促红细胞生成素预处理对锂-匹罗卡品诱导的癫痫持续状态大鼠海马神经元凋亡的影响

陕西医学杂志 2008 年 8 月第 37 卷第 8 期 物 (1∶ 500) 室温 2h , 最后用葡萄糖氧化酶 2 DAB 2硫酸 镍胺法呈色。 每步之间均用0. 01M KPB S 充分洗涤。 然 后常规贴片、 干燥、 脱水、 透明、 封片 , 光镜观察。 阴性对 照组染色用血清稀释液代替一抗。 2. 6 细胞计数与统计学分析: 每只大鼠取 6 张非 连续的背侧海马一侧脑片进行观察, 实验组及对照组 大鼠根据解剖学定位标志取相近部位的脑片。 为了定 量观察, 所取脑片之间至少间隔 150Λ m。400 倍光镜下 观察大鼠齿状回 (Denta te gyru s, D G ) 、 CA 1 及 CA 3 区 的 casp ase 23 阳性细胞。 细胞计数采取手工方法 , 由不 知道实验设计的有经验的实验师进行。 计数结果以均 θ ± s) 表示。采用单因素方差分析, P < 0. 数±标准差 ( x 05 时判定有统计学意义。 结 果 1 模型大鼠的行为学表现 癫痫组大鼠在腹腔 注 射氯化锂后 20h 中均无行为学异常, 而注射盐酸匹 罗卡品后均出现周围胆碱能反应 , 如瞳孔缩小, 毛发竖 立, 血泪, 腹 泻及刻 板动作 等。 15～ 30m in ( 平均 22. 5m in ) 后均出现 I V 级以上发作, 并出现 SE。 rhEpo 预 处理组大鼠在注射盐酸匹罗卡品后仅有 3 只出现 I V 级以上发作 , 并出现 SE, 余 7 只的痫性发作行为在 I V 级以下。对照组大鼠均无痫性发作。 2 ca spa se 23 免 疫 组 化 结 果 正 常 大 鼠 海 马 caspase 23 阳性细胞的表达水平较低, 而癫痫组大鼠海 马 CA 1�CA 3 区、 D G 的 ca spa se23 阳性细胞的表达在 SE1h 后却明显增加, 在 Epo 处理后又有所降低。经细 胞计数与统计学分析后提示: 对照组大鼠海马 CA 1� CA 3 区 ( 190. 55 ± 18. 74 ) 、 D G ( 318. 26 ± 37. 61) 的 caspase 23 阳性 细胞与 rhEpo 处理 组大鼠 (CA 1�CA 3 区 270. 63±19. 89; D G1500. 39± 58. 92) 、 癫痫组大鼠 (CA 1�CA 3 区 330. 79± 20. 46; D G2016. 85± 70. 33) 比较有显著性差异 ( P = 0. 0281, P = 0. 0021) 。 rhEpo 处理组大鼠与癫痫组大鼠 CA 1�CA 3 区、 D G 相比较亦 ( ) 有显著性差异 P = 0. 0482, P = 0. 0367 。而且 , rhEpo 处 理 组 大 鼠 与 癫 痫 组 大 鼠 CA 1�CA 3 区、 DG 的 caspase 23 表达分别比对照组增加 74% 和 534% , 42% 和 272% ; rhEpo 处 理 组 大 鼠 CA 1�CA 3 区、 DG 的 caspase 23 表达分别比癫痫组减少 18% 和 26% 。 讨 论 本实验结果提示 Epo 可能在控制 SE 方面有一定 的效果, 我们也首次通过大鼠体内实验证明了 Epo 可 经活化 casp ase 23 后的抗凋亡通路发挥神经保护作用 , 减少 S E 诱发的海马神经元凋亡。 S E 是神经科的急症 , 无论是人类的 S E 还是各种 动物的S E 模型均会导致明显的脑损伤 , 增加以后痫性
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陕西医学杂志 2008 年 8 月来自 37 卷第 8 期促红细胞生成素预处理对锂2匹罗卡品诱导的癫痫 持续状态大鼠海马神经元凋亡的影响
西安体育学院医学教研室 ( 西安 710068) 温晓妮 摘 要 目的: 探讨重组人促红细胞生成素 ( rhEpo ) 预处理对癫痫持续状态 ( SE ) 大鼠海马 神经元凋亡的影响。 方法: 应用免疫组化法观察 Epo 预处理后 SE 大鼠海马 ca spa se23 的表达情 况。结果: rhEpo 处理组大鼠CA 1�CA 3 区、 齿状回 (D G ) 的 ca spa se23 免疫阳性细胞的表达分别比 癫痫组减少 18% 和 26% , 二者有显著性差异 (P < 0. 05) 。 结论: 腹腔注射 Epo 可减少 SE 大鼠海 马神经元 ca spase 23 表达 , 表明 Epo 对 SE 大鼠海马可经抗凋亡通路发挥神经保护作用。 