农业大学兽医学院,广东广州 510642【正文语种】中文【中图分类】S855.3猪流感（SI）是由A型流感病毒引起的猪的一种急性、传染性呼吸道疾病，以发热、流鼻液、咳嗽、食欲减退等症状为特征，病猪可在短期内康复，但会降低饲料报酬，延迟上市时间。

目前猪群中的SIV主要有H1N1、H1N2和H3N2 3种亚型。

我国猪群中普遍存在H3和H1亚型感染。

更为重要的是，猪可以被禽流感病毒和人流感病毒同时感染，猪被认为是流感病毒的“混合器”，在“禽－猪－人”的传播链中具有独特的地位［1－2］，SI具有重要的公共卫生意义。

一株H3亚型猪流感病毒的分离鉴定

从福建某猪场采集的３份疑似猪流感病死猪的肺脏，将病料剪猪流感（ＳｗｉｎｅＩｎｌｆｕｅｎｚａ，ＳＩ）是由猪流感病毒引起的一种急碎，加入含青霉素和链霉素的灭菌生理盐水，组织研磨器研磨后性呼吸道传染病。该病的特征为，发病突然且发病率高，其典型冻融３次，经１００００ｒ／ａｒｉｎ离心１０ｍｉｎ取上清液，经滤过除菌后置的临床症状为流鼻涕、咳嗽和呼吸困难，伴有发热、嗜睡以及随于一８０￣Ｃ保存。
很早就有学者对鸡体各种球虫进行形态描述，并以此来区别它本一致。因此，可初步鉴定这株纯种球虫为鸡柔嫩艾美耳球虫。们。球虫卵囊的大小、形态和颜色；在肠道内的病变部位；肉参考文献眼病变的性质；在组织中的寄生部位（被寄生的细胞类型）；在试验感染中的最短潜隐期；孢子化过程的最短时间等在球虫种类鉴定中具有重要意义。其中，卵囊的大小测定包括测量孢子化卵囊的长、宽，孢子囊的长、宽，计算卵形指数（孢子化
发现的ＳＩＶ血清型至少有Ｈ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ２、Ｈ１Ｎ７、Ｈ３Ｎ２、Ｈ３Ｎ６、
Ｈ９Ｎ２等７种】。本实验采用血凝抑制试验和ＲＴ — ＰＣＲ两种方法，对
１．４．３ＲＴ－ＰＣＲ

H1N1和H3N2亚型猪流感病毒的拯救及其致病基因的分析的开题报告

H1N1和H3N2亚型猪流感病毒的拯救及其致病基因的分析的开题报告一、选题背景猪流感是一种由猪流感病毒引起的呼吸道传染病，可以引起猪的高烧、咳嗽、打喷嚏、流鼻涕等症状。

猪流感病毒分为H1N1、H3N2、H1N2等亚型，其中H1N1和H3N2亚型病毒对人类具有较高的感染性和致病性，可能引起公共卫生事件。

近年来，全球多次发生了猪流感病毒感染人类的疫情，引起了广泛关注。

二、研究意义猪流感病毒的病原机制和致病基因一直是研究的热点和难点之一。

对于H1N1和H3N2亚型病毒的拯救和致病基因的分析，具有重要的理论和实践意义。

一方面，研究猪流感病毒的致病机制和途径，可以为疫苗和药物的研发提供依据和指导；另一方面，通过分析病毒的遗传变异和流行规律，可以为预防和控制疫情提供理论基础和科学支撑。

三、研究目的本研究的目的是探究H1N1和H3N2亚型猪流感病毒的拯救和致病基因的分析，进一步了解病毒的遗传变异和传播规律，为预防和控制疫情提供科学依据和支持。

四、研究内容和方法本研究将采用文献综述、实验研究和分子生物学技术等方法，对H1N1和H3N2亚型猪流感病毒的拯救和致病基因进行深入研究和分析。

具体包括以下几个方面：（1）通过文献综述，探究猪流感病毒的遗传特点、感染规律和致病机制等方面的研究进展。

（2）采用分子生物学技术，对H1N1和H3N2亚型猪流感病毒的基因组结构和遗传变异进行深入分析和解读。

（3）利用细胞培养和动物模型等实验方法，研究病毒感染和复制规律，筛选和鉴定病毒的致病基因。

（4）通过大规模的基因测序和生物信息学分析，探究病毒的演化变异和传播规律，为预测和防控疫情提供科学依据。

五、研究总体安排本研究计划用时2年，在第1年主要进行文献综述和实验技术的优化和建立；在第2年主要实验研究和数据分析。

具体研究安排如下：第一年：（1）文献综述和调研。

（2）实验技术建立和优化，包括基因组分离、PCR扩增、蛋白表达、分子克隆和动物模型建立等。

一株H3N2亚型猪流感病毒的分离鉴定

一株H3N2亚型猪流感病毒的分离鉴定方超，张智明，李建华，何世岷（哈药集团生物疫苗有限公司，哈尔滨150069）摘要：为了给猪流感疫苗的研制做准备，试验将从某猪场现地采集疑似猪流感发病猪的鼻拭子样品，经过处理后接种至10~11日龄SPF 鸡胚进行盲传，分离到1株具有血凝性的病毒。

通过血清学、分子生物学鉴定、电镜观察、动物回归试验等方法对该病毒进行鉴定。

结果发现：该病毒可与猪流感病毒H3亚型阳性血清特异性结合；通过分子生物学检测，该分离株出现猪流感病毒H3亚型和N2亚型目的片段；将该分离株液置于电镜下观察可见直径为80~120nm 且具有囊膜和纤突的病毒粒子，符合猪流感病毒粒子形态特征；用纯化后的病毒攻击4~6周龄阴性仔猪，攻毒组仔猪发病率可达80%。

由此可见分离获得的病毒为H3N2亚型猪流感病毒。

关键词：猪流感；H3N2亚型；分离鉴定；病毒纯化中图分类号：S852.4文献标志码：A文章编号：1001-0084（2021）03-0015-05Isolation and Identification of a H3N2Subtype Swine Influenza VirusFANG Chao,ZHANG Zhiming,LI Jianhua,HE Shimin(Harbin Pharmaceutical Group Bio-vaccine Co.,Ltd.,Harbin 150069,China)Abstract:In order to prepare for the development of swine influenza vaccine,nasal swab samples from pigs suspected of having swine influenza were collected at a pig farm.After treatment,10-11-day-old SPF chicken embryos were inoculated for blind transmission,and a strain of hemagglutinating virus was isolated.The virus was identified by serology,molecular biological identification,electron microscope observation and animal regression test.The results showed that:the virus could specifically bind to the H3subtype positive serum.Molecular biological detection demonstrated that H3subtype and N2subtype target fragments appeared in the isolated strains.The virus particles 80-120nm in diameter with capsule membrane and fibrillae were observed from the isolated strains liquid under the electron microscope,which is consistent with the morphological characteristics of swine influenza virus particles.When the purified virus was used to attack the negative piglets aged from four to six weeks,the morbidity of piglets in the challenge group could reach 80%.Thus,the isolated virus was H3N2subtype swine influenza virus.Key words:swine influenza;H3N2subtype;isolation and identification;virus purification 收稿日期：2021-01-15作者简介：方超（1988—），女，山东诸城人，兽医师，硕士，研究方向为预防兽医学，****************。

