原代海马神经元细胞培养
胎鼠海马神经元体外原代培养与鉴定
胎鼠海马神经元体外原代培养与鉴定【关键词】胎鼠海马神经元；体外原代培养；鉴定doi：10.3969/j.issn.1004-7484（x）.2013.06.568 文章编号：1004-7484（2013）-06-3323-02在神经生物学及相关学科领域中，原代培养的神经元因其排除机体生理病理状态干扰的影响而成为较为理想的实验模型，是研究神经元形态、物质代谢、分子机制及电活动的主要前提。
海马是大脑边缘系统重要的组成部分，在学习、记忆、情绪反应及中枢神经系统疾病的病理生理变化方面发挥着重要作用。
对于原代海马神经元的培养，主要供体主要有胎鼠与新生鼠两种，培养方法有含血清培养和不含血清培养两种。
我们通过实验摸索，取得一种较稳定且简便实用的方法，能获得较高存活率的海马神经元。
1 材料与方法1.1 实验动物来源清洁级孕17-19天sd大鼠上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，生产许可证号：scxk（沪）2012-0002。
1.2 主要仪器与试剂 co2培养箱（thermo公司），倒置相差显微镜为（olympus公司），激光共聚焦显微镜型号为zeiss lsm710，小鼠抗大鼠classⅲβ-tubulin单抗（beyotime公司），nse免疫组化染色试剂盒、dab显色试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司），b27添加剂、neuralbasal、hoechst 33342sigma公司），dmem（高糖型）培养基、胎牛血清（gibco公司）。
1.3 培养方法与鉴定取孕17-19天大鼠，水合氯醛麻醉后70%酒精浸泡20min，颈椎脱臼法处死孕鼠，将子宫立即放入冰浴含dmem 的大平皿中，在解剖显微镜下取下海马组织，剪成约1mm×1mm×1mm 大小，用0.125%胰蛋白酶于37℃、5%co2培养箱中消化15min，中间每隔5min振荡一次，加入含10%fbs的dmem液终止消化，巴氏管轻柔吹打，200目筛网过滤。
神经细胞的培养
海马神经元的培养总结1.新生大鼠海马常规取法：断头，线剪剪去皮肤，组织剪从椎管纵向剪开颅骨，再颅顶横向剪一刀。
暴露两侧大脑半球，用小弯镊翻出大脑，延纵裂分别向两侧翻开大脑半球，在底部可见新月形的海马，用眼科镊取出置于冰浴的盐溶液中，在解剖镜下剥离周围组织和血管膜。
2.培养基：我用的接种培养基是DMEM/F12+10的胎牛血清＋胰岛素＋葡萄糖＋谷胺酰胺，维持培养基里就是多加了5uM的阿糖胞苷。
培养液的pH调至6.8—7.4可，最好不要调至7.4或高。
一般在培养液放置两周后，加入终浓度为2mM的谷氨酰胺3.胰酶：酶用0.125的。
其实一次性消化比较简单，关键是消化时间不要太长，不知你用多长时间，一般是15-20分。
4.多聚赖氨酸的配置：可以用去离子水配, 也可以用D-HANKS也配(我用的配方),或者PBS 效果都差不多. 一般先配成1mg/ml的母液, 用高压过的滤器过滤,最好分装以后放在-20度, 用的时候再稀释至0.01mg/ml.5.铺板：我的办法是将盖玻片直接经泡酸后要反复的洗干净，用单蒸后用双蒸水。
后放在75％的酒精中浸泡半个小时以上，在超净台中取出后用酒精灯烧一下，注意不要太久，以防破碎，后放在24或6孔板中，加入稀释好的多聚赖氨酸，室温放置3小时以上或过夜，切记不要照紫外，可以在上面覆盖东西。
结束后回收多聚赖氨酸，并用灭菌水或PBS等清洗三遍以上即可使用，我用的效果非常好。
6. 1. 盖玻片洗净之后, 需要泡酸过夜处理, 这样玻片会比较干净, 养原代背景会干净的多. 就算是新的也要洗(曾经有过教训).2.包被多聚赖氨酸用之前要用高压的去离子水洗3遍,再用D-HANKS过一遍.3. 多聚赖氨酸包被时,如果有条件可以放在4度振摇过夜,效果更佳.4. 神经元细胞种植之前1小时把种植培养基加进去,会提高细胞活力.7.纯化细胞方法：1.差速贴壁：接种前可将制备的细胞悬液放入底面积为75cm2的培养瓶中（未包被），然后放入37度，5%CO2培养箱中半小时，然后再过滤，转移至培养皿/瓶中。
神经元细胞培养步骤
海马神经元细胞培养一、实验前准备1.手术器械、培养皿、筛网的消毒2.多聚赖氨酸的配制3.培养板处理：（培养板中可加入小的圆形玻片，多次使用）(1)用多聚赖氨酸室温包被5min，随后吸取多余液体，晾干。
(2)用PBS洗一遍，吸取PBS后晾干备用。
4.胰酶的配制5.PBS的配制二、操作步骤1. 新生一天的小鼠，酒精喷洒全身，置于干净的培养皿中，用手术剪刀剪下头部，放入另外一个干净的培养皿中（五只）。
2.用干净镊子取出全脑放于（冰）的PBS的培养皿（10cm）中，置于解剖显微镜下。
3.移入解剖显微镜下，分离出皮层或海马组织，去除血点，移入盛有HOOD下的培养皿中。
4.将皮层或海马组织剪成1-3mm的小块，用0.25%，2ml胰酶-EDTA 消化，37ºC水浴消化30分钟，每消化10分钟振摇一下。
