海马神经元培养

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小鼠海马区神经元的培养

徐医麻醉 2011-09-02 09:33:05 回复转载到

小鼠海马区神经元的培养

实验材料:

1、所有用于细胞培养的器械、器皿剂溶液必须灭菌消毒。

2、多聚赖氨酸铺板以磷酸盐缓冲液(PBS)或蒸馏水荣分解多聚赖氨酸(分子量为30-70KD)至1mg/ml。分装储存。临用前稀释至终浓度为20-60mg/ml过滤备用。在培养板或皿中加少量多聚赖氨酸溶液,以覆盖底部为宜,在37℃、CO2

孵箱中过夜。次日,用移液管吸取多聚赖氨酸,并用水洗2-3遍,晾干备用,如果培养目的适用于电生理的单细胞记录或者免疫组化和荧光染色,则在培养皿的底部加上盖玻片,多聚赖氨酸铺于盖玻片上,则更易得到强烈的荧光信号。

3解剖液(HEPES平衡盐溶液)取 100ml 10x 平衡盐溶液(Hank’s balance salt solution,HBSS)

HEPES 3.9g,

NaHCO3 0.84g,

青霉素 104 U,

链霉素 100mg,

H2O 800ml。

以1mol/LHCl调节PH至7.2,再加H2O之后总体积为1L,以0.2μm直径的滤菌器过滤,4℃保存。

4、DMEM 培养基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)DMEM 培养基500ml,加小牛血清和或马血清各10%(血清需经56℃,30min 灭活)1% 的青/链霉素.

5、无血清培养基最常用的一种无血清培养基为,Neurobasal+2%的b27+1%抗生素

6、2.5%胰蛋白酶(typsin)溶液临用前以解剖液稀释至终浓度0.125%。

7、台盼蓝(typan blue )溶液终浓度为0.2%-0.4%。

8、阿糖胞苷终浓度为8-10 μmol/L。

9、动物妊娠天数的选择通常选择出生24h之内的乳鼠。

实验步骤:

1、脱臼处死乳鼠,75%的酒精浸泡3-5min,将清洗完的乳鼠放入含预冷解剖液的培养皿中。

2、用两把尖镊逐个去除鼠的头部皮肤和颅骨,取出全脑,置于另一含预冷解剖液的(PBS?)培养皿中,小心剥离并去除脑膜及脉络丛。

3、在中线处用尖镊分离大脑半球,在解剖显微镜下小心去除嗅球、中隔、丘脑及下丘脑,剥离脑膜及脉络丛,在大脑皮层下方小心取出海马,置于含冰冷解剖液的6cm培养皿中。

4、用弯头尖镊把海马剪成小碎片,收集全部海马碎片,置于一含有0.25%胰蛋白酶溶液的培养皿中(该溶液必须在37℃孵箱中预暖),在孵箱中消化5-7min。

5、收集全部海马碎片,置于10ml预暖的DMEM培养基的试管中(培养基中含有10%的胎牛血清和或马血清各,1%抗生素,以及谷氨酰胺)。最好用培养基洗2-3

遍,以中止消化反应。

6、加少量培养基于试管中,以中空塑料管反复吹打10-15次,直成细胞悬液。加培养基于同一试管中至约10ml,静置约10min。取1-2μl细胞悬液于

99μl0.2%-0.4%台盼蓝溶液中,用细胞计数板计算存活和死亡的细胞数,从而测定细胞密度(细胞计数:活体细胞具有排斥台盼蓝的能力,而死亡细胞则能吸收台盼蓝变成蓝色)。

7、根据实验需要,以培养基稀释细胞悬液至所需的细胞密度,接种细胞至经多聚赖氨酸铺板过夜处理的培养皿或培养板中。通常细胞密度为(2-2.5)x105细胞/cm2.

8、待6-8h细胞贴壁后,换培养基为含2

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