部分猪场H1和H3亚型猪流感的血清学调查

部分猪场H1和H3亚型猪流感的血清学调查陈锦成;张丹琳;陈敏鸿;张显浩;贺东生【摘要】To survey the epidemics of H1, H3 subtypes of swine influenza virus in some scale pig farms in some provinces, 799 swine serum samples were collected from 28 factory pig farms on 12 cities in Guangdong, Hunan and Henan provinces. The antibodies against H1 and H3 subtypes of SIV were determined by HI assay. The results showed that the positive rate of H1 subtype antibody of pigs was 0 to 83. 33% , the average positive rate of pigs was 46. 18% (369/799) and the positive rate of pig farms was 89. 29% (25/28). The positive rate of H3 subtype antibody of pigs was 0 to 100% > the average positive rate of pigs was 61. 33% (490/799) and the positive rate of pig farms was 85. 71% (24/28). The average positive rate of H1 subtype antibody of pigs of Guangdong, Hunan and Henan provinces respectively was 48. 91% , 40. 26% and 50. 67% , the rate of H3 subtype antibody was 58. 55%, 70. 78% and 78. 67%. It showed that the infection of H1 and H3 subtypes of swine influenza virus was widespread in the surveyed pigs of the 3 above regions. The infection rate of H3 subtype was higher than H1 subtype. The epidemics of swine influenza varied in different region.%为了解中国部分省市规模化猪场H1和H3亚型猪流感病毒的流行情况,采用血凝抑制试验对采集于广东、湖南、河南省12个市县28个规模化猪场的799份血清进行H1和H3亚型猪流感病毒的抗体检测.结果表明,H1亚型抗体阳性率在0～83.33％之间,猪抗体总阳性率为46.18％(369/799),猪场阳性率为89.29％(25/28).H3亚型抗体阳性率在0～100.00％之间,猪抗体总阳性率为61.33％(490/799),猪场阳性率为85.71％(24/28).广东、湖南和河南地区H1亚型抗体阳性率分别为48.91％、40.26％和50.67％,H3亚型抗体阳性率分别为58.55％、70.78％和78.67％.在被调查的上述3个地区的猪群中,H1和H3亚型猪流感病毒的感染较为普遍,其中H3亚型感染率高于H1亚型,且各地区猪流感病毒的流行情况存在地域性差异.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2012(039)009【总页数】4页(P178-181)【关键词】猪流感;血清学调查;H1亚型;H3亚型;血凝抑制试验【作者】陈锦成;张丹琳;陈敏鸿;张显浩;贺东生【作者单位】广东省广州市番禺区大岗镇畜牧兽医站,广东广州 511470;华南农业大学兽医学院,广东广州 510642;华南农业大学兽医学院,广东广州 510642;华南农业大学兽医学院,广东广州 510642;华南农业大学兽医学院,广东广州 510642【正文语种】中文【中图分类】S851.3猪流感是由正黏病毒科猪流感病毒（swine influenza virus，SIV）引起的猪的一种急性、高度接触性呼吸道疾病。

人源H3N2亚型猪流感重组病毒的分离鉴定及全基因序列分析

人源H3N2亚型猪流感重组病毒的分离鉴定及全基因序列分析周伦江;王隆柏;俞玉鸿;魏宏;车勇良;陈如敬;吴学敏;邵良平;庄向生【摘要】A virus was isolated from the pig tissue sample of swine influenza-like case and identified as a H3N2 swine influenza virus (SIV) by HA and HI test, designated A/Swine/Fujian/F2/07(H3N2). The virus titers were 10-4.8 ELD50, and 10-6.17 EID50 in inoculated chicken embryos. The results of sequence analysis indicated that the virus nucleotide sequences shared 84.7% to 98.1%, 94.4% to 99.5%, 88.6% to 97.6% with HA, NS, NA gene of human influenza virus (HIV) reference strains, respectively, and 87.7% to 98.5%, 82.5% to 99.9%, 87.6% to 98.4% with SIV reference strains, respectively. Homology of M gene was less than 90.1% with SIV H3N2 strains and HIV strains, but shared more than 97.6% with SIV H1N1 strains. These results indicated that the PB2, PB1, PA, HA, NP, NA and NS gene of A/Swine/Fujian/F2/07(H3N2) isolate might originate from the H3N2 subtype HFVs which were isolated from 1975 to 1982, and M gene might originate from the H1N1 subtype SIV, indicating that the isolate was a human-swine influenza reassortant virus with the RNA segments from human H3N2 influenza virus and classicalH1N1 SIV.%本研究由疑似猪流感病料样品中分离一株病毒,通过HA、HI、电镜观察、生物学特性测定及全基因序列测定表明,分离病毒株为H3N2亚型人流感病毒和H1N1亚型古典猪流感病毒(SIV)的重组体,命名为A/Swine/Fujian/F2/07(H3N2).该分离株含有8个基因片段,共13 442 bp,与GenBank中登录的H3N2亚型人流感病毒、H1N1亚型古典SIV和H3N2亚型SIV进行比较分析显示:分离株的HA、NS、NA基因与H3N2亚型人流感病毒株的同源性分别为84.7 ％～98.1％、94.4 ％～99.5％和88.6 ％～97.6％；与H3N2亚型SIV的核苷酸同源性分别为87.7％～98.5％、82.5 ％～99.9％和87.6 ％～98.4％；M基因与H3N2亚型人流感病毒和SIV的同源性均在90.1％以下,而与H1N1亚型古典SIV的同源性在97.6％以上.基因型分析表明分离株的PB2、PBI、PA、HA、NP、NA和NS基因片段来源于1975年～1982年的人流感病毒,而M基因来源于H1N1亚型古典SIV,充分证明猪作为流感病毒“混合器”的作用.【期刊名称】《中国预防兽医学报》【年(卷),期】2011(033)009【总页数】6页(P675-680)【关键词】两源重组H3N2亚型;分离;序列分析【作者】周伦江;王隆柏;俞玉鸿;魏宏;车勇良;陈如敬;吴学敏;邵良平;庄向生【作者单位】福建省农业科学院畜牧兽医研究所/福建省畜禽疫病防治T程技术研究中心,福建福州350013;福建省农业科学院畜牧兽医研究所/福建省畜禽疫病防治T程技术研究中心,福建福州350013;福建农林大学动物科学学院,福建福州350002;福建省农业科学院畜牧兽医研究所/福建省畜禽疫病防治T程技术研究中心,福建福州350013;福建省农业科学院畜牧兽医研究所/福建省畜禽疫病防治T程技术研究中心,福建福州350013;福建省农业科学院畜牧兽医研究所/福建省畜禽疫病防治T程技术研究中心,福建福州350013;福建省农业科学院畜牧兽医研究所/福建省畜禽疫病防治T程技术研究中心,福建福州350013;福建农林大学动物科学学院,福建福州350002;福建农林大学动物科学学院,福建福州350002【正文语种】中文【中图分类】S852.65猪流感病毒(Swine influenza virus，SIV)属正粘病毒科，A型流感病毒属，基因组约为13.6 kb，由8个独立节段组成，编码至少10个基因产物，其中节段1～3分别编码PB2、PB1和PB3聚合酶，节段4和节段6分别编码血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)，节段5编码核蛋白(NP)，节段7编码病毒基质蛋白Ml和离子通道蛋白M2，节段8编码非结构蛋白NSl和NS2[1]。