30分钟后，用移液枪吸取可见组织，放入离心管中，并加入与胰酶等体积的DMEM （HG）+10% FBS培养液终止消化，吹打20次左右，注意动作轻柔，不要吹打出气泡。
5.如果组织明显不能吹散或粘稠的话，过一下200目筛网。
过滤液DMEM，进入大离心管中。
离心800r，3min。
弃去上清，加入DMEM 培养液，分装在培养皿（6cm）中，放入含5% CO2 的37C恒温培养箱内培养。
6.6-8小时（或第二天）后换液，用PBS液先洗两遍，并上下左右摇晃10次左右，去除一些细胞碎片，随后培养液换成Neurobasal 培养液+B27（2%）+谷氨酰胺（0.5mM）（+双抗)继续培养，并且3天半换液一次。
7.到第八天时，将培养液换成新鲜Neurobasal无B27、谷氨酰胺、双抗，开始用于实验。
胎鼠、新生大鼠原代海马神经元培养及鉴定
胎鼠、新生大鼠原代海马神经元培养及鉴定熊丽娇;郭阗廷;曾治平;黄志华;曾靖【摘要】目的:建立胎鼠、新生鼠海马神经元体外培养方法.方法:分别取胎鼠、新生鼠海马,消化后种植,用含有2%B27的neurobasal培养液培养,第3天加入5 μmol·L-1的阿糖胞苷,换液后继续培养,以获得纯度较高的海马神经元.培养第3、7天观察细胞生长及突起情况,用neurofilament抗体以免疫荧光方法鉴定神经元细胞.结果:海马神经元种植24 h后贴壁,7天时神经元突起相互连接成网络.经neurofilament染色,培养细胞阳性率高,新生鼠原代培养海马神经元阳性率达(89±3.4)%,胎鼠海马神经元阳性率达(98±1.5)%.结论: 本方法培养出的胎鼠、新生大鼠海马神经元纯度较高,可作为海马神经元模型用于进一步研究.【期刊名称】《赣南医学院学报》【年(卷),期】2017(037)003【总页数】3页(P354-356)【关键词】海马神经元;细胞培养;胎鼠;新生鼠【作者】熊丽娇;郭阗廷;曾治平;黄志华;曾靖【作者单位】赣南医学院第一附属医院全科医学VIP科;赣南卫生健康职业教育学院外科教研室,江西赣州 341000;赣南医学院第一附属医院全科医学VIP科;赣南医学院;赣南医学院【正文语种】中文【中图分类】R285.5海马是大脑边缘系统重要部分，神经元分布高度集中，在认知、记忆、情绪、植物神经系统方面起着不可替代的作用[1-3]。
海马神经元体外培养模型已经成为研究神经元发育分化、神经疾病的发生机制的重要技术手段[4-6]。
海马神经元体外培养文献报道方法多样，动物来源主要有胎鼠和新生鼠，根据实验条件，我们摸索出了原代胎鼠、新生大鼠的海马神经元培养方法，并进行了细胞鉴定，获得了高纯度的胎鼠、新生大鼠海马神经元。
1.1 材料1.1.1 实验动物孕17天SD大鼠及出生24 h内的SD大鼠。
1.1.2 主要试剂 DMEM培养基、neurobasal培养基、胎牛血清(FBS)和B27培养基添加剂(Gibco公司)、青链霉素、胰酶、多聚L赖氨酸(sigma公司)。
海马细胞培养与鉴定
非特异性对照:用正常羊血清代替兔抗特异性烯醇化酶(NSE)多克隆抗体,其它实验步骤上。
阴性对照:用PBS代替兔抗特异性烯醇化酶( NSE )多克隆抗体,其它实验步骤同上。
纯度计算：高倍镜视野下，随机选取计数视野，计数100个细胞中阳性神经元的数目，重复5次后，计算均值。
吸去培养液用PBS液冲洗3遍
↓
质量分数为4%的多聚甲醛固定15 m in;
↓
0.01mol/LPBS液中洗15 m in;（5min×3次）
↓
质量分数为0.4%的Triton X-100湿盒反应40 m in;
↓
0.01mol/LPBS液中洗15 m in;（5min×3次）
↓
3%H2O2孵育15min,消除内源性的过氧化物酶
搅拌。
↓
(3)将待标记的抗体12.5mg用生理盐水稀释至5ml，搅拌下逐滴加入酶溶液中。
↓
(4)用1M PH9.5碳酸缓冲液0.25ml，继续搅拌3?小时。
↓
(5)加0.2M赖氨酸0.25ml，混匀后，置室温2小时。
↓
(6)在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4℃1小时。
↓
(7)3000rpm离心半小时，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于
或使用和一抗相同来源的血清(10%)进行封闭。另一方面，请注意选购经过适当吸附的二抗，以减小二抗的非特异性吸附。
b.在免疫组化时如果背景显色太深，需注意灭活内源性过氧化氢酶。可以在4体积甲醇中加入1体积3%过氧化氢，混匀后用于内源性过氧化氢酶的灭活。
c.可以考虑缩短显色时间，或降低二抗浓度。另外，选择适当强度的洗涤液，或延长洗涤时间也会有所帮助。
步骤：
大鼠海马神经元原代培养
汇报人：何克宇
S
实验要点
S 取活体细胞
S 令海马神经元贴壁生长
S 神经元培养液
实验材料
S 动物：大鼠胎鼠（15~20天）
S 试剂：多聚赖氨酸
解剖液（DMEM+PBS） 0.125%胰蛋白酶
S 培养液：①DMEM+F12+10%胎牛血清
②Neurobasal+2%b27+1%双抗
