胎鼠海马神经元培养及其鉴定
胎鼠海马神经元体外原代培养与鉴定
胎鼠海马神经元体外原代培养与鉴定【关键词】胎鼠海马神经元；体外原代培养；鉴定doi：10.3969/j.issn.1004-7484（x）.2013.06.568 文章编号：1004-7484（2013）-06-3323-02在神经生物学及相关学科领域中，原代培养的神经元因其排除机体生理病理状态干扰的影响而成为较为理想的实验模型，是研究神经元形态、物质代谢、分子机制及电活动的主要前提。
海马是大脑边缘系统重要的组成部分，在学习、记忆、情绪反应及中枢神经系统疾病的病理生理变化方面发挥着重要作用。
对于原代海马神经元的培养，主要供体主要有胎鼠与新生鼠两种，培养方法有含血清培养和不含血清培养两种。
我们通过实验摸索，取得一种较稳定且简便实用的方法，能获得较高存活率的海马神经元。
1 材料与方法1.1 实验动物来源清洁级孕17-19天sd大鼠上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，生产许可证号：scxk（沪）2012-0002。
1.2 主要仪器与试剂 co2培养箱（thermo公司），倒置相差显微镜为（olympus公司），激光共聚焦显微镜型号为zeiss lsm710，小鼠抗大鼠classⅲβ-tubulin单抗（beyotime公司），nse免疫组化染色试剂盒、dab显色试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司），b27添加剂、neuralbasal、hoechst 33342sigma公司），dmem（高糖型）培养基、胎牛血清（gibco公司）。
1.3 培养方法与鉴定取孕17-19天大鼠，水合氯醛麻醉后70%酒精浸泡20min，颈椎脱臼法处死孕鼠，将子宫立即放入冰浴含dmem 的大平皿中，在解剖显微镜下取下海马组织，剪成约1mm×1mm×1mm 大小，用0.125%胰蛋白酶于37℃、5%co2培养箱中消化15min，中间每隔5min振荡一次，加入含10%fbs的dmem液终止消化，巴氏管轻柔吹打，200目筛网过滤。
胎鼠海马神经元培养及其鉴定
２１ ，（ ：７ ９ ０ １ ５） １ １
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胎 鼠海 马神经元培养及其鉴定
李 玉 ” ，王 波 ” 但齐琴 ∞ ， （ 昆明医学院第一附属医院神经外科 ，云南 昆明 ６０３ ；２ 昆明医学院神经科学研 究所，云南 昆 １ ） ５０ １ ）
ｔｅ ｅ ｌ ｆ ｍ ｔ ａ ， ｗｉ ａ ｕ ｌ ｎ ｒａ ｉｇｔｅｎ ｕ ｔ ｕｇｏ ｔ ． Ｃｏ ｃｕ ｉｎ Ｐ ｒ ｅ ｅ ｒｎ ｔ ｈ ｎｇ ｗ ｗｅｌ ｒ ５ｈ ｄ ｙ ｒ ｏ ｔ ｇ ｄ ａ ｃｅ ｓｎ ｅ ｒ ｉ ｏ ｔ ｗ ｈ ｈｒ ｉ ｈ ｉ ｓ ｒ ｎ ｌｓｏ ｕ ｆ ｄｎ ｕ ｏ ｓ ｈ ｉ ｉ ｗｉ
ｎ ｕ ｏ ｓ ｙＳ —ｗｏ ｓｅ ｔｉｉｇｍｅｈ ｄ Ｒｅ ｕｔ Ａｆ ｒｉｃ ｂ ｔｄｆｒ ｏ ｒ ， ｔａ ｓ ｒｅ ｕ ｐ ｎ ｉｎ ｅｌ ｅ ｒｎ Ｐ ｔ — ｔｐ ｓ ｎｎ ｔｏ ． ｂ ａ ｓｌ ｓ ｔ ｕ ａｅ ｈ ｕ ｓ ｒｎ ｆ ｒ ｄｓ ｓ ｅ ｓｏ ｓ ｎｗ ｌ ｅ ｎ ｏ ２ ｅ ｉ ｓ
ｎ ｕ ｏ ａ ｒ ｗｔ ｃ ａ ａ ｔ ｒ ｉｔ ｓ Ｍ ｅ ｈ ｄ Ｔ ｓ ｕ ｓ ｆｏ ｈ ｐ ｏ ａ ｕ ｆ ｆ ｔｌ ｒ ｔ ｗｅ ｅ ｈ ｒ ｅ ｔｄ， ｔ ｅ ｅ ｒ ｎ ｌ ｇ ｏ ｈ ｈ ｒ ｃｅ ｓｉ ． ｃ ｔｏ ｓ ｉｓ ｅ ｒ ｍ ｉ ｐ ｃ ｍｐ ｓ ｏ ａａ ａｓ ｒ ａ ｖ ｓｅ ｈｎ
明 ６ ０ ３ ） ５０ １
［ 要］ 目的 摘 建立胎 鼠海马神经元体外 培养 方法 ，观察细胞生长情况 ，免疫 组织化学染色鉴定神经元特
异性． 方法
神经元细胞培养步骤
海马神经元细胞培养一、实验前准备1.手术器械、培养皿、筛网的消毒2.多聚赖氨酸的配制3.培养板处理：（培养板中可加入小的圆形玻片，多次使用）(1)用多聚赖氨酸室温包被5min，随后吸取多余液体，晾干。
(2)用PBS洗一遍，吸取PBS后晾干备用。
4.胰酶的配制5.PBS的配制二、操作步骤1. 新生一天的小鼠，酒精喷洒全身，置于干净的培养皿中，用手术剪刀剪下头部，放入另外一个干净的培养皿中（五只）。
2.用干净镊子取出全脑放于（冰）的PBS的培养皿（10cm）中，置于解剖显微镜下。
3.移入解剖显微镜下，分离出皮层或海马组织，去除血点，移入盛有HOOD下的培养皿中。
4.将皮层或海马组织剪成1-3mm的小块，用0.25%，2ml胰酶-EDTA 消化，37ºC水浴消化30分钟，每消化10分钟振摇一下。
30分钟后，用移液枪吸取可见组织，放入离心管中，并加入与胰酶等体积的DMEM （HG）+10% FBS培养液终止消化，吹打20次左右，注意动作轻柔，不要吹打出气泡。
5.如果组织明显不能吹散或粘稠的话，过一下200目筛网。
过滤液DMEM，进入大离心管中。
离心800r，3min。
弃去上清，加入DMEM 培养液，分装在培养皿（6cm）中，放入含5% CO2 的37C恒温培养箱内培养。
6.6-8小时（或第二天）后换液，用PBS液先洗两遍，并上下左右摇晃10次左右，去除一些细胞碎片，随后培养液换成Neurobasal 培养液+B27（2%）+谷氨酰胺（0.5mM）（+双抗)继续培养，并且3天半换液一次。
7.到第八天时，将培养液换成新鲜Neurobasal无B27、谷氨酰胺、双抗，开始用于实验。
染料木素对体外培养胎鼠海马神经元细胞活力及其形态的影响
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ห้องสมุดไป่ตู้
染料木素对体外培养胎鼠海马神经元细胞活力及其形态的影响 3