猪流感病毒的分离鉴定及生物学特性研究

猪流感病毒的分离鉴定及生物学特性研究刘琨;张云;赵保才;胡慧;黄磊;岳耀辉;马超锋;张龙现【摘要】In order to understand the prevalence of swine influenza in Henan Province, 63 samples of lungs from dead pigs were collected from 11 cities of Henan and the biological characteristics of swine influenza virus were analysed. The results showed that the 3 swine influenza viruses isolated were all H1N2 subtypes, named A/Swine/HeNan/ 01/2010 (H1N2), A/ Swine/HeNan/02/2010 ( H1N2 ) and A/Swine/HeNan/03/2010( H1N2) , respectively. On this basis, these isolation strains were pu-rificated by limited dilution cloning. Biological characteristics research showed: Except that A/Swine/ HeNan/03/2010( H1N2 ) could not agglutinate the pig and cattle erythroeytes, the remained two strains could agglutinate erythrocytes of chicken, sheep, Guinea pig, rabbit, mouse, pig and cattle; Hemagglutinin thermostability test results displayed A/Swine/HeNan/01/2010 ( H1N2 ) and A/ Swine/HeNan/02/ 2010(H1N2) belonged to thermstabile type, and A/ Swine/HeNan/03/2010 (H1N2) belonged to mid-thermstabile type. A/Swine/HeNan/01/2010 (H1N2) showed higher path-ogenicity to chicken embryo, of which EID50 and ELD50 were 10 -7.16 and 10-6.54, respectively, and the rnothers were lower. All the 3 strains were sensitive to ether, chloroform and acid and showed infectivity cytopathic effect in the MDCK cell, but they could not infect Balb/c mice in this study.%为了解河南省猪群中猪流感流行状况,对河南多个地区的63头病死猪进行SIV分离鉴定,并对获得的分离株进行生物学特性研究.从病死猪的肺脏中分离到3株H1N2亚型SIV,分别命名为:A/Swine/HeNan/01/2010(H1N2)、A/Swine/HeNan/02/2010(H1N2)和A/Swine/HeNan/03/2010(H1N2).其中,A/Swine/HeNan/01/2010(H1N2)和A/Swine/HeNan/02/2010(H1N2)均能凝集鸡、小鼠、兔、猪、豚鼠、绵羊和牛的红细胞,均为热稳定型,其中前者EID50和ELD50较高,分别为10-7.16和10-6.54；后者较低,分别为10-5.86和10-3.83.A/Swine/HeNan/03/2010(H1N2)对猪和牛的红细胞无凝集活性,为中等热稳定型,且EID50和ELD50较低,分别为10-2.43和10-2.67.同时3株SIV均对氯仿、乙醚和酸敏感,均可引起MDCK细胞病变,但不能感染BALB/c小鼠.【期刊名称】《河南农业大学学报》【年(卷),期】2012(046)005【总页数】5页(P553-557)【关键词】猪流感;分离;鉴定;生物学特性;H1N2【作者】刘琨;张云;赵保才;胡慧;黄磊;岳耀辉;马超锋;张龙现【作者单位】信阳市动物疾病预防控制中心,河南信阳464000;河南农业大学牧医工程学院,河南郑州450002;河南省出入境检验检疫局,河南郑州450002;河南农业大学牧医工程学院,河南郑州450002;河南农业大学牧医工程学院,河南郑州450002;河南农业大学牧医工程学院,河南郑州450002;信阳市动物疾病预防控制中心,河南信阳464000;河南农业大学牧医工程学院,河南郑州450002【正文语种】中文【中图分类】S852.65猪流感(Swine influenza，SI)是由猪流感病毒(Swine influenza virus，SIV)引起的一种急性、高度接触性呼吸道传染病，其临床特点为突发高热，流鼻涕，呼吸困难，咳嗽和体重下降［1］．该病除直接影响猪的自身抵抗力和生产性能外，还会引起妊娠母猪的流产和死产．同时猪流感还会继发其他病毒和细菌感染，造成更加严重的经济损失［2，3］．另外，自然条件下经常发生禽和人流感病毒传播给猪的事件，而SIV也可反传给禽和人，因此具有重大的公共卫生意义［4，5］．有关猪流感病毒的研究已有较多报道［6～13］．河南是中国养猪大省，为了解河南省猪流感的流行概况，本研究在2009—2010年对河南省多个地区展开了猪流感流行病学调查，并对所获得的分离株进行了亚型鉴定及生物学特性研究，以期为河南省乃至华北地区猪流感的防治提供依据．1 材料与方法1．1 材料1．1．1 样品采集采自河南新乡、漯河、信阳、商丘等地区的疑似因猪流感死亡猪肺脏样品63份．1．1．2 血清、细胞和试验动物抗鸡新城疫(ND)阳性血清和犬肾传代细胞(MDCK)由河南农业大学微生物学实验室保存;非免疫鸡胚购自新乡原阳某孵化场;SPF鸡胚购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司．1．1．3 主要仪器及试剂智能孵化箱(山东翔宇孵化设备厂);DYY－Ⅲ超净工作台(苏净集团安泰公司);超速冷冻离心机(Thermo公司);PTC－200型PCR仪(美国MJ Reasearch公司);Trizol LS Reagent(Invitrogen);M－MLV反转录酶、RNase 抑制剂、Premix EX Taq DNA聚合酶、LA Taq DNA聚合酶(TaKaRa宝生物工程有限公司);小量胶回收试剂盒(Omega公司);1%红细胞悬液;DMEM培养基;双抗溶液:注射用青霉素钠10 000 IU·mL－1(华北制药集团)，注射用硫酸链霉素10 000 IU·mL－1(华北制药集团)．1．2 方法1．2．1 SIV的分离与初步鉴定1．2．1．1 病料处理采集病死猪的肺脏组织在无菌条件下剪碎并研磨，用PBS 液(含链霉素和青霉素终浓度为3 000 IU·mL－1)制成10%的匀浆，4℃作用5 h，反复冻融3次，4℃ 5 000 r·min－1离心4 min，取上清液备用．1．2．1．2 鸡胚接种将经上述方法处理的上清液经尿囊腔接种9日龄非免疫鸡胚，每枚0．2 mL，每个样品接种2枚，35℃条件下孵育96 h．每隔8 h照胚，弃去24 h内死亡鸡胚，收集24～96 h死亡和未死亡鸡胚置4℃过夜，次日无菌收集尿囊液．1．2．1．3 红细胞凝集(HA)和血凝集抑制(HI)试验根据《OIE诊断和疫苗标准操作指南》(OIE Standards Commission，2008) 常规微量法进行［6］．1．2．2 SIV的亚型鉴定及命名1．2．2．1 引物设计及病毒RNA提取反转录通用引物Uni12:5’-AGC AAA AGC AGG-3’．