1. 胰蛋白酶（预暖）消化15min，3~5min震荡一次。
2. 静置2min，去上清，PBS洗两遍终止消化 3. 加入DMEM，吹打，取上清。重复3次。 4. 种板，培养液（DMEM+F12+10%胎牛血清），细
胞密度3.5*105/cm2
抗）
Thank You
实验步骤
1.器械灭菌 2.多聚赖氨酸（PLL）铺板
0.1mg/ml，包被30min，吸去多余PLL，
过夜晾干
实验步骤
1.孕鼠颈椎脱臼处死，取胎鼠 2.胎鼠断头，置于PBS，取全脑，置于解剖液（冷） 3.体视显微镜下沿中线分离半球，取海马，仔细分离血 管和膜性组织。（快、干净）
实验步骤
实验步骤
大鼠脑海马神经元原代培养方法的建立及其纯度的鉴定
ｋｎ ｓｏ ｎ ｙ ｓ ｔ ｎ ｅ ｔ ａ ｈ ｕ ｎ ｉ ｎ ｕ ｉ ｆｔ ｅ ｃ ｌ ｒ ｄ ｎ ｕ ｏ ｓ Ｒｅ ｕ ｔ ： Ｔ ｅ ｎ ｕ ｏ ｓ ｃ ｌ ｒ ｄ ｂ ｈ ｗ ｉ ｄ ｎ ｉ ｄ ｆｅ ｚ ｍｅ ｏ ｉｖ ｓｉ ｔｔｅ ｑ ａ ｔｔ ａ ｄ ｐ ｒ ｙ ｏ ｕ ｔ ｅ ｅ ｒｎ ． ｇ ｙ ｔ ｈ ｕ ｓ ｌｓ ｈ ｅ ｒ ｎ ｕｔ ｅ ｙ ｔ ｅ ｔ ｏ ｋ ｎ ｓ ｅ — ｕ
ｇ ｓｅ ｔ ａ ａ ｎ ｅ ｚ ｍｅ ａ ｄ ｃ ｌｕ ｅ ｔ ｅ ｒ ｂ ｓ ｌａ ｅ ｓａ ｉｉａ ｉｎ ａ ｄ ｓ ｆ ｔ Ｏ ｉ ｒａ ｅ ｔｅ ｑｕ ｎ ｉ ｎｄ ｐｕ ｉｙ ｏ ｅ ｏ ． ｅ ｔ ｄ ｗｉ ｐ ｐ ｉ ｎ ｙ ｎ ｕｔ ｒ ｄ ｗｉｈ ｎ ｕ ｏ ａ ａ ｒ ｔ ｂｌｚ ｔｏ ｎ ａｅｙ Ｓ ｎｃ ｅ ｓ ｈ ａ ｔｔ ａ ｒｔ ｆｎ ｕｒｎｓ ｈ ｙ
ｔ ｅＮ Ｙ ｅ ，Ｓ ｉ—ｉ ｇ ，Ｚ Ｎ ｏｇ ，ＺＨＡＮＧ ｎ —ｈｅ Ｅ ｕ Ｕ Ｑｕｘａ ＨＡ Ｇ Ｙ ｎ ｎ
（ ． Ａ ａｅ ｃＡｆ ｒ Ｄ ｓ ｎ ｈｎ ａｇＭｅ ｉ ｌ ｏｌ ｅ Ｓ ｅ ｙ ｎ １ ０ ４ ｈｎ ；２ ｅ ａｔ ｅ ｔ ｆＨ ｓ ｌ ｙａ ｄＥ ｒ ｌ ｙ １ ｃｄｍｉ ｆｉ Ｍ ｉ ，Ｓ ｅｙｎ ｄｃ ｌｇ ， ｈ ｎ ａ ｇ１ ０ ３ ，Ｃ ｉａ ．Ｄ ｐ ｒ ｎ ｉ ｏｏ ｎ ｍｂｙ ｏ ） ａｓ ｏ ａＣ ｅ ｍ ｏ ｔ ｇ ｏｇ
（ ．沈 阳医 学 院 教 务 处 ，辽 宁 沈 阳 １０ ３ １ １０ ４；２ 基 础 医学 院组 织 与 胚 胎 学 教 研 室 ） ．
［ 摘要 ］目的 ：为建立一种稳定的大鼠胎鼠海马神经元培养方法并能够有 效的鉴定其 纯度 。方法 ：分 离 Ｗｉａ大鼠胚胎 并 ｓ ｔ 取海马组织 ，比较 两种 常用酶 ，胰 酶和木瓜 酶消化效果对海马神经元产量的影响及 两种不 同培养方法对海马神 经元纯度 的
各类神经元细胞的培养方法
各类神经元细胞的培养方法神经元细胞是神经系统中的主要细胞类型之一，负责传递神经信息和调控神经功能。
神经元细胞的培养是神经科学研究和临床治疗的重要工具。
通过细胞培养，可以研究神经元的发育、功能和病理机制，同时也可以应用于药物筛选、组织工程和神经修复等领域。
下面将介绍一些常用的神经元细胞培养方法。
1.原代培养2.细胞系培养细胞系是已经建立起来的可持续增殖和培养的细胞株。
细胞系培养可以使用血清或无血清培养基。
通常，将细胞系继代传代，以保持其细胞特性和增殖能力。
细胞系培养可以持续扩大细胞数量，并用于大规模试验和应用，如药物筛选和基因表达研究等。
3.单细胞培养单细胞培养是将单个神经元细胞分离和培养。
首先，通过机械或酶消化方法将神经组织分散为单细胞悬浮液。
然后，通过单细胞分选技术，将单个神经元细胞分离并分配到各个培养孔中。
最后，单个细胞通过培养基提供的营养物和因子进行生长和分化。
单细胞培养是研究神经元个体特性、细胞发育和功能的重要手段。
4.同代培养同代培养是将同一类型的神经元细胞培养在同一培养物中，以形成功能连通的细胞群。
同代培养可以通过多孔膜培养皿、微流控芯片和三维支架等技术实现。
通过细胞之间的相互作用和联结，同代培养可以模拟神经系统的复杂性和功能，用于研究神经网络特性和神经系统发育。
5.共培养共培养是将不同类型的细胞培养在同一文化器皿中，以研究细胞之间的相互作用和信号传递。
常见的共培养方法包括胶质细胞和神经元细胞的共培养，以及神经元细胞和非神经元细胞的共培养。
共培养可以提供更接近体内情况的环境，用于研究细胞间相互作用和细胞发育过程。
原代海马神经元细胞培养
原代海马神经元细胞培养-CAL-FENGHAI.-(YICAI)-Company One1原代海马神经元细胞培养溶液的配制：(1) 4%多聚甲醛溶液：4g多聚甲醛溶于100ml pH=7.4的0.01mol/l PBS中，混匀过滤，室温保存。
(2)磷酸盐缓冲液（PBS）（0.01mol l-1）：KH2PO4，0.1g；Na2HPO412H2O，1.7g；KCl，0.1g；NaCl，4.0g，双蒸水加至500ml，pH=7.2～7.4。
用0.2m滤膜过滤，4℃保存。
(3) 1%蛋白酶的配制：用磷酸缓冲液（pH=7.2～7.4）配制成浓度为1%的胰蛋白酶母液冻存。
使用时，用解剖液稀释至0.25%。