主题词 癫痫持续状态�病理生理学 红细胞生成素, 重组 海马 神经元 细胞凋亡 癫痫持续状态 ( S tat us ep ilep t icus, SE ) 是神经科 的急症, 病死率为 10%～ 12% 。在一百年前 SE 后的选 择性神经元丢失首先被报道 , 这种急性病理损害显示 有 “缺血细胞样改变” , 推测该变化是通过缺血2缺氧而 [1] 导致的 。 研究发现, 促红细胞生 成素 (Epo ) 在中枢神经系 统中有神经保护作用[ 2 ], 在本研究中, 我们在腹腔注射 匹罗卡品前 4h 予以 Epo 处理 , 检测了 SE 后 1h 海马神 经元凋亡的程度和大鼠的痫性活动。 并选择了介导海 马神经元凋亡的蛋白 2活化的半胱氨酸基天冬氨酸特 异性蛋白酶 23 ( ca spa se 23 ) 作为研究对象 , 从而 为 Epo 通过抑制活化的 casp ase 23 而减少海马神经元凋亡提 供证据。 材料与方法 1 材 料 1. 1 实验动物: 雄性 SD 大鼠 26 只 , 体重 180 ～ 200g, 由第四军医大学实验动物中心提供。 饲养于12～ 12h ( 8: 00220: 00) 光暗环境, 给予标准饲料及饮水。 1. 2 主要试剂: 盐酸匹罗卡品、 生物素化的山羊 抗兔 IgG、 生物素 2卵白素2 HR P 复合物 均购自 S igm a 公司 , 兔抗 casp ase 23 抗体购自武汉博士德生物公司 , 氯化锂购自中国医药集团上海试剂公司。 重组人促红 细 胞 生 成 素 ( recom binant hum an E ry thropoie t in, rhEpo ) 由第四军医大学西京医院提供。 1. 3 主 要 仪 器: 恒 冷 冰冻 切 片 机 ( 美 国 ) , 光 镜 (A X 260, O lym pus 公司 ) 。 2 方 法 2 . 1 Epo 的给药方法与锂 2匹罗卡品癫痫模型制 作: 造模大鼠先腹腔注射新鲜配制的氯化锂 , 剂量为 3m E q�kg; 16h 后腹腔注射 rhEpo ( 10 U �g ) , 20h 后腹 腔注射盐酸匹罗卡品, 剂量为 30mg �kg。 对照组大鼠注 射等量的生理盐水。 2. 2 实验动物 分组: rhEpo 预处理组 ( rhEpo + EP group ) 10 只, 均 先腹 腔注 射新 鲜配 制的 氯化 锂 ( 3m Eq�kg ) , 16h 后腹腔注射 rhEpo ( 10U �g) , 20h 后 腹 腔注 射盐 酸匹 罗卡 品 ( 为 30m g�kg ) ; 癫痫 组 ( EP g roup ) 10 只 , 均 先 腹 腔 注 射 新 鲜 配 制 的 氯 化 锂 ( 3m Eq �kg) , 16h 后腹腔注射等量生理盐水, 20h 后腹 腔注射盐酸 匹罗卡品 ( 为 30m g�kg ) ; 对照组 ( cont ro l g roup ) 6 只 , 均注射等量生理盐水。 2. 3 模型大鼠的行为学观察: 所有动物在造模后 观察 1h30m in, 痫性发作行为观察参照 R acine 分级标 准[ 3 ]: 0 级: 无任何反应; I 级: 面肌抽搐并出现咀嚼运 动, 偶尔的 “湿狗样动作” ; � 级: 出现点头运动, 一侧前 肢阵挛, 频繁的 “湿狗样动作” ; � 级: 双侧前肢阵挛, 流 涎, 站立; � 级: 全身阵挛, 失去平衡, 跌倒; � 级: 痫性 发作持续。 2. 4 标本制备: 在匹罗卡品或生理盐水处理后 , 所有动物均在 SE 后 1h 以戊巴比妥 ( 50 m g �kg) 深麻 醉, 先经升主动脉灌注生理盐水 100m l, 4% 多聚甲醛 液 (pH 7. 4 ) 快速灌注 200m l 后, 再慢速灌注 300m l。 取 脑后 , 将脑组织入 4% 多聚甲醛后固定过夜 , 再入 20% 蔗糖4 ℃冰箱沉底。 选择背侧海马部位应用恒冷冰冻切 片 机冠状位连续切片, 脑片漂片厚 30Λ m , 行免疫细胞 化学染色者收集于 0. 01M KPB S 中 , 余置于 60% 甘油 冻存液中 220℃保存备用。 2. 5 casp ase 23 免疫细胞化学染色: 取切片入 0. 01M KPB S 漂洗 3 次, 每次 10 m in, 入 0. 3% H 2O 2 的甲 醇溶液灭活内源性过氧化物酶。 浸入含 0 . 3% T r iton X 2100 的 0 . 01 M K PB S 30m in , 之后入兔抗 ca spa se23 抗体 ( 1∶ 400) 4℃孵育 48h , 再依次入生物素化的山羊 抗兔 Ig G ( 1 ∶5 00) 室温 2h、 生物素 2卵白素 2 H R P 复合