PCR 扩增引物分为通用引物和亚型引物2种．其中通用引物和H9亚型引物基于NCBI收录的SIV序列采用Primer 5．0 自行设计，H1，H3，N1，N2 4 种亚型亚型引物参照CHOI等［4］的方法．引物均由上海英潍捷基公司合成，PAGE级纯化，－20℃保存备用．病毒RNA提取参照Invitrogen Trizol LS Reagent试剂盒操作说明进行．1．2．2．2 病毒cDNA合成及PCR反应条件反转录反应体系:按照反转录试剂盒(Takara)说明书进行，依次加入各成分后，混合均匀，42℃保温1 h，70℃保温15 min后冰上冷却备用．PCR反应条件:95℃预变性5 min，94℃变性30 s，50～55℃退火30 s，延伸72℃ 2 min，运行30个循环后于72℃延伸10 min．反应结束后取PCR产物5 μL，采用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定．1．2．2．3 SIV命名根据世界卫生组织(WHO)公布的流感病毒通用命名规则进行命名，S1V分离株名称中包括型别(A，B，C)，分离宿主的类别/分离地名称/毒株序号/分离年代(A型流感病毒还需标注HA及NA抗原亚型)．1．2．3 SIV有限稀释克隆将SIV第4代鸡胚尿囊液进行10－2～10－8稀释．每个稀释度接种 SPF鸡胚后，病毒血凝价达到8log2或8log2以上的最高稀释度的鸡胚尿囊液，即为该SIV分离株的稀释克隆毒株．经无菌检验后用1．5mL eppendorf分装，置－70℃保存备用．生物学特性研究部分所用流感病毒株均为已纯化的SIV稀释克隆毒株．1．2．4 SIV 生物学特性研究1．2．4．1 SIV红细胞凝集谱测定用新鲜制备的鸡、猪、豚鼠、兔、小鼠、绵羊、牛等动物的1%红细胞悬液与新鲜收获的病毒液进行HA试验，测定红细胞凝集谱．1．2．4．2 S1V血凝素热稳定试验将新鲜收获的病毒液分装于1．5 mL eppendorf管，每管0．5 mL，置于56 ℃ 水浴处理 0，5，10，15，30，60，90，120，150，180，210 min及过夜，处理后迅速放到4℃冰箱5～10 min，分别测其HA效价．1．2．4．3 脂溶剂敏感性及耐酸性试验参照等李玉萍等［7］方法，将经乙醚、氯仿、0．1 mol·L－1盐酸溶液及等量生理盐水处理过的病毒液分别接种3枚鸡胚，每枚0．2 mL，35℃孵育96 h，收集24～96 h内死亡或未死鸡胚尿囊液，测定HA效价．如处理组病毒液与对照组病毒液血凝价相差2个滴度以上，则判定病毒对其敏感．1．2．4．4 鸡胚半数感染量(EID50)和鸡胚半数致死量(ELD50)试验将新收获的病毒液用生理盐水液l0倍倍比稀释后，接种10日龄SPF鸡胚，每个稀释度接种5枚SPF鸡胚，每枚0．2 mL，并设生理盐水对照组，35℃孵育96 h．每隔6 h照胚1次，弃去24 h死亡的鸡胚，并统计鸡胚死亡数目．收获鸡胚尿囊液，测定HA效价．按Reed－Muench法计算 EID50和 ELD50［8］．1．2．4．5 细胞感染试验将1 mL新鲜病毒液接种至单层MDCK细胞，在体积分数5%CO2，37℃条件下孵育7 d，定期观察细胞病变．1．2．4．6 小鼠感染试验将新鲜病毒液10倍倍比稀释，每一稀释度经滴鼻途径接种1月龄BALB/c小鼠4只，每只0．1 mL，并设生理盐水对照组．每天观察小鼠临床症状至感染后第14天．死亡小鼠采集内脏进行SIV分离鉴定．未死亡小鼠采集血清，进行HI试验．2 结果与分析2．1 SIV的分离与初步鉴定病料上清液首次接种鸡胚后，96 h内无鸡胚死亡．盲传3代后，有3份尿囊液出现血凝性，HI检测表明其均与抗ND阳性血清为阴性反应．3份具有血凝性的尿囊液中的鸡胚胎存在不同程度的全身性出血．2．2 SIV亚型鉴定及命名2．2．1 通用引物及亚型引物RT-PCR对SIV鉴定结果提取3株病毒RNA，用NP基因通用引物进行RT-PCR扩增，电泳结果显示扩增片段与预期片段大小相符，约为510 bp(图1)．图1 SIV通用引物PCR产物电泳图Fig．1 Identification of products by universal primers of SIVM．DNA质量分子标准;1～3．SIV通用引物RT-PCR阳性样品;P．阳性对照;N．阴性对照．M．DNA Marker 2000;1 to 3．Positive sample;P．Positive control;N．Negative control．亚型引物 RT-PCR鉴定结果显示，3株毒株HA基因片段大小均约为1．0 kb，与H1亚型片段大小相符;NA基因片段大小约为500 bp，与N2亚型片段大小相符(图2)．PCR产物测序结果进一步显示猪肺脏所获分离株为H1N2亚型SIV．图2 SIV亚型引物PCR产物电泳图Fig．2 Identification of products bysubtype primers of SIVM．DNA 质量分子标准;1，3，5．SIV H1亚型引物 RT-PCR 扩增产物;2，4，6．SIV N2亚型引物 RT-PCR 扩增产物;N1．H1亚型引物阴性对照;N2．N2亚型引物阴性对照．M．DNA Marker 2000;1，3，5．RT-PCR Amplification results of H1 subtype;2，4，6．RT-PCR Amplification results of N2 subtype;N1．Negative control of N1 subtype;N2．Negative control of N2 subtype．2．2．3 SIV的命名根据WHO公布的流感病毒通用命名法则，将分离到的3株猪流感病毒统一命名(表1)．表1 猪肺脏中分离到的SIV命名Table 1 The names of SIV stains in the lung of pig地区Regions 亚型Subtype 命名Name 缩写Abbreviation商丘Shangqiu H1N2 A/Swine/HeNan/01/2010(H1N2)SWHN/01/10漯河Luohe H1N2 A/Swine/HeNan/02/2010(H1N2) SWHN/02/10新乡Xinxiang H1N2 A/Swine/HeNan/03/2010(H1N2)SWHN/03/102．3 SIV生物学特性研究2．3．1 病毒红细胞凝集谱 A/Swine/HeNan/01/2010(H1N2)和A/Swine/HeNan/02/2010(H1N2)对鸡、小鼠、豚鼠、兔、猪、绵羊和牛红细胞均具有凝集性;但A/Swine/HeNan/03/2010(H1N2)对猪和牛的红细胞无凝集活性(表2)．2．3．2 SIV血凝素热稳定性测定 A/Swine/HeNan/01/2010(H1N2)属于热稳定型，A/Swine/HeNan/03/2010(H1N2)属于中等热稳定型(表3)．表2 3株SIV红细胞凝集谱Table 2 Heamagglutination spectrum of SIV strains in this study注:“+”代表具有红细胞凝集性;“－”代表无红细胞凝集性．Note:“+”indicates that virus has heamagglutination of redcell;“－”indicates that virus has no heamagglutination of red cell．分离株Islation鸡猪牛兔Chick小鼠Mouse豚鼠Cavia cobaya Pig Cattle Rabbit SWHN/01/10 + + + + + +SWHN/02/10 + + + + + +SWHN/03/10+++－－+表3 SIV分离株血凝素热稳定性测定结果Table 3 The stability of HA of SIV strains分离株Islation处理时间/min Time of treatment 结果Result SWHN/01/10 8 8 8 8 7 7 7 6 6 6 0 热稳定型0 5 15 30 60 90 120 150 180 210过夜Overnight SWHN/01/10 7 7 7 5 4 2 0 0 0 0 0 热稳定型SWHN/01/10 4 3 2 0 0 0 0 0 0 0 0中等热稳定型2．