(4) 培养皿涂被多聚赖氨酸：配制0.01%的多聚赖氨酸，分装冻存。
将上述多聚赖氨酸放入培养皿中涂两遍，自然晾干后备用。
(5) 解剖液：葡萄糖，3.0g；蔗糖，7.5g；NaCl，8.0g；KCl，0.4g；Na2HP047H20，0.18g；KH2PO4，0.03g；HEPES，2.14g；加双蒸水1000ml，调pH=7.0～7.4，过滤，4℃保存。
(6) 种植液：DMEM 79%，胎牛血清，10%；马血清，10%；谷氨酰胺培养液1%。
(7) 饲养液：Neurobasal培养基，97%；谷氨酰胺培养液，1%；B-27，2%。
(8) 阿糖胞苷：用双蒸水配制成浓度为l mg ml-1的母液储存。
用0.2m 滤膜过滤，-20℃储存。
使用时，取6l母液加入2ml培养液中，终浓度为3g ml-1。
（根据实验情况调整浓度）大鼠原代海马神经元细胞的培养(1) 新生SD大鼠（＜12h），75%酒精浸泡消毒后断头，剥离出全脑并将其放入盛有解剖液的培养皿中。
(2) 在解剖液中解剖大脑，分离出海马，移入另一盛有解剖液的培养皿中。
在分离出全部的海马后，去除血管等组织，然后用剪刀将海马分成数小块，放入盛有0.25%胰蛋白酶的培养皿中，将培养皿放入9%CO2、37℃消化20min。
SD大鼠海马神经元原代培养及形态学观察
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ Ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ ｎｅｕｒｏｎ；Ｐｆｉｍａ￣ ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ；ＨＥ ｓｔａｉｎｉｎｇ
海 马锥 体神 经元 是 海 马 区的 主要 成分 ，主 要功 能 是参 与近 期 记 忆 、情 绪 及 内脏 功 能 调 节 ，是 老 年 性 痴 呆、癫痫等疾病 的主要病变部位¨Ｉ２ Ｊ。原代培养神经 元能建 立一 个很好 的体 外 神 经元 活 动 实验 模 型 ，具 有 影响因素单一、机体干扰因素少和结果易分析等优点。 从 细胞 和分 子 水 平 上 深 入研 究 海 马神 经 元 的 物 质 代 谢 、生理 、药理 及形 态 特 征 ，海 马神 经 元 原代 培 养 是一 个 必不 可少 的前提 条件 Ｊ。 １ 材料 与方 法 １．１ 试剂 胰 蛋 白酶 （Ｓｉｇｍａ）、Ｂ２７、胎 牛 血清 （ＰＡＡ）、 Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（Ｇｉｂｏｃｏ）。小 鼠抗大 鼠 ＭＡＰ一２单 克 隆抗体
Ｎｉｓｓｌ ｂｏｄｉｅｄ ｗｅｒｅ ｉｎ ｔｈｅ ｃｙｔｏｐｌａｓｍ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｎｅｕｒｏｎｓ ａｒｅ ｄｉｖｅｒｓｉｆｉｅｄ，ａｎｄ ａｒｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｉｎ ＭＡＰ一２，ａｓ ｗｅｌｌ ａｓ ＮＳＥ ｓｔａｉｎｉｎｇ．
Ｆｏｒ ＨＥ ｓｔａｉｎｉｎｇ，ｎｕｃｌｅｕｓ ａｎｄ ｃｙｔｏｐｌａｓｍ ａｒｅ ｂｌｕｅ ａｎｄ ｒｅｄ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｎｉｓｓｌｅ ｂｏｄｉｅｓ ａｒｅ ｉｎ ｃｙｔｏｐｌａｓｍ ａｎｄ ｓｅｌｄｏｍ ｉｎ Ｎｅｕｒ ｉｔｅ．
ｂｏｄｉｅｓ ｗｅｒｅ ｔｒ ｉａｎ￣ｅ，ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓ ａｎｄ ｅｌｌｉｐｓｅ ｓｈａｐｅ．Ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｂｒｏｗｎ ｉｎ ＭＡＰ－２ ａｎｄ ＮＳＥ ｓｔａｉｎｉｎｇ．Ｔｈ ｅ ｐｕｒｉｔｙ ｄｅｇｒｅｅ ｏｆ ｎｅｕｒｏｎｓ
世界上最完善最详细的神经元原代培养完全黄金版资料
世界上最完善最详细的神经元原代培养完全黄金版[精华]序言：国内外关于原代培养有很多文献，不幸的是，没有一篇是详细的，没有一篇解答过why. 为了让大家少走弯路，根据我杀过3000只老鼠的经验，我把我这几年摸索的经验和大家分享，请求多投几票得几个叮当。
相信你follow我的这篇文章一定会做的很好。
我的标题说的很像吹牛，但是我是严肃认真的说的，I earn it.note:这篇文章全是我个人的经验，99。
9%原创，经过无数失败的到的最完美的原代神经元培养法，除了最后那一副图是来自下面第2行那篇文献，所以我才说是99.9%原创。
（注：附录的图是常用的消化酶对实验的存活率影响，来自下面链接里的文献）另外，成年鼠的原代培养我没有摸索过，推荐一篇文献在我以前的帖子（无需叮当）（/bbs/post/view?bid=156&id=17651341&sty=3）本篇专门讨论胎鼠和新生鼠神经元的原代培养。
1.材料选择。