第四军医大学药学系药物研究所 ( 西安 710032 ) 王 超 王四旺△ 王剑波 涂宏海 # 肖 茜▲ 张 松 摘 要 目的: 观察染料木素 ( Geniste in, Gen ) 对正常胎鼠海马神经元细胞培养条件下的活 力及其形态影响。方法: 取 16～ 18d 孕龄 SD 胎鼠海马组织进行原代培养海马神经元。采用M TT 比色法 检测 0. 01Λg �m l、 0. 02Λg�m l、 0. 04Λg�m l、 0. 08 Λg � m l、 0. 16Λg�m l、 0. 32Λg �m l、 0. 64 Λg � m l、 1. 28Λg �m l、 2. 56Λg �m l、 5. 12Λg �m l Gen 组及空白组对海马神经元分别作用 24h、 48h、 72h 的 细胞活力及其形态变化。结果: ①Gen 对海马神经元细胞活力的最佳剂量为 0. 32Λg �m l; Gen 在 0. 01 Λg � 0. 02Λg�m l、 0. 04Λg�m l、 0. 08Λg �m l、 0. 16Λg � 0. 32 Λg � m l、 m l、 m l 呈剂 量依 赖性 增强; 而 0. 64Λg�m l、 1. 28Λg�m l、 2. 56Λg�m l、 5. 12Λg�m l Gen 各组的细胞活性呈剂量依赖性下降。②Gen 各剂量度组对海马神经元细胞的最明显促进生长时间是 24h ; Gen 作用 48h 和 72h 时细胞活力则 呈下降趋势。 ③ 0. 32 Λg � 0. 02Λg�m l、 m l Gen 干预 24h 海马神经元细胞的形态最佳; 0. 01Λg�m l、 0. 04Λg � m l、 0. 08Λg �m l、 0. 16Λg�m l、 0. 32 Λg�m l Gen 各组随剂量的增加对海马神经元细胞的生 长促进作用明显增强, 细胞形态呈轴突树突明显连接成网, 胞体折光性好, 细胞碎片少; 大于 0. 32 Λg � m l Gen 剂量的效应结果则反之 , 随剂量增大其作用明显呈副效应变化 , 其细胞形态的轴突 树突网状结构不明显 , 胞体折光性差, 且呈崩解趋势, 细胞碎片明显增。结论: Gen 对体外培养胎 鼠海马神经元细胞生长活力作用的最佳剂量为 0. 32Λg�m l, 最佳效应时间是 24h。 主题词 海马旁回�生理学 细胞培养 植物生长调节物�药理学 体外研究 大鼠 染料木素 (Geniste in , Gen ) 广泛存在于豆科植物 中。 Gen 亦称植物雌激素 , 在人体内可与雌激素受体结 [1] 合发挥弱雌激素样作用和抗雌激素活性 。 目前, Gen 研究较多的是用于治疗骨质疏松和肿瘤 , 而在神经再 生方面的研究较少 [2, 3 ] , 且刚刚开始。 在 Gen 对神经细 胞作用的研究
胎鼠、新生大鼠原代海马神经元培养及鉴定
胎鼠、新生大鼠原代海马神经元培养及鉴定熊丽娇;郭阗廷;曾治平;黄志华;曾靖【摘要】目的:建立胎鼠、新生鼠海马神经元体外培养方法.方法:分别取胎鼠、新生鼠海马,消化后种植,用含有2%B27的neurobasal培养液培养,第3天加入5 μmol·L-1的阿糖胞苷,换液后继续培养,以获得纯度较高的海马神经元.培养第3、7天观察细胞生长及突起情况,用neurofilament抗体以免疫荧光方法鉴定神经元细胞.结果:海马神经元种植24 h后贴壁,7天时神经元突起相互连接成网络.经neurofilament染色,培养细胞阳性率高,新生鼠原代培养海马神经元阳性率达(89±3.4)%,胎鼠海马神经元阳性率达(98±1.5)%.结论: 本方法培养出的胎鼠、新生大鼠海马神经元纯度较高,可作为海马神经元模型用于进一步研究.【期刊名称】《赣南医学院学报》【年(卷),期】2017(037)003【总页数】3页(P354-356)【关键词】海马神经元;细胞培养;胎鼠;新生鼠【作者】熊丽娇;郭阗廷;曾治平;黄志华;曾靖【作者单位】赣南医学院第一附属医院全科医学VIP科;赣南卫生健康职业教育学院外科教研室,江西赣州 341000;赣南医学院第一附属医院全科医学VIP科;赣南医学院;赣南医学院【正文语种】中文【中图分类】R285.5海马是大脑边缘系统重要部分，神经元分布高度集中，在认知、记忆、情绪、植物神经系统方面起着不可替代的作用[1-3]。
海马神经元体外培养模型已经成为研究神经元发育分化、神经疾病的发生机制的重要技术手段[4-6]。
海马神经元体外培养文献报道方法多样，动物来源主要有胎鼠和新生鼠，根据实验条件，我们摸索出了原代胎鼠、新生大鼠的海马神经元培养方法，并进行了细胞鉴定，获得了高纯度的胎鼠、新生大鼠海马神经元。
1.1 材料1.1.1 实验动物孕17天SD大鼠及出生24 h内的SD大鼠。
1.1.2 主要试剂 DMEM培养基、neurobasal培养基、胎牛血清(FBS)和B27培养基添加剂(Gibco公司)、青链霉素、胰酶、多聚L赖氨酸(sigma公司)。
海马神经元细胞免疫荧光检验
海马神经元细胞免疫荧光检验神经元鉴定：一、烯醇化酶鉴定：培养细胞用100%乙醇固定---10min---PBS漂洗5min×3次---3%H2O2室温孵育30min，目的用于去除内源性过氧化物酶---PBS 漂洗5min×3次---5%羊血清（0.3%TritonPBS配制），室温封闭30min 以减少排特异背景颜色------加第一抗体特异烯醇化酶（chemicon，1:1000），4℃冰箱孵育18~24小时---PBS漂洗5min×3次---加入2步法：PV9000试剂Ⅰ,37℃，30min---PBS漂洗5min×3次---PV9000试剂Ⅱ,37℃，30min---PBS漂洗5min×3次---DAB显示红棕色；70%，80%，90%，100%I，100%II 梯度酒精透水；二甲苯Ⅰ，Ⅱ透明2次，每次30min---中性树胶灯片---镜下观察。