3．3 脂溶剂敏感性和耐酸性试验将3株分离株按照上述方法经氯仿、乙醚和酸处理后，接种鸡胚，所收获的尿囊液均检测不到血凝价，说明3株分离株对氯仿、乙醚和酸敏感．2．3．4 SIV分离株EID50和ELD50测定结果根据Reed-Muench法，A/Swine/Henan/01/2010(H1N2)EID50=10 －7．16，ELD50=10 －6．54;A/Swine/Henan/02/2010(H1N2)EID50=10 －5．86，ELD50=10 －2．43;A/Swine/Henan/03/2010(H1N2)EID50=10 －3．83，ELD50=10 －2．67．2．3．5 细胞感染试验 3株病毒株接种MDCK细胞后，均能感染细胞并造成细胞拉网脱落等病变．收集细胞液，血凝检测和RT-PCR结果显示，细胞液均具有血凝性，血凝价分别为1∶256，1∶32和1∶16．用NP通用引物进行RT-PCR 扩增，结果显示扩增片段约为510 bp，与先前扩增片段大小相符．2．3．6 小鼠感染试验 A/Swine/Henan/01/2010(H1N2)，A/Swine/Henan/02/2010(H1N2)，A/Swine/Henan/03/2010(H1N2)在接种小鼠14 d内，小鼠无明显临床症状、无死亡，对照组小鼠正常．剖检后未见明显病理变化，将小鼠肺脏研磨后接种鸡胚，收集的尿囊液无血凝性．小鼠血清与SIVHI试验为阴性结果．3 小结与讨论目前，世界范围内猪群中流行的SIV亚型主要有H1N1，H3N2 和 H1N2 3 种［9］．对于河南地区，CONG等［10］从河南省有呼吸道症状的猪中分离到H9N2亚型SIV．段廷云［11］从河南地区猪场分离到1株H1N1亚型SIV，并建立了实时荧光定量PCR诊断方法．李春［12］从河南猪病料中分离到1株H1N1亚型流感病毒;赵朴等［13］对河南省5个不同猪场采集病料，分离到3株H3N2亚型SIV．本研究所分离的3株毒株均为H1N2亚型SIV，为首次报道证实在河南地区存在H1N2亚型SIV，该结果对河南省乃至中国的猪流感的防治和监测具有重要的指导意义．病毒的有限稀释克隆纯化是为了防止没有血凝活性的病毒污染造成鸡胚的非正常死亡，以及排除生物学特性及分子生物学试验中的非特异性反应，因此本研究将分离到的3株SIV毒株进行有限稀释克隆法纯化．其中A/Swine/Henan/03/2010(H1N2)进行多次有限稀释纯化后，其血凝价仍较低，其原因有待进一步研究．SIV血凝性具有重要的流行病学和生态学意义．A/Swine/Henan/01/2010(H1N2)和A/Swine/Henan/02/2010(H1N2)能够凝集鸡、小鼠、兔、猪、豚鼠、绵羊和牛的红细胞，A/Swine/Henan/03/2010(H1N2)不能凝集猪和牛的红细胞．SIV的血凝性易受温度影响，一般而言，热稳定型毒株在自然条件下存活能力相对较强，将有更多的机会通过不同途径在同一或不同宿主间传播．本研究结果显示A/Swine/Henan/01/2010(H1N2)和A/Swine/Henan/02/2010(H1N2)表现为热稳定型，A/Swine/Henan/03/2010(H1N2)为中等热稳定型．说明前两个毒株对自然条件的抵抗力较高，具有更大的危害性．EID50和ELD50是反映SIV生物学特性最常考虑的2个指标，与毒株的致病力有一定的关系［8］．本试验中毒株A/Swine/Henan/01/2010(H1N2)EID50较高，说明该分离株适应于鸡胚增殖，而A/Swine/Henan/03/2010(H1N2)较低，说明此毒株在鸡胚中不能很好的增殖，制作成疫苗较困难．A/Swine/Henan/01/2010(H1N2)ELD50较高，其对鸡胚有较高的致死性，说明该毒株对鸡胚的致病性较强．小鼠感染试验中，3个毒株接种小鼠后，均未观察到明显临床症状，精神、采食和饮水均正常．剖检后未见明显病理变化．将小鼠肺脏研磨后接种鸡胚，收集的尿囊液无血凝性，说明SIV毒株未感染小鼠，推测毒株对小鼠无致病性．这与王连想等［8］报道的H1N1感染小鼠结果一致．而SHIN等［14］经鼻腔内接种法给6～8周龄 BALB/c小鼠接种H1N2，H3N1，H3N2不同亚型的 SIV，接种后小鼠均出现精神萎靡不振、畏寒、呼吸短促、被毛松乱等临床症状，并且能从肺脏中分离出病毒，这可能是由于不同亚型或分离株对小鼠的致病性不同造成的．本试验从河南地区首次分离到3株H1N2亚型SIV毒株并阐述了其生物学特性，该结果对河南省猪群中SIV的防治具有一定的指导意义，而所获SIV分离株各基因片段来源及遗传演化分析等信息对则需进一步深入研究．参考文献:［1］ CHOI C，HA S K，CHAE C．Detection and isolation ofH1N1 influenza virus from pigs in Korea［J］．Vet Rec，2004，154(9):274－275．［2］徐利平，杨克礼，梁望旺，等．猪病混合感染对临床诊断的影响［J］．安徽农业科学，2007，35(36):11847－11848．［3］蔡宝祥．家畜传染病学［M］．北京:中国农业出版社，2001:5－6．［4］ CHOI Y K，GOYAL S M，KANG S W，et al．Detection and subtyping of swine influenza H1N1，H1N2 and H3N2 viruses in clinical samples using two multiplex RT-PCR assays［J］．2002，102(1):53 －59．［5］ LEE M S，CHANG P C，SHIEN J H，et al．Identification and subtyping of avian influenza viruses by reverse transcripfion-PCR ［J］．2001，97(1):13 －22．［6］李海燕，辛晓光，于康震，等．猪流感病毒的分离与鉴定［J］．中国预防兽医学报，2002，24(1):12－17．［7］李玉平，徐镔蕊，刘尚高．猪流感病毒的分离鉴定及特性测定［J］．中国兽医杂志，2007，43(8):13－15．［8］王连想，毕英佐，曹永长等．猪流感病毒广东株的分离鉴定及其特性［J］．中国兽医科技，2003，23(2):17－ 21．［9］ BROWN I H．The epidemiology and evolution of influenza viruses in pigs［J］．Vet Microbiol，2000，74(1):29－46．［10］ CONG Y L，WANG C F，YAN C M，et al．Swine infection withH9N2 influenza viruses in China in 2004［J］．Virus Genes，2008，36(3):461 －469．［11］段廷云．H1N1亚型SIV河南株的分离鉴定、HA基因的克隆和序列分析及荧光定量PCR诊断方法的建立［D］．郑州:河南农业大学，2006．［12］李春．猪流感病毒的分离鉴定和猪流感血清流行病学调查［D］．武汉:华中农业大学，2007．［13］赵朴，郑玉姝，贾贝贝，等．猪流感病毒河南株的分离鉴定和生物学特性［J］．华北农学报，2010，25(4):107－110．［14］ SHIN J Y，SONG M S，LEE E H，et al．Isolation and characterization of novel H3N1 swine influenza viruses from pigs with respiratory diseases in Korea［J］．J Clin Microbiol，2006，44(11):3923 －3927．。