一定要严格按照国际上，NCBI数据库，其他文献的材料一致。
胎鼠就要胎鼠，新生鼠就要新生鼠，不能混淆。
因为新生鼠有一些受体，在培养的工作中失去功能，会不能再生，比如NMDA受体。
和文献不同会导致错误结论，甚至困惑。
很多人写信问我新生鼠的培养问题，我回答用新生鼠的实验很少，八成是你自己搞错了实验对象，请确认国际上的相关研究文献所用老鼠，再来问我下面的问题。
2，培养基选择（neurbasal/neurobasal-a,invitrogen Co.ltd)。
我强烈不建议用血清培养。
原因是：首先，血清刺激胶质细胞和杂细胞分裂，最后非常影响神经元产量；其次，为了抑制胶质生长，往往要加入阿糖孢苷。
严重的毒性会影响许多灵敏实验；再次，最重要的，血清培养的细胞状态很不均一，从正常到凋亡都有，严重影响试验准确，而无血清专用培养基所有的正常细胞都处于一样的状态，要么都好，要么都差，高度一致。
Invitrogen/GIBCO 无血清培养基neurobasal(neurbasal-A)被认为是最标准，最好的培养基。
原代海马及皮质神经元培养方法
原代海马及皮质神经元培养实验材料：18-20天孕鼠一只,细胞培养板若干实验试剂：细胞培养基（DMEM+10%FBS+1%HEPES+0.2%PSA）,FBS,HBSS,胰酶，10ug/ml Poly-D-Lysine，灭菌超纯水实验器械：显微手术器械一套（直镊，弯镊和显微剪各一把），动物手术器械（中号镊子2把，直剪两把），小号细菌培养皿两个，250ml灭菌烧杯两个，灭菌玻璃吸管，胶头，5ml或10ml灭菌EP管实验步骤：1、实验准备：灭菌消毒，将实验所需手术器械浸泡70%酒精30min，高压灭菌超纯水与250ml烧杯。
2、Poly-D-Lysine铺板，铺板时间5-30min，然后灭菌超纯水洗两次。
3、麻醉18-20天孕鼠（10%水合氯醛腹腔注射3-4ml/kg,一般注射1.5ml），取胚胎，置于灭菌烧杯，以薄膜手套封盖，送至细胞房。
4、剪头，取脑，置于盛有HBSS的细菌培养皿。
5、剥离海马及皮质，置于HBSS中。
6、剥去血管，用镊子撕碎，吸至5mlEP管。
7、加HBSS冲洗干净后，加胰酶（胰酶体积视细胞量而定，一般10X胰酶比例为1：10），置37℃ CO2培养箱消化10min（8min）。
8、吸去胰酶，加FBS（约为总体积的20%）终止消化反应1.5-2min。
9、吸去FBS，加HBSS，反复吹打直至细胞分散均匀（无明显团块及组织碎块，以吹至成乳白色混悬液为宜）。
10、吹打均匀后细胞计数。
11、低速离心机800r/min离心10min。
12、吸去上清，加细胞培养基，吹散均匀，种于细胞培养板（一般6孔板种1*106/孔，依此类推，若需转染则适当加大细胞量）。
13、置于CO2培养箱孵育。
原代培养海马神经元成熟过程中PSD95与GluA2的分布
网络出版时间：２０２１－５－２８１０：１２ 网络出版地址：ｈｔｔｐｓ：／／ｋｎｓ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｅｔａｉｌ／３４．１０８６．Ｒ．２０２１０５２７．１４５８．０３０．ｈｔｍｌ原代培养海马神经元成熟过程中ＰＳＤ９５与ＧｌｕＡ２的分布颜颖慧，杨梦婕，王 梅，杜 娆，朱增燕（苏州大学附属儿童医院，江苏苏州 ２１５０００）收稿日期：２０２１－０２－０２，修回日期：２０２１－０３－２７基金项目：国家自然科学基金青年项目（Ｎｏ８１７０３４７８）作者简介：颜颖慧（１９８８－），女，硕士，主管药师，研究方向：神经药理，Ｅ ｍａｉｌ：ｙａｎｙｉｎｇｈｕｉ７２２＠１６３．ｃｏｍ；朱增燕（１９７６－），女，博士，主任药师，研究方向：心血管药理，Ｅ ｍａｉｌ：ｚｈｕｚｅｎｇｙａｎ７６７６＠ｓｕｄａ．ｅｄｕ．ｃｎｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００１－１９７８．２０２１．０６．０１６文献标志码：Ａ文章编号：１００１－１９７８（２０２１）０６－０８２８－０５中国图书分类号：Ｒ ３３２；Ｒ３２２．８１；Ｒ３４１；Ｒ３３８．１３；Ｒ３９２．１１；Ｒ９７７．６摘要：目的 探讨体外培养大鼠海马神经元成熟过程中突触后致密蛋白 ９５（ｐｏｓｔｓｙｎａｐｔｉｃｄｅｎｓｉｔｙ ９５，ＰＳＤ９５）与α 氨基 ３ 羟基 ５ 甲基 ４ 异恶唑（α ａｍｉｎｏ ３ ｈｙｄｒｏｘｙｌ ５ ｍｅｔｈｙｌ ４ ｉｓｏｘ ａｚｏｌｅ ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ，ＡＭＰＡ）受体亚基ＧｌｕＡ２的分布情况。
方法 采用原代大鼠海马神经元分别培养至４（ｄａｙｓｉｎｖｉｔｒｏ，ＤＩＶ）、７ＤＩＶ、１４ＤＩＶ及２０ＤＩＶ，通过细胞免疫荧光实验标记神经元内ＰＳＤ９５和ＧｌｕＡ２，由激光共聚焦显微镜在６０倍下拍摄记录，并进行共定位分析。