二、β-微管蛋白Ⅲ（β-tubulinⅢ）荧光显示：培养细胞用预冷PBS液轻柔漂洗3次，4%多聚甲醛固定，1h，4℃---吸去多余甲醛---PBS漂洗5min×3次---0.25%triton，室温，15min---3%H2O2室温孵育30min，目的用于去除内源性过氧化物酶---PBS漂洗5min×3次---5%羊血清（0.3%TritonPBS配制），室温封闭30min以减少排特异背景颜色------弃血清，加入β-tubulinⅢ抗体（1:100稀释），4℃，过夜---PBS漂洗5min×3次---滴加FITC 标记的山羊抗小鼠lgG（体积比1:200稀释），37℃，1h---DAPI复染10min---抗荧光猝灭封片液封片---荧光显微镜观察---选择10个视野，统计学处理。
一、烯醇化酶鉴定：培养细胞用100%乙醇固定---10min---PBS漂洗5min×3次---3%H2O2室温孵育30min，目的用于去除内源性过氧化物酶---PBS漂洗5min×3次---5%羊血清（0.3%TritonPBS配制），室温封闭30min以减少排特异背景颜色------加第一抗体特异烯醇化酶（chemicon，1:1000），4℃冰箱孵育18~24小时---PBS 漂洗5min×3次---加入2步法：PV9000试剂Ⅰ,37℃，30min---PBS漂洗5min×3次---PV9000试剂Ⅱ,37℃，30min---PBS漂洗5min×3次---DAB显示红棕色；70%，80%，90%，100%I，100%II 梯度酒精透水；二甲苯Ⅰ，Ⅱ透明2次，每次30min---中性树胶灯片---镜下观察。
海马细胞培养与鉴定
非特异性对照:用正常羊血清代替兔抗特异性烯醇化酶(NSE)多克隆抗体,其它实验步骤上。
阴性对照:用PBS代替兔抗特异性烯醇化酶( NSE )多克隆抗体,其它实验步骤同上。
纯度计算：高倍镜视野下，随机选取计数视野，计数100个细胞中阳性神经元的数目，重复5次后，计算均值。
吸去培养液用PBS液冲洗3遍
↓
质量分数为4%的多聚甲醛固定15 m in;
↓
0.01mol/LPBS液中洗15 m in;（5min×3次）
↓
质量分数为0.4%的Triton X-100湿盒反应40 m in;
↓
0.01mol/LPBS液中洗15 m in;（5min×3次）
↓
3%H2O2孵育15min,消除内源性的过氧化物酶
搅拌。
↓
(3)将待标记的抗体12.5mg用生理盐水稀释至5ml，搅拌下逐滴加入酶溶液中。
↓
(4)用1M PH9.5碳酸缓冲液0.25ml，继续搅拌3?小时。
↓
(5)加0.2M赖氨酸0.25ml，混匀后，置室温2小时。
↓
(6)在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4℃1小时。
↓
(7)3000rpm离心半小时，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于
或使用和一抗相同来源的血清(10%)进行封闭。另一方面，请注意选购经过适当吸附的二抗，以减小二抗的非特异性吸附。
b.在免疫组化时如果背景显色太深，需注意灭活内源性过氧化氢酶。可以在4体积甲醇中加入1体积3%过氧化氢，混匀后用于内源性过氧化氢酶的灭活。
c.可以考虑缩短显色时间，或降低二抗浓度。另外，选择适当强度的洗涤液，或延长洗涤时间也会有所帮助。
步骤：
大鼠海马神经元原代培养
汇报人：何克宇
S
实验要点
S 取活体细胞
S 令海马神经元贴壁生长
S 神经元培养液
实验材料
S 动物：大鼠胎鼠（15~20天）
S 试剂：多聚赖氨酸
解剖液（DMEM+PBS） 0.125%胰蛋白酶
S 培养液：①DMEM+F12+10%胎牛血清
②Neurobasal+2%b27+1%双抗
1. 胰蛋白酶（预暖）消化15min，3~5min震荡一次。
2. 静置2min，去上清，PBS洗两遍终止消化 3. 加入DMEM，吹打，取上清。重复3次。 4. 种板，培养液（DMEM+F12+10%胎牛血清），细
胞密度3.5*105/cm2
抗）
Thank You
实验步骤
1.器械灭菌 2.多聚赖氨酸（PLL）铺板
0.1mg/ml，包被30min，吸去多余PLL，
过夜晾干
实验步骤
1.孕鼠颈椎脱臼处死，取胎鼠 2.胎鼠断头，置于PBS，取全脑，置于解剖液（冷） 3.体视显微镜下沿中线分离半球，取海马，仔细分离血 管和膜性组织。（快、干净）
实验步骤
实验步骤
大鼠脑海马神经元原代培养方法的建立及其纯度的鉴定
ｋｎ ｓｏ ｎ ｙ ｓ ｔ ｎ ｅ ｔ ａ ｈ ｕ ｎ ｉ ｎ ｕ ｉ ｆｔ ｅ ｃ ｌ ｒ ｄ ｎ ｕ ｏ ｓ Ｒｅ ｕ ｔ ： Ｔ ｅ ｎ ｕ ｏ ｓ ｃ ｌ ｒ ｄ ｂ ｈ ｗ ｉ ｄ ｎ ｉ ｄ ｆｅ ｚ ｍｅ ｏ ｉｖ ｓｉ ｔｔｅ ｑ ａ ｔｔ ａ ｄ ｐ ｒ ｙ ｏ ｕ ｔ ｅ ｅ ｒｎ ． ｇ ｙ ｔ ｈ ｕ ｓ ｌｓ ｈ ｅ ｒ ｎ ｕｔ ｅ ｙ ｔ ｅ ｔ ｏ ｋ ｎ ｓ ｅ — ｕ
ｇ ｓｅ ｔ ａ ａ ｎ ｅ ｚ ｍｅ ａ ｄ ｃ ｌｕ ｅ ｔ ｅ ｒ ｂ ｓ ｌａ ｅ ｓａ ｉｉａ ｉｎ ａ ｄ ｓ ｆ ｔ Ｏ ｉ ｒａ ｅ ｔｅ ｑｕ ｎ ｉ ｎｄ ｐｕ ｉｙ ｏ ｅ ｏ ． ｅ ｔ ｄ ｗｉ ｐ ｐ ｉ ｎ ｙ ｎ ｕｔ ｒ ｄ ｗｉｈ ｎ ｕ ｏ ａ ａ ｒ ｔ ｂｌｚ ｔｏ ｎ ａｅｙ Ｓ ｎｃ ｅ ｓ ｈ ａ ｔｔ ａ ｒｔ ｆｎ ｕｒｎｓ ｈ ｙ
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（ ．沈 阳医 学 院 教 务 处 ，辽 宁 沈 阳 １０ ３ １ １０ ４；２ 基 础 医学 院组 织 与 胚 胎 学 教 研 室 ） ．
［ 摘要 ］目的 ：为建立一种稳定的大鼠胎鼠海马神经元培养方法并能够有 效的鉴定其 纯度 。方法 ：分 离 Ｗｉａ大鼠胚胎 并 ｓ ｔ 取海马组织 ，比较 两种 常用酶 ，胰 酶和木瓜 酶消化效果对海马神经元产量的影响及 两种不 同培养方法对海马神 经元纯度 的