逆转录环介导等温扩增技术检测H3亚型猪流感病毒_刘中勇

动物医学进展,2009,30(7):1-5Progress in Veterinary Medicine研究论文逆转录环介导等温扩增技术检测H3亚型猪流感病毒＊刘中勇1,朱道中1,李少璃2,冀　君2,毕英佐2,谢青梅2＊,曹永长2＊(1.广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心,广东广州510623;2.华南农业大学动物科学学院,广东广州510642) 摘　要:基于环介导等温扩增技术(RT-LAM P),建立了一种用于快速检测H3亚型猪流感病毒的方法。

根据GenBank中收录的H3N2亚型猪流感病毒(SIV)H A基因保守区的序列,设计一组对应H A序列6个区域的4条特异性引物,建立RT-LAMP反应体系;经优化,确定了最佳的LA MP反应条件。

扩增后产物形成的焦磷酸离子和溶液中的镁离子结合而形成焦磷酸镁沉淀,结果可视。

同时用特异性内切酶HhaⅠ对所获得的产物进行酶切鉴定,所得的酶切产物大小与理论值完全符合。

用已建立的RT-LAM P技术检测临床样品,检测结果与RT-PCR方法符合率均达到100%。

结果表明,本研究建立的RT-LAM P检测猪流感病毒方法,操作简单,灵敏度高,特异性强,是一种适用于现场诊断的检测技术。

关键词:H3亚型猪流感病毒;血凝素;逆转录环介导等温扩增中图分类号:S852.659.5文献标识码:A文章编号:1007-5038(2009)07-0001-05 猪流感(Swine influenza,SI)病原为正黏病毒科、A型流感病毒属的(甲型)流感病毒。

猪流感被认为是“猪呼吸道病综合征”的原发病之一,也是集约化养猪场普遍存在且难以根除的猪呼吸道疾病之一[1]。

猪感染猪流感病毒(SIV)后会导致其他疾病如猪蓝耳病、猪圆环病毒病和猪胸膜肺炎等疾病的发生,从而给养猪业造成巨大的经济损失。

更重要的是,猪体可以同时感染不同种、不同亚型的流感病毒。

因此,许多学者认为猪在流感病毒大流行的产生中起着重要作用,它是人与猪流感病毒间发生基因重组的重要场所,是人流感病毒和猪流感病毒的“搅拌器”,对人类健康也造成了严重的威胁,而快速诊断和及时监测是控制猪流感的前提条件。

猪流感病毒的分离鉴定及毒力检测

猪流感病毒的分离鉴定及毒力检测程珏益;徐军;徐成刚;张海梁;任涛;罗开健;辛朝安;江经纬;廖明【期刊名称】《中国兽医杂志》【年(卷),期】2007(043)001【摘要】猪流感（Swine influenza，SI）主要是由正粘病毒科A型流感病毒引起的猪一种急性、高度接触性呼吸道传染病。

为了解猪流感在广东的存在和流行情况、SIV的流行病学规律和遗传演化，本研究从广东省采集到的棉拭子和猪肺分离到的两株H3N2亚型SIV。

选其中一株（SGD2）作为研究对象，对其致病性和生物学特性进行研究。

【总页数】2页(P28-29)【作者】程珏益;徐军;徐成刚;张海梁;任涛;罗开健;辛朝安;江经纬;廖明【作者单位】华南农业大学兽医学院,广东,广州,510642;广东出入境检验检疫局,广东,广州,510623;广州市花都区畜牧综合服务站,广东,广州,510800;华南农业大学兽医学院,广东,广州,510642;华南农业大学兽医学院,广东,广州,510642;华南农业大学兽医学院,广东,广州,510642;华南农业大学兽医学院,广东,广州,510642;华南农业大学兽医学院,广东,广州,510642;华南农业大学兽医学院,广东,广州,510642;华南农业大学兽医学院,广东,广州,510642【正文语种】中文【中图分类】S8【相关文献】1.猪胸膜肺炎放线杆菌的分离鉴定、毒力基因检测及药敏试验 [J], 周信荣;宋德平;彭棋;陈燕君;李安琪;张帆帆;吴琼;唐玉新2.一株H3N2亚型猪流感病毒株的分离鉴定及对猪的感染性研究 [J], 路伟;张秀华;苏玮玮;武华;朱国强3.猪源荚膜血清F型多杀性巴氏杆菌的分离鉴定、毒力基因检测与致病性研究 [J], 方超;李润成;魏榕;王锐;胡玉立;黎满香;张磊;余兴龙4.猪流感病毒的分离鉴定及毒力检测 [J], 程珏益;徐军;徐成刚;张海梁;任涛;罗开健;辛朝安;江经纬;廖明;5.猪源杀鲑气单胞菌分离鉴定及毒力因子检测 [J], 邓同炜; 蒋增海; 霍元楠; 宋浩; 何启盖因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

猪流感病毒的分离鉴定和猪流感血清流行病学调查的开题报告

猪流感病毒的分离鉴定和猪流感血清流行病学调查的开题
报告
一、研究背景
猪流感病毒是一种能感染猪类的病毒，最初被认为只对猪类有感染作用，但近年来发现人类也可被感染。