结果 随着神经元的成熟，ＰＳＤ９５逐渐呈点状密集分布于树突和树突棘；ＧｌｕＡ２则在胞体、轴突、树突及树突棘均匀分布；４ＤＩＶ和７ＤＩＶ神经元树突部位ＰＳＤ９５与ＧｌｕＡ２的Ｐｅａｒｓｏｎ相关系数分别为０ ８３０±０ ０３３和０ ７３４±０ ０１９，显示强烈的共定位；而在１４ＤＩＶ和２０ＤＩＶ二者的Ｐｅａｒｓｏｎ相关系数则为０ ５４７±０ ０２１和０ ５７４±０ ０２４，呈现中等程度相关。
新生大鼠海马神经元的原代培养方法
维普资讯
３ Ｏ பைடு நூலகம்９
第３ ６卷 第 ５期 ２０ ０２年 １ ０月
哈尔滨医科大学学报
Ｊ ＯＵＲＮＡＬＯＦＨＡＲ Ｎ 艇 ＤＩ ＢＩ ＣＡＬ ＵＮ ＶＥＲ １ Ｉ ＳＴＹ
Ｖｏ ． ６． １ ３ Ｎｏ． ５ Ｏｃ ． ｔ．
新 生 大 鼠海 马神 经 元 的原 代 培 养 方 法
用膜 片钳全细胞记 录方法观察培养 好的神经元 电生理学 特性 。结果 培养 的神经元胞体清 晰 ， 晕光 明显 ， 达了多 表 种 电／ － ￣ｆ 控和化学 门控离子通道 。 结论 Ｊ 本实验方 法简单 、 可靠 ， 保持 了神经元结 构和功能特性 。
［ 关键词 】 海 马 ； 原代培养方 法 ； 子通道 离 ［ 中图分 类号】 ４１ Ｑ２ ［ 文献标识码 】 Ａ ［ 文章编 号】１ ０ １０（ ０ ） — ３０ ０ ０ — ９５２ ２０ ０９ — ２ ０ ０ ５
ｕ ｅ ａ ｕｎ ｔ ｈ ｒ ｃｅ ｓ ｔ ｒ ｄ ｆ ｃ． ｎ ｃ ａ ａ ｔｒ ． ｎ ｉ ｏ Ｋｅ ｒ ：ｈ ｐ ｏ ａ ｕ ， ｒｍａ ｙ ｃ ｌ ｒ ｔ ｄ，ｏ ｈ ｎ ｌ ｙ ｗｏ ｄｓ ｉ ｐ ｅ ｍｐ ｓ ｐ ｉ ｒ ｕ ｔ ｅ ｍｅｈｏ ｉｎ ｃ ａ ｎｅ ｕ 、
ｔ ｒ ．Ｒｅ ｕ ｔ Ｃ ｌ ｖ ｔｄ ｎ ｕ ｏ ｓ ｗ ｒ ｌａ ｄ ｅ ｐ ｅ ｓ ｄ ｄ ｆ ｒｎ ｏｔｇ － ａｅ ｄ ｃ ｅ ｃ ｌ ｇ ｔｄ ｉｎ ｕｅ ｓｌ ｓ ｕ ｔ ａｅ ｅ ＿ ｎ ｅ ｃｅ ｒ ａ ｘ ｒｓｅ ｉ ｅ ｔ ｖ ｌ ｅ ｇ ｔｄ ａ ｈ ｍｉａ ａｅ ｏ ｉ ｒ ｅ ｎ ｅ ａ ｎ ｃ ａ ｎ ｌ ． ｎ ｌ ｓｏ Ｔ ｅ ｍｅ ｈ ｄ ｗｅ ｉｔ ｄ ｃ ｅ ｅ ｉ ｓ ｌ ｄ ｔ ｓ ｂ ｅ Ｎ ｕ ｏ ｓｋ ｐ ｈ ｏ ｄ ｓ ｕ — ｈ ｎ ｅｓ Ｃｏ ｃｕ ｉｎ ｈ ｔｏ ｒ ｕ ｅ ｈ ｒ ｓ ｉ ｅ ａ ｕ ｔ ｌ ． ｅ ｒ ｎ ｅ ｔｔｅ ｎ ｍｕ ｔ ｃ ｎ ｏ ｍｐ ｎ ｒ ａ ｒ
原代海马及皮质神经元培养方法
原代海马及皮质神经元培养方法海马和皮质神经元是神经系统的重要组成部分，在研究神经生物学和药物疗效等方面具有重要价值。
为了研究这些神经元的生理特性和功能，我们常常需要从动物体内分离和培养这些神经元。
以下是针对原代海马和皮质神经元的培养方法。
1.实验动物准备：首先，需要准备实验所需的动物。
一般情况下，小鼠是最常用的实验动物。
在实验进行前，需要确保动物符合实验伦理和动物保护要求，并获得相应的实验动物使用许可。
2.动物脑组织的获取：在实验动物处死后，需要尽快取出脑组织。
使用无菌技术将大脑取出，并将其放入生理盐水或培养基中。
3.脑组织的分离和消化：将脑组织放入含有0.02％的溴酚红的磷酸缓冲生理盐水中，用无菌剪刀和镊子将其剪碎成小块。
然后，将组织块放入含有0.25％胰酶的溶液中，在37℃的恒温培养箱中消化2至5分钟。
然后，将溶液过滤并离心，以去除细胞碎片和大块组织。
4.细胞的分离和培养：将离心沉淀涂布在含有25％培养基和10％胎牛血清的培养皿中，然后放入37℃的恒温培养箱中。
培养基的成分可以根据具体需要进行调整。
细胞会附着在培养皿上，并开始生长和繁殖。
在细胞培养过程中，需要定期更换培养基，以提供细胞所需的营养物质。
5.细胞的处理和分选：在培养4至7天后，细胞会形成较为密集的神经元网络。
在这个时候，可以通过处理和分选细胞来提高神经元的纯度。
例如，使用抗体标记法可以针对神经元选择性地杀死胶质细胞。
此外，还可以使用细胞遗传方法，如转染特定基因或使用荧光探针标记细胞。
6.测试和分析：经过特定时间的培养后，可以对原代海马和皮质神经元进行测试和分析。
这些测试和分析可以包括细胞生存率、纯度、形态特征、电生理活性、细胞内信号和细胞功能等方面的内容。
这些测试和分析的方法可以通过显微镜观察、电生理仪器、蛋白质和基因分析等手段进行。
7.特殊处理：有时对于特定的研究需要，还可以对原代海马和皮质神经元进行特殊处理。
例如，可以通过给予特定药物、激素或其他刺激条件，来模拟不同的疾病模型或研究特定功能。
原代海马神经细胞体外培养的纯化与鉴定
第４ ４卷
３２ ２
第 ４期
哈尔滨医科 大学学报
Ｊ ０ＵＲＮＡＬ ＯＦ ＨＡＲＢ Ｎ ＭＥＤ ＣＡＬ ＵＮＩ Ｉ Ｉ ＶＥＲＳ ＩＹ Ｉ
Ｖｏ ． ４， ． １ ４ Ｎｏ ４ Ａｕ ．，２ １ ｇ ００
２１ ０ ０年 ８月
原代 海 马 神 经 细胞 体 外 培养 的纯 化 与鉴定
在体外采用含血清结合无血清法进行培养 ， 并用 Ｎ Ｅ Ｇ Ｐ４ 、 Ｐ Ｓ 、 Ａ －３ ＭＡ ２等海马神经 细胞 特异抗体经 免疫细胞化学 方