小鼠大脑皮层和海马神经元的分离与培养20110110
小鼠大脑皮层和海马神经元的分离与培养一、玻片的准备A．玻片的清洗1. 第一天，将玻片(12mm，633009，Carolina) 逐片置于装有浓硝酸(HNO3) 或者洗液的平皿中，混匀，然后浸泡过夜。
2. 第二天，将玻片放在有单蒸水的陶瓷盘中，搁在摇床上晃动，速度为200rpm，将玻片上的硝酸残液清洗干净。
每10min换水一次，要换20次以上。
晚上置于双蒸水中浸泡过夜。
3. 第三天，换双蒸水，重洗两次，每次速度为200rpm ，时间为60min，去除玻片上的离子和其它杂质，最后再换用无水乙醇，清洗三次以上。
洗完后置于小烧杯中，拿到细胞房超净台将玻片浸泡在无水乙醇中室温保存。
4. 解剖小鼠取细胞前两天将玻片从无水乙醇中取出，在酒精灯焰上烘干，稍微在空气中停一下，再放到灭菌的parafilm膜上。
玻片高温易碎，速度要快。
完成后在紫外下照射1h。
B. 玻片的包被（PDL包被）用0.1M的硼酸钠溶液将PDL配成0.01mg/ml PDL的溶液(pH 8.4)。
1.准备500ml 0.1M的硼酸钠（Na2B4O7·10H2O, B3545-500G，Sigma）溶液。
2.在超净台中，往一整瓶Poly-D-Lysine（PDL，5mg/ml，Sigma, P6407-5MG）中加入25ml的该硼酸钠溶液。
盖上瓶盖，溶解5min，可以轻轻晃动。
然后将该溶液加到剩下的硼酸钠溶液中。
即为所配溶液，0.22μm过滤，用锡纸包好，4℃避光保存。
3.使用的时候，6/12/24孔板每孔加1ml/500μl/250ul的PDL溶液，12mm盖玻片每片加50μl的PDL溶液，放在超净台中，室温包被4hrs或者过夜。
4.第二天，紫外照射超净台1-2hrs，再将PDL吸干。
将板和玻片盖揭开，室温晾过夜。
5.第三天，将每个孔/玻片用灭菌水洗两遍，吸干，盖上盖，避光待用。
二. 大脑皮层与海马的解剖A. 解剖前的准备1.解剖器械的灭菌解剖前将器械放在铝饭盒中，倒入75%乙醇，并在超净台中放入适量卷纸，打开紫外杀菌1-2hrs。
大鼠海马神经元的培养及细胞培养注意事项
1.成年大鼠海马神经元的培养●步骤1.获得海马细胞◆大鼠乙醚麻醉，断头处理；◆迅速解剖海马组织，置于含有2ml 4℃的HibernateA/B27的35mm的培养皿中；◆随后将其移入含有同上培养基的培养皿，去除脑膜及多余的脑白质（？）；◆将海马移入组织切碎机冷处理台面上事先用HibernateA/B27润湿的滤纸上，沿海马长轴将组织切成0.5mm的薄片，随后将其移入含有5ml4℃的HibernateA/B27的离心管中；◆30℃震荡8min。
◆大吸管将其移入含有木瓜蛋白酶（预热至30℃）的离心管，置于170rpm的旋转平台（保持组织片悬浮状态），30℃水域温育30min；◆将海马组织切片移入15ml含有2mlHibernateA/B27的离心管中，30℃温育5min，吸管吹打10次（30s），静置2min，将上清移入另一离心管，重复上述步骤2次；2.梯度分离◆将细胞悬液加入Nycoprep gradient（4ml）的上方，室温，1900rpm，离心15min；去除最上方的碎片；吸管收集含有细胞的部分；用5mlHibernateA稀释；第三层富含神经元；将第四层用2 ml B27:NeurobasalA重悬，1100rpm离心1min；3.盖玻片处理：50ug/mL多聚-D-赖氨酸（无菌水溶解）包被过夜，吸去多余的多聚赖氨酸，无菌水漂洗一次，自然干燥1h；4.◆细胞接种：以目标密度稀释于B27:NeurobasalA，以每盖玻片60到120 Ul 接种，置于5% CO2:9% O2中孵育1h；◆将盖玻片移入24孔培养板中,每孔以0.4ml 37℃B27/NeurobasalA漂洗一次，去除未贴壁细胞及细胞碎片；改用0.4ml的生长培养基；◆培养后4天，每3-4天更换一半培养基；新的培养基中的FGF2含量是远培养基的2倍；1.培养器皿的准备：1）溶液瓶——装配各种溶液——输液瓶；2）螺口瓶——血清或培养基；3）培养瓶——细胞培养——一般采用带螺口的，清洗时注意防止盖子中垫片的丢失；4）培养皿——细胞组织的分离、培养、染色——包括直径为30mm、60mm、120mm5）血球细胞计数板——细胞计数6）移液管——连接上手动（吸耳球）或电动负压吸取装置——在移液管尾部塞入少量脱脂棉；7）离心管——分离、漂洗、收集细胞——一般选用螺口带盖的；Eppendorf ——塑料尖底带盖的离心管8）磁力搅拌器：用于神经细胞的分离机溶液的配置；最好配合使用可调温度的加热装置；可用高压蒸汽消毒。
最详细的神经元原代培养
最详细的神经元原代培养(2010-08-31 12:08:56)转载▼标签：教育序言：国内外关于原代培养有很多文献，不幸的是，没有一篇是详细的，没有一篇解答过why.为了让大家少走弯路，根据我杀过3000只老鼠的经验，我把我这几年摸索的经验和大家分享，请求多投几票得几个叮当。
相信你follow我的这篇文章一定会做的很好。
我的标题说的很像吹牛，但是我是严肃认真的说的，I earn it.note:这篇文章全是我个人的经验，99。
9%原创，经过无数失败的到的最完美的原代神经元培养法，除了最后那一副图是来自下面第2行那篇文献，所以我才说是99.9%原创。
（注：附录的图是常用的消化酶对实验的存活率影响，来自下面链接里的文献）另外，成年鼠的原代培养我没有摸索过，推荐一篇文献在我以前的帖子（无需叮当）（/bbs/post/view?bid=156&id=17651341&sty=3）本篇专门讨论胎鼠和新生鼠神经元的原代培养。
1.材料选择。
一定要严格按照国际上，NCBI数据库，其他文献的材料一致。
胎鼠就要胎鼠，新生鼠就要新生鼠，不能混淆。
因为新生鼠有一些受体，在培养的工作中失去功能，会不能再生，比如NMDA受体。
和文献不同会导致错误结论，甚至困惑。