猪流感病毒属于正型病毒，通过气溶胶传播方式传播，易造
成大规模感染，严重影响猪类养殖业。

近年来，猪流感病毒在全球范围内频繁爆发，
严重影响了猪类生产和市场需求，同时也对人类健康造成潜在威胁。

因此，对猪流感
病毒的分离鉴定以及病毒在猪类人群中的流行病学调查非常重要。

二、研究目的
本研究旨在通过对猪流感病毒的分离鉴定以及猪流感血清流行病学调查，深入了解病毒在猪类人群中的流行情况，为今后预防和控制猪流感疫情提供重要数据支持。

三、研究内容
1. 猪流感病毒样本的采集和处理。

采集来自养殖场的猪病毒样本，进行样本处理，提取病毒。

2. 猪流感病毒分离鉴定。

采用细胞培养技术对提取的病毒样本进行分离鉴定，同时对病毒进行基因序列分析。

3. 猪流感血清流行病学调查。

采集来自不同养殖场的猪血清样本，进行ELISA
检测，了解猪类人群中猪流感病毒的感染情况和流行趋势。

四、研究意义
通过本研究，可以深入了解猪流感病毒在猪类人群中的流行情况，为今后疫情预警和控制提供科学数据支持，同时也为该领域的研究提供重要的实验基础。

H3亚型猪流感病毒荧光定量PCR检测方法的建立

H3亚型猪流感病毒荧光定量PCR检测方法的建立王云龙;陈小科;韩洁;李玉林;李恒思;王真;邓黎黎【期刊名称】《动物医学进展》【年(卷),期】2009(030)006【摘要】通过RT-PCR方法克隆了H3亚型猪流感病毒HA基因一段靶序列,构建重组质粒作为标准阳性模板.根据GenBank中的H3亚型猪流感病毒HA基因保守序列设计了用于FQ-PCR的1对引物和1条TaqMan探针.通过条件优化,以10倍系列稀释的质粒为标准品进行荧光定量PCR扩增,并制作标准曲线,建立了检测H3亚型猪流感的荧光定量PCR方法.结果表明,该方法检测灵敏度可达1.0×100拷贝/μL,线性范围为109～100,达10个数量级;对起始浓度为1.0×109、1.0×108、1.0×107拷贝/μL的标准品的最终实际测得值(Ct)分别为13.68,18.21和20.57;变异系数分别为0.31%、0.17%和0.12%,均小于5%,说明此方法具有良好的准确性和重现性.对阳性组织病料的检测表明,该方法的检测灵敏度高出常规PCR,与套式PCR具有相近的灵敏度.【总页数】6页(P30-35)【作者】王云龙;陈小科;韩洁;李玉林;李恒思;王真;邓黎黎【作者单位】郑州职业技术学院,河南郑州,450121;河南省生物工程技术研究中心,河南郑州,450001;河南省生物工程技术研究中心,河南郑州,450001;河南省生物工程技术研究中心,河南郑州,450001;河南省生物工程技术研究中心,河南郑州,450001;河南省生物工程技术研究中心,河南郑州,450001;河南省生物工程技术研究中心,河南郑州,450001;郑州职业技术学院,河南郑州,450121;河南省生物工程技术研究中心,河南郑州,450001【正文语种】中文【中图分类】S852.659.5【相关文献】1.H1和H3亚型猪流感病毒二重TaqMan-MGB探针荧光RT-PCR检测方法的建立 [J], 王建华;董志珍;赵祥平;陈小金;张俊哲;王玉玲;肖妍;赵丹;谭旭菲;王乃福;陈本龙2.猪流感病毒神经氨酸酶N2亚型Taq man荧光定量PCR检测方法的建立 [J], 孙忠晟;尹燕博;王平;陈正平;胡永钢;许宏伟3.H1、H3亚型猪流感病毒双重实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用 [J], 王博;王慧煜;赵宝华;罗静;王承民;何宏轩;韩雪清4.H3亚型猪流感病毒抗原捕捉ELISA检测方法的建立 [J], 陈艳;乔传玲;杨焕良;孔维;辛晓光;陈化兰5.H3亚型猪流感病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立 [J], 郭泗虎;王文华;张亮权;齐海涛;曹楠;闫明菲;黄昌力;张超轶;张桂红因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

猪流感病毒H3N2亚型HA基因的表达以及免疫效力的研究的开题报告

猪流感病毒H3N2亚型HA基因的表达以及免疫效力的研
究的开题报告
1.研究背景
猪流感是一种由豚瘟病毒引起的疾病，其症状与人类流感相似。

猪流感病毒主要通过空气传播，具有高度传染性和变异性，一旦暴发，很容易引起流行。

其中，H3N2亚型病毒是猪流感病毒中的一种主要类型，能够感染猪和人，并且对人有较强的致病力。

因此，对H3N2亚型病毒进行深入研究，探明其表达和免疫机制，对于预防和控
制猪流感的流行具有重要意义。

2.研究目的
本研究旨在通过对猪流感病毒H3N2亚型HA基因的表达及其对免疫效力的影响
进行分析，探究其致病机理，为针对猪流感的治疗和预防提供理论支持。

3.研究内容
（1）设计合成H3N2亚型HA基因的表达载体，转染至哺乳动物细胞中，观察其表达情况。

（2）通过免疫印迹、流式细胞术等技术，分析H3N2亚型HA基因的表达对宿主免疫系统的影响并探讨其致病机理。

（3）构建H3N2亚型HA基因的免疫保护效力评价模型，对其进行评估，并比较不同免疫方案对其免疫效果的影响。

4.研究意义
本研究可以深入研究猪流感病毒H3N2亚型HA基因的免疫机制及免疫保护效力，为预防和控制猪流感的流行提供理论支持，有助于推广猪流感疫苗的研发和生产，减
少疾病的发病率和死亡率，提高相关行业的健康水平和经济效益。