法鉴定细胞性质及纯度。结果 度达 ９ ％以上。结论 ６ 至第 ７ ・ ８天神经元形态最为成熟饱满 ， 随后逐渐 出现 细胞 老化 ， 神经元 最长可 生存 ４周 。经鉴 定 ， 马神经元 纯 海 体外采用含血清和无血清法相结合进行原代 海马神经细胞 培养 ， 细胞纯度高 ， 杂细胞少 ， 可 为神经疾病体外研究提供 必要 细胞基础 。
ｍａ ｕｔｒ ｆ ｉｐ ｃ ｍｐ ｌ ｅ ｒｎ ｉ ｅｕ ｍｅ ｉｍ ｎ ｅｕ ｆｅ ｄｕ ｉ ｉ ｏｉ ｗ ｔ ｉｈ ｐ — ｙ ｒ ｃ ｌ ｅｏ ｐ ｏ ａ ａ ｕｏ ｓｗ ｔ ｓ ｒｍ ｄｕ ａ ｄ ｓｒ ｍ— ｅｍｅ ｉｍ ｎｖｔ ｓ ｉ ｈｇ ｕ ｕ ｈ ｎ ｈ ｒ ｒ ｈ
Ｌ Ｕ ｎ，ＺＨＡＮＧ — ａ，ＺＨＡＮＧ ｎ— Ｉ Ｘｉ Ｙｉｎ Ｙｕ ｈｅ，ｅ ｌ ｔａ
（ ｅａｔｅ ｔｆＧｒ ｔｃ，Ｔ ｅ ｅｏ ｄＣｉｉ ｌ ｏｌ ｅ Ｈ ｒｉ Ｄｐ ｒ ｎ ｏ ｅｉ ｒｓ ｈ ｃｎ ｌ ｃ ｌｇ ， ａｂ ｍ ａｉ Ｓ ｎａ Ｃ ｅ ｎ
乳鼠海马神经细胞的原代培养以及冻存复苏方法
【 中图分类号１ ６ ３ Ｒ３ １．
【 文献标识码Ｉ 【 ９２０）４ ０ ０－ ３
的海 马较胎 鼠好 定位 ， 易取 材 ， 多 采用乳 鼠海 马作为 故
海 马神 经元作为边缘 系统 的重要组 成部分 ， 在结构
上具有高 度序化 板层结 构和神 经元相对 独立分布 等特 点， 因而成为理 想的神经 科学研 究模型…。 鼠类出生时的
１． 统 计 分析 采 用 Ｓ Ｓ ｌ ． 统 计 软 件 ， 凇 验 进 ３ Ｐ Ｓ １０ 以 行统 计处 理 。
接 受训练的身体 部位在皮层 的支配 区域 也会扩大 。 传导 兴奋 的神 经 回路的传递 效 率明显 提高 ， 反之 ， 意运动 随 训练 减少 ， 动功能恢 复的可能性 降低…。 运 因此 ， 复训 康 练 有利于新的神经 回路和正 常运动程序 的建立 。 也就 是 说， 采取积 极的 康复护 理 ， 可促 进相关 神经 细胞 的轴突 发芽 ， 成新的突触 ， 形 通过 反复训练 ， 使这些突触建立起 接近 正常功 能的新 的神 经网络 ， 实现 中枢神 经功能重新 组合， 同时抑 制异 常的 低位 中枢 控 制的运 动 ， 其突 触 使 链处 于受抑 制的多阂值状 态 ， 而改善患侧肢体 的功能 从 】 对 急性 脑血 管病病人 的康 复有积极 的意义 。 但对于还 没有度过脑血管病 急性期 （ 发病 １ 约 周内． ） 的病人 康复护理应 十分慎重 ， 因为处在 急性 期 的脑血 管 壁脆 性高 ， 发病 部位 尚未形 成牢 固而稳 定 的血栓栓 塞 ， 盲 目的超早 康复护 理可 能引起 梗死 后再 灌 损 伤及 出 血 后 的再 出血 等。
实验研 究对 象＿。 ２ 出生 １ ２ 的大鼠数量很难掌握 ， 】 －ｄ 做实验 时有时得到 的细胞会 多于计划量 有时会少于计 划量 ， 这
世界上最完善最详细的神经元原代培养完全黄金版讲解
世界上最完善最详细的神经元原代培养完全黄金版[精华]序言：国内外关于原代培养有很多文献，不幸的是，没有一篇是详细的，没有一篇解答过why. 为了让大家少走弯路，根据我杀过3000只老鼠的经验，我把我这几年摸索的经验和大家分享，请求多投几票得几个叮当。
相信你follow我的这篇文章一定会做的很好。
我的标题说的很像吹牛，但是我是严肃认真的说的，I earn it.note:这篇文章全是我个人的经验，99。
9%原创，经过无数失败的到的最完美的原代神经元培养法，除了最后那一副图是来自下面第2行那篇文献，所以我才说是99.9%原创。
（注：附录的图是常用的消化酶对实验的存活率影响，来自下面链接里的文献）另外，成年鼠的原代培养我没有摸索过，推荐一篇文献在我以前的帖子（无需叮当）（/bbs/post/view?bid=156&id=17651341&sty=3）本篇专门讨论胎鼠和新生鼠神经元的原代培养。
1.材料选择。
一定要严格按照国际上，NCBI数据库，其他文献的材料一致。
胎鼠就要胎鼠，新生鼠就要新生鼠，不能混淆。
因为新生鼠有一些受体，在培养的工作中失去功能，会不能再生，比如NMDA受体。
和文献不同会导致错误结论，甚至困惑。
很多人写信问我新生鼠的培养问题，我回答用新生鼠的实验很少，八成是你自己搞错了实验对象，请确认国际上的相关研究文献所用老鼠，再来问我下面的问题。
2，培养基选择（neurbasal/neurobasal-a,invitrogen Co.ltd)。
我强烈不建议用血清培养。
原因是：首先，血清刺激胶质细胞和杂细胞分裂，最后非常影响神经元产量；其次，为了抑制胶质生长，往往要加入阿糖孢苷。
严重的毒性会影响许多灵敏实验；再次，最重要的，血清培养的细胞状态很不均一，从正常到凋亡都有，严重影响试验准确，而无血清专用培养基所有的正常细胞都处于一样的状态，要么都好，要么都差，高度一致。
Invitrogen/GIBCO 无血清培养基neurobasal(neurbasal-A)被认为是最标准，最好的培养基。
原代细胞分离培养鉴定4(SD 大鼠骨骼肌卫星细胞、海马神经元细胞)
骨骼肌
由骨胳肌细胞构成的一种肌组
b
织，是横纹肌的一种。大多数
骨胳肌都附着于骨上，是体内