很多人写信问我新生鼠的培养问题，我回答用新生鼠的实验很少，八成是你自己搞错了实验对象，请确认国际上的相关研究文献所用老鼠，再来问我下面的问题。
2，培养基选择（neurbasal/neurobasal-a,invitrogen Co.ltd)。
我强烈不建议用血清培养。
原因是：首先，血清刺激胶质细胞和杂细胞分裂，最后非常影响神经元产量；其次，为了抑制胶质生长，往往要加入阿糖孢苷。
严重的毒性会影响许多灵敏实验；再次，最重要的，血清培养的细胞状态很不均一，从正常到凋亡都有，严重影响试验准确，而无血清专用培养基所有的正常细胞都处于一样的状态，要么都好，要么都差，高度一致。
原代海马及皮质神经元培养方法
原代海马及皮质神经元培养方法海马和皮质神经元是神经系统的重要组成部分，在研究神经生物学和药物疗效等方面具有重要价值。
为了研究这些神经元的生理特性和功能，我们常常需要从动物体内分离和培养这些神经元。
以下是针对原代海马和皮质神经元的培养方法。
1.实验动物准备：首先，需要准备实验所需的动物。
一般情况下，小鼠是最常用的实验动物。
在实验进行前，需要确保动物符合实验伦理和动物保护要求，并获得相应的实验动物使用许可。
2.动物脑组织的获取：在实验动物处死后，需要尽快取出脑组织。
使用无菌技术将大脑取出，并将其放入生理盐水或培养基中。
3.脑组织的分离和消化：将脑组织放入含有0.02％的溴酚红的磷酸缓冲生理盐水中，用无菌剪刀和镊子将其剪碎成小块。
然后，将组织块放入含有0.25％胰酶的溶液中，在37℃的恒温培养箱中消化2至5分钟。
然后，将溶液过滤并离心，以去除细胞碎片和大块组织。
4.细胞的分离和培养：将离心沉淀涂布在含有25％培养基和10％胎牛血清的培养皿中，然后放入37℃的恒温培养箱中。
培养基的成分可以根据具体需要进行调整。
细胞会附着在培养皿上，并开始生长和繁殖。
在细胞培养过程中，需要定期更换培养基，以提供细胞所需的营养物质。
5.细胞的处理和分选：在培养4至7天后，细胞会形成较为密集的神经元网络。
在这个时候，可以通过处理和分选细胞来提高神经元的纯度。
例如，使用抗体标记法可以针对神经元选择性地杀死胶质细胞。
此外，还可以使用细胞遗传方法，如转染特定基因或使用荧光探针标记细胞。
6.测试和分析：经过特定时间的培养后，可以对原代海马和皮质神经元进行测试和分析。
这些测试和分析可以包括细胞生存率、纯度、形态特征、电生理活性、细胞内信号和细胞功能等方面的内容。
这些测试和分析的方法可以通过显微镜观察、电生理仪器、蛋白质和基因分析等手段进行。
7.特殊处理：有时对于特定的研究需要，还可以对原代海马和皮质神经元进行特殊处理。
例如，可以通过给予特定药物、激素或其他刺激条件，来模拟不同的疾病模型或研究特定功能。
原代海马神经细胞体外培养的纯化与鉴定
第４ ４卷
３２ ２
第 ４期
哈尔滨医科 大学学报
Ｊ ０ＵＲＮＡＬ ＯＦ ＨＡＲＢ Ｎ ＭＥＤ ＣＡＬ ＵＮＩ Ｉ Ｉ ＶＥＲＳ ＩＹ Ｉ
Ｖｏ ． ４， ． １ ４ Ｎｏ ４ Ａｕ ．，２ １ ｇ ００
２１ ０ ０年 ８月
原代 海 马 神 经 细胞 体 外 培养 的纯 化 与鉴定
在体外采用含血清结合无血清法进行培养 ， 并用 Ｎ Ｅ Ｇ Ｐ４ 、 Ｐ Ｓ 、 Ａ －３ ＭＡ ２等海马神经 细胞 特异抗体经 免疫细胞化学 方
法鉴定细胞性质及纯度。结果 度达 ９ ％以上。结论 ６ 至第 ７ ・ ８天神经元形态最为成熟饱满 ， 随后逐渐 出现 细胞 老化 ， 神经元 最长可 生存 ４周 。经鉴 定 ， 马神经元 纯 海 体外采用含血清和无血清法相结合进行原代 海马神经细胞 培养 ， 细胞纯度高 ， 杂细胞少 ， 可 为神经疾病体外研究提供 必要 细胞基础 。
ｍａ ｕｔｒ ｆ ｉｐ ｃ ｍｐ ｌ ｅ ｒｎ ｉ ｅｕ ｍｅ ｉｍ ｎ ｅｕ ｆｅ ｄｕ ｉ ｉ ｏｉ ｗ ｔ ｉｈ ｐ — ｙ ｒ ｃ ｌ ｅｏ ｐ ｏ ａ ａ ｕｏ ｓｗ ｔ ｓ ｒｍ ｄｕ ａ ｄ ｓｒ ｍ— ｅｍｅ ｉｍ ｎｖｔ ｓ ｉ ｈｇ ｕ ｕ ｈ ｎ ｈ ｒ ｒ ｈ
Ｌ Ｕ ｎ，ＺＨＡＮＧ — ａ，ＺＨＡＮＧ ｎ— Ｉ Ｘｉ Ｙｉｎ Ｙｕ ｈｅ，ｅ ｌ ｔａ
（ ｅａｔｅ ｔｆＧｒ ｔｃ，Ｔ ｅ ｅｏ ｄＣｉｉ ｌ ｏｌ ｅ Ｈ ｒｉ Ｄｐ ｒ ｎ ｏ ｅｉ ｒｓ ｈ ｃｎ ｌ ｃ ｌｇ ， ａｂ ｍ ａｉ Ｓ ｎａ Ｃ ｅ ｎ
神经细胞实验报告
一、实验目的本研究旨在通过体外培养神经细胞，探讨CA1重组蛋白在神经细胞生存以及学习记忆过程中的生物学功能，并深入了解其调控机制，为神经科学领域的研究提供实验基础。
二、实验材料1. 细胞：大鼠胚胎海马神经元2. 试剂：DMEM培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素、神经生长因子、抗凋亡因子、CA1重组蛋白、学习记忆相关基因的抗体、荧光标记抗体等3. 仪器：细胞培养箱、倒置显微镜、荧光显微镜、酶标仪、离心机、凝胶成像系统等三、实验方法1. 细胞培养：将大鼠胚胎海马神经元接种于细胞培养皿中，培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，置于细胞培养箱中培养。
2. CA1重组蛋白表达和纯化：通过基因工程方法表达CA1重组蛋白，并进行纯化。
3. 神经元培养和CA1处理：将培养至一定时期的神经元分为实验组和对照组，实验组加入一定浓度的CA1重组蛋白，对照组加入等体积的DMEM培养基。
4. CA1对神经元细胞凋亡的影响：通过流式细胞术检测CA1处理组与对照组神经元细胞凋亡率的差异。
5. CA1与学习记忆相关基因的表达关系研究：通过RT-qPCR检测CA1处理组与对照组神经元中学习记忆相关基因的表达水平。
6. 穿透式电子显微镜观察CA1对突触结构的影响：通过透射电子显微镜观察CA1处理组与对照组神经元突触结构的差异。
7. CA1对学习记忆行为的影响：通过Morris水迷宫实验检测CA1处理组与对照组小鼠的学习记忆能力。