H3亚型猪流感病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立

H3亚型猪流感病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立郭泗虎;王文华;张亮权;齐海涛;曹楠;闫明菲;黄昌力;张超轶;张桂红【期刊名称】《中国预防兽医学报》【年(卷),期】2012(34)2【摘要】In this study, a SYBR Green I real-time PCR assay was developed for detection of swine influenza virus (SIV) subtype H3 with the specific primers designed according to the conserved sequence of HA genes of SIV H3 subtype in GenBank. The results showed that the standard curve established by recombinant plasmid showed a good linear relationship between template concentration and threshold cycle, the correlation coefficient (R2) was 0.994 and the coefficient of variation (CV) of intra-assay was between 0.17% and 1.41%. No cross-reaction was detected for other swine viruses and HI, H4, H6 and H9 subtypes of SFV. The results indicated that real-time PCR is more sensitive than routine PCR and virus isolation which was a promising application in diagnose of clinical suspected cases.%为建立一种快捷、可行的检测H3亚型猪流感病毒(SIV)的方法,本研究根据GenBank中登录的H3亚型SIV HA基因的保守序列,设计合成一对特异性引物,建立了一种检测H3亚型SIV的SYBR Green Ⅰ荧光定量检测方法,并进行灵敏度、稳定性和特异性试验,与普通PCR进行比较.研究结果表明,标准曲线的循环阈值与模板浓度呈现良好的线性关系,R2为0.994,CV在0.17％～1.41％之间,具有良好稳定性.除H3亚型SIV外,对H1、H4、H6、H9亚型SIV以及猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、口蹄疫病毒和猪圆环病毒2型的检测均为阴性,与普通PCR相比更灵敏.该方法特异性好,准确率高,适于临床分离鉴别H3亚型SIV.【总页数】4页(P124-127)【作者】郭泗虎;王文华;张亮权;齐海涛;曹楠;闫明菲;黄昌力;张超轶;张桂红【作者单位】华南农业大学兽医学院农业部兽用疫苗创制重点实验室,广东广州510642;华南农业大学兽医学院农业部兽用疫苗创制重点实验室,广东广州510642;华南农业大学兽医学院农业部兽用疫苗创制重点实验室,广东广州510642;华南农业大学兽医学院农业部兽用疫苗创制重点实验室,广东广州510642;华南农业大学兽医学院农业部兽用疫苗创制重点实验室,广东广州510642;华南农业大学兽医学院农业部兽用疫苗创制重点实验室,广东广州510642;华南农业大学兽医学院农业部兽用疫苗创制重点实验室,广东广州510642;华南农业大学兽医学院农业部兽用疫苗创制重点实验室,广东广州510642;华南农业大学兽医学院农业部兽用疫苗创制重点实验室,广东广州510642【正文语种】中文【中图分类】S852.65【相关文献】1.H9亚型禽流感病毒SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR法检测方法的建立 [J], 徐守振;尹燕博2.猪圆环病毒2型SYBR-Green 1实时荧光定量PCR检测方法的建立 [J], 贾艳艳;李明凤;王东方;崔保安;陈红英;魏战勇;吕晓丽;郭显坡3.H9亚型鸭源禽流感病毒SYBR Gr eenⅠ实时荧光定量RT-PCR快速检测方法的建立 [J], 万春和;黄瑜;林甦;施少华;林秋敏;陈红梅;程龙飞;傅光华;林芳;林建生4.猪星状病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立与初步应用 [J],商晓桂;郭伟;杨莲茹;杨志彪;华修国;朱建国;崔立5.北美H7亚型禽流感病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立 [J], 王晨曦;张谞霄;蒲娟;孙洪磊因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

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菌和病毒的继发或混合感染，疫情变得复杂，使死亡用常规方法测定收获尿囊液的血凝活性，若测不到率增高。其病原为单股负链ＲＮＡ病毒，于正黏ＨＡ活性，属可认为阴性标本不必进行盲传，ＨＡ测定
基因设计引物，增出预期的约３５ｂ扩１ｐ片段，存鼻拭子样品。１２病毒分离．表明该病毒为Ｈ３亚型猪流感病毒。
关键词：流感病毒；离；定；凝抑制试猪分鉴血
验；转录一合酶链反应逆聚
从广东东莞和鹤山等地不同猪场采集４Ｏ份鼻终１株病毒与抗猪流感Ｈ３亚型猪流感病毒阳拭子或病死猪的肺脏。用加庆大毒素（浓度为／）０／一Ｏ℃保性血清的ＨＩ验为阳性；据猪流感病毒Ｍ１ｍｇｍＬ的５０ｍＬＬ甘油生理盐水，２试根
阳性血清进行常规微量法ＨＩ试验。１３３ＲＴ— Ｃ பைடு நூலகம்定．．ＰＲ
也分到了Ｈ３。目前，Ｎ２毒株及其变异株已Ｎ２Ｈ３传到了欧美的猪群中，在世界范围包括我国的猪并群中广泛存在。世人对此一直比较关注，不仅在这于其显而易见的动物传染病意义，重要的是其潜更在的公共卫生意义。研究表明，的种间屏障相对猪较低，人流感病毒和禽流感双重感染的“ 是混合器 ” 。
延到亚洲，国也未能幸免。１６我９９年我国Ｈ３Ｎ２亚型ＳＶ在台湾首次报道。１７Ｉ９０年，香港的猪群中在
１３２ＨＩ验．．试
对有血凝活性鸡胚尿囊液，分别
用ＨＩＨ３亚型ＳＶ阳性血清和新城疫病毒（，ＩＮＤＶ）
（山科学技术学院动物医学系，东佛山５８３）佛广２２１
中圈分类号：８２６９５￥５．８￥５．５．，８８２
文献标识码：Ａ
文章编号：０７５３（０６００１０１０ —０８２０）６０６—３
维普资讯
动物医学进展．０６２（）６ —３２０，７６：１６
ＰｏｒｓｎＶｅｅｎｒｅｉｉｅｒｇｅｓｉｔｒａｙＭｄｃｎｉ
Ｈ３亚型猪流感病毒分离与鉴定
黄良宗，万军，淑敏，琼珍顾王冼
ＧＧＣＴＡＡＡＧＡＣＡＡＧＡＣＳ２：ＡＴＡＣ３，Ｉ５ＣＴＡＧＧＣＣＡＡＴＧＡＣＣＡＣＣ３。
．．．而目前ＳＶ的血清型至少发现有ＨＩ、Ｎ２１３３２ＲＮＡ抽提ＩＮ１Ｈ１、
病毒科Ａ型流感病毒。ｓ的发生和流行已有近百可疑的标本应按同法盲传１代，仍为阴性，Ｉ如可认为年的历史，９８年美国首次报道该病，９０年，１１１３阴性，弃之。
Ｓｏｅ次分离鉴定了经典Ｈ１ｈｐ首Ｎ１亚型ＳＶ。１７Ｉ９９年，禽源ＨＩＩ在欧洲猪群中广为传播，Ｎ１ＳＶ之后蔓
摘要：东莞和鹤山等地不同猪场采集的了鉴定，从现报告如下。４０份鼻拭子或病死猪的肺、管病料中分离气１材料与方法
到４株有血凝活性的病毒，中３株病毒与其１１病料样品处理．新城疫病毒阳性血清的ＨＩ验为阳性，外试另
Ｈ１、Ｎ２Ｈ３、Ｎ２等７种［２。Ｎ７Ｈ３、Ｎ６Ｈ９１＿］
１３３１引物设计．．．
根据Ｇｎａｋ收录的ＳＶ基ｅＢｎｌ
因序列设计一对针对Ｍ基因的引物，论上能扩增理
３５ｂ１ｐ的产物。引物序列如下：Ｉ：ＧＧＡＡＴＳＩ５Ｔ
采用羊膜腔和尿囊腔接种１龄鸡胚，０ｄ
０２ｍＬ胚，．／每份标本接种３个鸡胚。３５℃恒温箱
２ｈ４ｈ内死亡的鸡胚，收获尿囊猪流感（ｗｉｅｉｆｅｚ，Ｉ是目前危害养猪业孵育７。弃去接种２ＳｎｌｎａＳ）ｎｕ的一种重要的呼吸系统疾病，规模化养猪场普遍液。是存在且难以根除的群发性疾病之一。其突出的流行１３病毒鉴定．特点是常以亚临床形式存在并常引起其他呼吸道细１３１ＨＡ活性测定按照文献［］方法进行。．．３的
本试验采用血凝抑制（）验和Ｒ－Ｃ两ＨＩ试ＴＰＲ
按Ｉｖｔｏｅｎｉｇｎ公司Ｔｒｏｒｉｌｚ
ｒａｅｔｅｇｎ试剂盒步骤进行。取２０Ｌ病毒液，人５加