原代海马神经元细胞培养

原代海马神经元细胞培养

溶液的配制：

(1) 4%多聚甲醛溶液：4g多聚甲醛溶于100ml pH=7.4的0.01mol/l PBS中，混匀过滤，

室温保存。

(2)磷酸盐缓冲液（PBS）（0.01mol⋅l-1）：KH2PO4，0.1g；Na2HPO4⋅12H2O，1.7g；KCl，

0.1g；NaCl，4.0g，双蒸水加至500ml，pH=7.2～7.4。用0.2μm滤膜过滤，4℃保存。

(3) 1%蛋白酶的配制：用磷酸缓冲液（pH=7.2～7.4）配制成浓度为1%的胰蛋白酶母液

冻存。使用时，用解剖液稀释至0.25%。

(4) 培养皿涂被多聚赖氨酸：配制0.01%的多聚赖氨酸，分装冻存。将上述多聚赖氨酸

放入培养皿中涂两遍，自然晾干后备用。

(5) 解剖液：葡萄糖，3.0g；蔗糖，7.5g；NaCl，8.0g；KCl，0.4g；Na2HP04⋅7H20，0.18g；

KH2PO4，0.03g；HEPES，2.14g；加双蒸水1000ml，调pH=7.0～7.4，过滤，4℃保存。

(6) 种植液：DMEM 79%，胎牛血清，10%；马血清，10%；谷氨酰胺培养液1%。

(7) 饲养液：Neurobasal培养基，97%；谷氨酰胺培养液，1%；B-27，2%。

(8) 阿糖胞苷：用双蒸水配制成浓度为l mg⋅ml-1的母液储存。用0.2μm滤膜过滤，-20℃

储存。使用时，取6μl母液加入2ml培养液中，终浓度为3μg⋅ml-1。（根据实验情况调整浓度）

大鼠原代海马神经元细胞的培养

(1) 新生SD大鼠（＜12h），75%酒精浸泡消毒后断头，剥离出全脑并将其放入盛有解

剖液的培养皿中。

(2) 在解剖液中解剖大脑，分离出海马，移入另一盛有解剖液的培养皿中。在分离出全

部的海马后，去除血管等组织，然后用剪刀将海马分成数小块，放入盛有0.25%胰蛋白酶的培养皿中，将培养皿放入9%CO2、37℃消化20min。

(3) 将培养皿中的海马碎片移入离心管中，去除含胰蛋白酶的液体并用种植液将海马碎

片冲洗2～3遍，终止酶的消化作用。

(4) 在离心管中加入2ml的种植液，用口径递减的吹打管轻轻吹打海马碎片数次，将上

清液吸出备用，再加入2ml的种植液后，用吸管吹打数次，将上清液吸出备用，如此反复数次，至海马碎片全部被吹打散开。（每次吹打10次，吹打时注意不要吹入空气，吹打尽量轻柔）

(5) 吸出的上清液再加入种植液调整其浓度，用200目细胞筛过滤。

(6) 将上述滤过的液体混匀后分装入已涂有0.1mg⋅ml-1多聚赖氨酸的96孔板上，使分

散的细胞计数约为0.3x106⋅ml-1。然后将96孔板放入9%CO2，37℃细胞培养箱中培养。

(7) 12h后观察细胞，镜下可见多数细胞贴壁生长。生理盐水冲洗细胞2遍以上以去除

细胞碎片然后换上已平衡好的饲养液。

(8) 培养36h后加入阿糖胞苷3μg⋅ml-1以抑制胶质细胞的分裂生长。

(9) 加入阿糖胞苷后12h换液。以后每3d半量换液，饲养至7～14d可以进行实验。

(10) 或种板40min后，更换饲养液。种板后12h，更换饲养液。然后每3天半量换液。

注：第一种方法细胞纯度高，但对细胞损害较大，需要较高培养技术。培养的细胞适用于MTT等实验。第二种方法细胞纯度较高，对细胞损害较小，细胞状态好。培养的细胞适用于膜片钳