8. 数据分析与统计：采用SPSS软件对实验数据进行统计分析，包括t检验、方差分析等。
四、实验结果1. CA1处理组神经元细胞凋亡率显著低于对照组（P<0.05），表明CA1重组蛋白具有抑制神经元细胞凋亡的作用。
2. CA1处理组神经元中学习记忆相关基因的表达水平显著高于对照组（P<0.05），表明CA1重组蛋白可能通过调控学习记忆相关基因的表达来影响神经元的学习记忆功能。
3. 透射电子显微镜观察结果显示，CA1处理组神经元突触结构较为完整，而对照组神经元突触结构出现一定程度的损伤。
神经元培养
神经元培养实验步骤：一准备：1 新生鼠出生24小时内（或胎鼠：师姐做的都是新生鼠，但外文文献都是胎鼠，胎鼠神经元存活率更高）2解剖液HBSS(g)Nacl 8.00Kcl 0.4Na2HPO4 0.0478KH2PO4 0.06Hepers 2.38定容到1000ml调PH至7.43.实验前一天灭菌耗材（看老鼠的肚子差不多估计快要生了）高压灭菌：器械，HBSS200ml，PBS或超纯水200ml,1ml枪头，200ml枪头，10ul枪头，5ml枪头，1.5mlEP管大于5个，5mlEP管大于5个，15mlEP管大于5个。
灭菌完毕后待HBSS，PBS或超纯水，4℃保存，其余器械耗材至于烤箱烤干。
包被培养板:0.1mg/ml多聚赖氨酸铺板，（一般四到六条海马一个六孔板，半脑皮层2块六孔板），培养箱内过夜。
4实验当天：解冻胰酶5ml，血清5ml1号超净台：冰盒加冰，器械，解剖显微镜，培养皿6cm2个，3cm （两个大脑一个皿）2号超净台：枪头，EP管，离心管，培养皿3cm2个，移液枪（包括5ml），酒精灯，废液缸2个75%酒精房间紫外照射至少30分钟，后通风10分钟二，操作步骤：1，取出多赖包被的培养板，吸干多赖，超净台内晾干（2号超净台）2，将HBSS取适量于培养皿中，至于冰上（1号超净台）3，培养基配制（2号超净台）种植液：50mlneurobasal＋1%P/S＋2%B27＋2%谷氨酰胺100×＋5%血清培养液：50mlneurobasal＋1%P/S＋2%B27＋2%谷氨酰胺100×＋2%血清（血清可以不加）4,3cm培养皿中加入2ml0.25%胰酶，放入培养箱中5，取1.5mlEP管4倍数个，分别加入1ml种植液（6条海马1ml）；皮层神经元5mlEP管2个（2半皮层2ml），分别加入2ml种植液。
放入培养箱中。
6，将晾干培养板用PBS或超纯水洗两遍，吸干，加入适量种植液7，取脑：去脑膜，分离海马皮层8，消化：海马一皿，消化13分钟，皮层用纤维镊夹碎，消化15分钟（9，中和洗涤：将皿稍倾斜，吸取组织至装有种植液的EP管中，上下颠倒洗涤，取沉淀再洗涤3次，取沉淀至第四管中，用1ml移液器吹散，轻柔，吹至无可见的组织块，若仍有组织块吹不散可用500rpm离心2-3分钟，取上清。
世界上最完善最详细的神经元原代培养完全黄金版讲解
世界上最完善最详细的神经元原代培养完全黄金版[精华]序言：国内外关于原代培养有很多文献，不幸的是，没有一篇是详细的，没有一篇解答过why. 为了让大家少走弯路，根据我杀过3000只老鼠的经验，我把我这几年摸索的经验和大家分享，请求多投几票得几个叮当。
相信你follow我的这篇文章一定会做的很好。
我的标题说的很像吹牛，但是我是严肃认真的说的，I earn it.note:这篇文章全是我个人的经验，99。
9%原创，经过无数失败的到的最完美的原代神经元培养法，除了最后那一副图是来自下面第2行那篇文献，所以我才说是99.9%原创。
（注：附录的图是常用的消化酶对实验的存活率影响，来自下面链接里的文献）另外，成年鼠的原代培养我没有摸索过，推荐一篇文献在我以前的帖子（无需叮当）（/bbs/post/view?bid=156&id=17651341&sty=3）本篇专门讨论胎鼠和新生鼠神经元的原代培养。
1.材料选择。
一定要严格按照国际上，NCBI数据库，其他文献的材料一致。
胎鼠就要胎鼠，新生鼠就要新生鼠，不能混淆。
因为新生鼠有一些受体，在培养的工作中失去功能，会不能再生，比如NMDA受体。
和文献不同会导致错误结论，甚至困惑。
很多人写信问我新生鼠的培养问题，我回答用新生鼠的实验很少，八成是你自己搞错了实验对象，请确认国际上的相关研究文献所用老鼠，再来问我下面的问题。
2，培养基选择（neurbasal/neurobasal-a,invitrogen Co.ltd)。
我强烈不建议用血清培养。
原因是：首先，血清刺激胶质细胞和杂细胞分裂，最后非常影响神经元产量；其次，为了抑制胶质生长，往往要加入阿糖孢苷。
严重的毒性会影响许多灵敏实验；再次，最重要的，血清培养的细胞状态很不均一，从正常到凋亡都有，严重影响试验准确，而无血清专用培养基所有的正常细胞都处于一样的状态，要么都好，要么都差，高度一致。
Invitrogen/GIBCO 无血清培养基neurobasal(neurbasal-A)被认为是最标准，最好的培养基。
大鼠胚胎神经干细胞分离培养及基因感染研究
ｓ ｔ ｕ ｄ ｙ ｏ ｎ ｔ ｒ ｅ ａ ｔ ｉ ｎ ｇ ｓ ｅ ｎ ｓ ｏ ｉ ｒ ｎ ｅ ｕ ｒ ｌ ａ ｄ ｅ ａ ｆ ｎ ｅ ｓ ｓ ． ＭＯ ￣ｏ Ｏ ｓ Ａｆ ｔ ｅ ｒ ｉ ｓ ｏ ｌ ａ ｔ ｅ ｄ ｆ ｒ ｏ ｍ ｆ ｅ ｔ ａ ｌ ｒ ａ ｔ ｈ ｉ ｐ ｐ ｏ ｃ ａ ｍｐ ｕ ｓ ａ ｎ ｄ ｉ ｄ ｅ ｎ ｔ ｉ ｉ ｆ ｄ ｅ ｗ ｉ ｈ ｔ ｎ ｅ ｓ ｉ ｔ ｎ ｉ ｒ ｍｎ ｕ ｎ ｏ ｃ ｙ －
（ Ｄ ｅ ｐ ａ ｒ ｔ ｍｅ ｎ ｔ ｏ ｆ Ｏｔ ｏ ｒ ｈ ｉ ｎ ｏ ｌ ａ ｒ ｙ ｎ ｇ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ ， ｔ ｈ ｅ Ｕ ｎ ｉ ｏ ｎ Ｈ ｏ ｓ ｐ ｉ ｔ ａ ｌ ， Ｔ ｏ ｎ ｇ ｊ ｉ Ｍ ｅ ｄ ｉ ｃ ａ ｌ Ｃ ｏ ｌ ｌ ｅ ｇ ｅ ，