数量最多的组织，在人体中占
体重的40%。
a
骨骼肌卫星细胞
肌卫星细胞指的是骨骼肌中除骨骼肌纤维（肌细胞）外的一种扁平、有突起的细 胞。是位于肌肉纤维膜和基底膜之间的一种单核细胞，是动物出生后的骨骼肌的生长 和再生的主要细胞来源。
IF：细胞核内 MAP2阳性表达（红色荧光）
MAP2在中枢神经系统神经元细胞体和树突特异 性表达，而在AS（星形胶质细胞）及少突胶质细 胞中不表达，是目前公认的神经元特异性标志物。
13
14
早期卫星细胞（分化据-SMA（Red） 均在胞浆中表14达，有强有弱。
8、SD大鼠海马神经元细胞的分离
目的与意义
神经元细胞原代培养是体外研究神经系统疾病的重要手段之一，也是对神经 系统损伤进行细胞分子水平研究的基础。因此，建立良好的神经元细胞体外培养 模型，对研究神经系统疾病，特别是在神经元发育、损伤和修复中的作用尤为重 要。海马是大脑边缘系统的重要组成部分，参与个体学习、记忆及情绪反应等多 种生理功能，与新生儿缺血性脑损伤及多种神经、精神疾病的发生密切相关。
快收缩肌的3-4倍）；
3、采用Ⅰ型胶原酶和胰蛋白酶二步消化法，卫星细胞位于肌束的浆膜和基底膜之间这种特殊位置使其能抵抗一般
消化酶的作用，Ⅰ型胶原酶只能消化肌束之间的连接，起到分离肌束的作用，而不能分离肌束上的卫星细胞，只有胰蛋白 酶才有此能力；
4、消化时间不宜过长，应控制在30min内，可以提高细胞存活率与贴壁率。采用胰蛋白酶分步消化 法，多次消化，及时收集消化下来的细胞，既可以保证肌组织的充分消化，又可以避免蛋白酶对 已消化下来的细胞的进一步损伤，以提高卫星细胞的活性；
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原代海马神经元细胞培养
溶液的配制：
(1) 4%多聚甲醛溶液：4g多聚甲醛溶于100ml pH=7.4的0.01mol/l PBS中，混匀过滤，
室温保存。
(2)磷酸盐缓冲液（PBS）（0.01mol⋅l-1）：KH2PO4，0.1g；Na2HPO4⋅12H2O，1.7g；KCl，
0.1g；NaCl，4.0g，双蒸水加至500ml，pH=7.2～7.4。
用0.2μm滤膜过滤，4℃保存。
(3) 1%蛋白酶的配制：用磷酸缓冲液（pH=7.2～7.4）配制成浓度为1%的胰蛋白酶母液
冻存。
使用时，用解剖液稀释至0.25%。
(4) 培养皿涂被多聚赖氨酸：配制0.01%的多聚赖氨酸，分装冻存。
将上述多聚赖氨酸
放入培养皿中涂两遍，自然晾干后备用。
(5) 解剖液：葡萄糖，3.0g；蔗糖，7.5g；NaCl，8.0g；KCl，0.4g；Na2HP04⋅7H20，0.18g；
KH2PO4，0.03g；HEPES，2.14g；加双蒸水1000ml，调pH=7.0～7.4，过滤，4℃保存。
(6) 种植液：DMEM 79%，胎牛血清，10%；马血清，10%；谷氨酰胺培养液1%。
(7) 饲养液：Neurobasal培养基，97%；谷氨酰胺培养液，1%；B-27，2%。
(8) 阿糖胞苷：用双蒸水配制成浓度为l mg⋅ml-1的母液储存。
用0.2μm滤膜过滤，-20℃
储存。
使用时，取6μl母液加入2ml培养液中，终浓度为3μg⋅ml-1。
（根据实验情况调整浓度）
大鼠原代海马神经元细胞的培养
(1) 新生SD大鼠（＜12h），75%酒精浸泡消毒后断头，剥离出全脑并将其放入盛有解
剖液的培养皿中。
(2) 在解剖液中解剖大脑，分离出海马，移入另一盛有解剖液的培养皿中。
在分离出全
部的海马后，去除血管等组织，然后用剪刀将海马分成数小块，放入盛有0.25%胰蛋白酶的培养皿中，将培养皿放入9%CO2、37℃消化20min。
(3) 将培养皿中的海马碎片移入离心管中，去除含胰蛋白酶的液体并用种植液将海马碎
片冲洗2～3遍，终止酶的消化作用。
(4) 在离心管中加入2ml的种植液，用口径递减的吹打管轻轻吹打海马碎片数次，将上
清液吸出备用，再加入2ml的种植液后，用吸管吹打数次，将上清液吸出备用，如此反复数次，至海马碎片全部被吹打散开。
（每次吹打10次，吹打时注意不要吹入空气，吹打尽量轻柔）
(5) 吸出的上清液再加入种植液调整其浓度，用200目细胞筛过滤。
(6) 将上述滤过的液体混匀后分装入已涂有0.1mg⋅ml-1多聚赖氨酸的96孔板上，使分
散的细胞计数约为0.3x106⋅ml-1。
然后将96孔板放入9%CO2，37℃细胞培养箱中培养。
(7) 12h后观察细胞，镜下可见多数细胞贴壁生长。
生理盐水冲洗细胞2遍以上以去除
细胞碎片然后换上已平衡好的饲养液。
(8) 培养36h后加入阿糖胞苷3μg⋅ml-1以抑制胶质细胞的分裂生长。
(9) 加入阿糖胞苷后12h换液。
以后每3d半量换液，饲养至7～14d可以进行实验。
(10) 或种板40min后，更换饲养液。
种板后12h，更换饲养液。
然后每3天半量换液。
注：第一种方法细胞纯度高，但对细胞损害较大，需要较高培养技术。
培养的细胞适用于MTT等实验。
第二种方法细胞纯度较高，对细胞损害较小，细胞状态好。
培养的细胞适用于膜片钳。