Ｈ ｕ ａ ｚ ｈ ｏ ｎ ｇ Ｕｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ ｆ ｏ Ｓ ｃ ｉ ｅ ｎ ｃ ｅ ａ ｎ ｄ Ｔ ｅ ｃ ｈ ｎ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ ， Ｗｕ ｈ ａ ｎ ， ４ ３ ０ ０ ２ ２ ， Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ ）
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件 。方法 分离 、 培养胎鼠海马组织神经干细胞 ， 并用 巢蛋 白（ ｎ ｅ ｔ ｓ ｉ ｎ ） 免疫荧光组织化学染色鉴定 ； 诱导神经 干细胞
分化 ， 用神经元特异性烯醇化酶 （ ｎ ｅ ｕ ｒ ｏ ｎ ｓ ｐ ｅ ｃ ｉ ｉ ｆ ｃ ｅ ｎ ｏ ｌ ａ ｓ ｅ ， Ｎ Ｓ Ｅ ） 、 胶质纤维酸性蛋 白（ ｇ ｌ ｉ ｌ ａ ｉ ｆ ｂ ｒ ｉ ｌ ａ ｒ ｙ ａ ｃ ｉ ｄ ｉ ｃ ｐ ｒ ｏ ｔ ｅ ｉ ｎ ， Ｇ Ｆ Ａ Ｐ ） 免
小鼠海马神经细胞的分离培养
小鼠海马神经细胞的分离培养刘青青（苏州大学剑桥-苏大基因组资源中心江苏·苏州215123）摘要在发育生物学和神经生物学研究领域，小鼠原代海马神经细胞都是极为重要的细胞材料。
它可用于关键基因及蛋白表达分析、线粒体功能及电生理研究，为神经系统的发育及相关疾病的发生发展提供理论依据。
本研究旨在建立一种高效稳定的小鼠海马神经细胞的分离和培养方法。
关键词海马神经细胞原代细胞培养C57BL/6J小鼠中图分类号：R394.2文献标识码：A体外培养的神经细胞具有不受体内因素干扰，易于观察和造模等优点，目前被广泛应用于神经退行性疾病、缺血性脑血管疾病等神经系统相关疾病的研究。
海马神经细胞包含了神经细胞的大部分类型，体外培养过程中能形成广泛的树突连接。
分离提取小鼠海马神经细胞不仅能达到较高的细胞纯度，且神经细胞具有较高的一致性。
但是由于神经细胞是高度分化的细胞，体外培养生长缓慢且不能传代，因此掌握一种高效稳定地分离培养原代海马神经细胞的方法尤为重要。
本研究提供了一种分离培养海马神经细胞的方法，该方法可重复性好，获取的神经细胞生长及突触延展状态良好。
1材料与方法1.1材料与仪器小鼠脑切片模具、剃须刀片、眼用手术剪和镊子、离心管、细胞培养皿、1mL和5mL无菌注射器、台式离心机、显微镜、体视显微镜、超纯水机、高压灭菌锅、pH计、细胞培养箱1.2试剂Neurobasal medium（NBM）、B27supplement（50×）、DMEM/F12、FBS、PBS、100×双抗、0.22m过滤器购自Thermo Fisher Scientific；Papain、Trypsin inhibitor、poly-D-lysine （PDL）、2-Amino-5-phosphonopentanoic acid（APV）、BSA、L-Cysteine、D-glucose、Sucrose、Hepes购自Sigma公司；NaOH、NaCI、KCI、Na2HPO4、KH2PO4购自国药化学试剂公司。
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［作者简介］李玉（1965～），男，云南昆明市人，医学硕士，副教授，主要从事癫痫外科和功能神经外科临床研究工作.昆明医学院学报2011，（5）：17～19Journal of Kunming Medical UniversityCN 53-1049/R胎鼠海马神经元培养及其鉴定李玉1），王波1），但齐琴2）（1）昆明医学院第一附属医院神经外科，云南昆明650031；2）昆明医学院神经科学研究所，云南昆明650031）［摘要］目的建立胎鼠海马神经元体外培养方法，观察细胞生长情况，免疫组织化学染色鉴定神经元特异性．方法取胎鼠海马，分裂获得细胞悬液，接种于24孔板，经2h 差速帖壁去除成纤维细胞，将细胞液转移并继续培养，以获娶纯度较高的海马神经元．培养第5、11、15天观察细胞和突起生长情况，用NeuN 抗体以免疫组化SP 二步法染色鉴立神经细胞．结果培养头3d ．细胞生长缓慢，5d 时细胞开始生长，可见突起，11d 时突起连成网状．经Neun 染色培养细胞呈阳性反应，证明是神经元．结论本方法获取生长良好，纯度较高的海马神经元．［关键词］胎鼠；海马神经元；Neun ；培养［中图分类号］Q831.1+1［文献标识码］A ［文章编号］1003－4706（2011）05－0017－03I dent ificat ion and Cult ur e of Hippocampus Neur ons in Fet al Rat sLI Yu 1），WANG Bo 1），DAN Qi －qin 2）（1）Deat.of Neurosurgery ；2）Institute of Neuroscience ，Kunming Medical University ，Kunming Yunnan 650031，China ）［Abstract ］Objective To establish the protocol for culturing hippocampus neurons in vitro and explore theneuronal growth character istics ．Methods Tissues from hippocampus of fatal rats were harvested ，then digested into cell suspension by using 0.125%trypsin ．After planted into wells for 2hours ，cell suspension was transferred into next well for continuing incubation ．The cell growth was observed at day 5，11and 15．Neurons specific Enolase （NSE ）antibody ，recognized specifically NSE antigen in cultured cells ，was used to identify neurons by SP-two-step staining method ．Results After incubated for 2hours ，transferred suspensions in wells showed some pure neurons ，which is identified by NSE staining ．However ，they grew slowly during 1～3days ，then grew well from 5th day ，with gradual increasing the neuritis outgrowth ．Conclusion Purified neurons with neurite outgrowth states can be acquired by this method.［Key words ］Fetal rats ；Hippocampus neurons ；NSE staining ；Culture 海马神经元细胞培养是研究神经细胞生物学特性和外源干扰因素作用（细胞因子）的有效细胞模型，其在神经生物学，发育生物学体外实验研究中已被广泛应用[1-3]．然而，要获得纯度较高，生长状态较好的海马神经元也不是一件易事．本实验长期从事海马神经细胞生物特性及其应用研究，故需建立该细胞模型．鉴于胚胎来源的细胞生长状态较成年动物来源者好[4，5]．本实验建立大图1培养海马神经元（×200）Fig.1Cult ur ed hippocampus neur ons（×200）A:24h；B:5d；C:11d.第32卷昆明医学院学报18鼠胚胎源性海马神经元的体外培养纯化方法，观察其生长特性．1材料与方法1.1海马细胞获细胞悬液制备与细胞培养SD孕鼠腹腔注射麻醉后，开腹取子宫获取胎鼠．无菌条件下，取断头置75%乙醇进一步消毒，生理盐水冲洗后打开颅骨去除大脑皮质，暴露海马．取出海马，去除被膜，用组织剪剪碎组织，0.125%胰蛋白酶37℃消化15min，1000 r/min离心10min去上清，加血清终止反应．PBS洗3次收集组织，用吸管反复吹打30～50次制成细胞悬液，计数细胞，调整细胞密度为6×105个/mL按种于24孔培养板．继续培养2h让成纤维细胞差速先贴壁后，将培养液移入另一培养板继续培养纯化神经元．1.2形态学观察显微镜下于24h，5d、11d，15d分别观察细胞生长状态．描记神经突起生长情况．1.3免疫组织化学染色为证明培养细胞是神经元，采用神经元特异标记物神经元特异烯醇化酶进行染色．免疫组化染色步聚如下：（1）将培养细胞用100%乙醇固定10min，PBS洗5min×3次．3%H2O2室温孵育30min去除内源性过氧化物酶．PBS洗5min×3次；5%羊血清（0.3%Triton PBS配制）室温封闭30min以减少排特异背景染色．加第一抗体神经元特异烯醇化酶（chemicon，1:1000）4℃冰箱孵育18～24h．PBS洗5min×3次，加入二步法PV9000试剂I，37℃孵育30min；PBS洗5mi-n×3次．加入PV9000试剂II37℃孵育30min．PBS洗5min×3次，DAB综色反应显色．70%，80%，90%，100%I，100%II梯度酒精透水；二甲苯I，II透明2次，每次30min，中性树胶封片．镜下观察染色部位．2结果2.1胎鼠海马神经元形态学变化从胚胎内取出的胎鼠海马神经元用胰蛋白酶消化后接种于培养板，在显微镜下观察可见：细胞呈球型，胞体透明，折光性好．接种24h后，细胞开始贴壁，但生长不快，至第5天才可见神经元长出明显突起，有的有胞体1倍长，有的则较短．继续培养至第11天观察，神经细胞胞体形态未发生明显变化，但神经突起明显增长，相互联成网状．突起可达胞体4～5倍长，与5d组比神经突起长度明显增加．15d时细胞生长状态较好，与11d比类似，但神经突起长度和进度进一步增加（见图1）．CA B2.2免疫组织化学染色结果神经元特异烯醇化酶染色显示，培养海马神经元胞体和突起均呈阳性染色，说明培养细胞是神经元（见图2）.3讨论本实验中，笔者观察了大鼠胚胎源性海马神经元的体外生长过程，发现胎鼠海马神经元体外图2海马神经元特异烯醇化酶染色（×400）Fig.2Enolase specific st aining for neur ons in hippocampus （×400）李玉，等．胎鼠海马神经元培养及其鉴定19第5期生长良好．尽管头3d 生长缓慢，但是第5天已可见清晰的神经突起，有的长达胞体2倍以上．通过与本室另一组培养成年海马神经元的实验比较，发现胎鼠海马神经较成年海马神经元生长块，且纯度较高．特别是通过差速2h 贴壁纯化后，5d 就凡乎看不到成纤维细胞生长．由于本实验中培养的海马神经元较为干净，且5d 时细胞之间尚未联成网状，故计数和测量神经突起均较容易，是研究其外源因素干预促进突起生长的良好时期．而随着培养时间延长，至第11天时，细胞生长呈现网状边接，神经细胞生长状态良好，胞体和突起清晰可持续．由于此时神经元突起刚好生长联成网状，因此将其用于研究抑制神经突起生长干扰因素较为可行．本实验建立的海马神经元体外细胞模型为研究海马细胞体外生物学特性和加入细胞因子研究其对神经元生长的影响[6，7]奠定了基础．本实验中，为了鉴定培养神经元的特异性，我们用神经元特异烯醇化酶染色进行鉴定神经元，结果发现培养细胞均是阳性，说明培养细胞是神经元．神经元特异烯醇化酶是神经元的特异标记物[8]，已广泛用于神经细胞鉴定．从本实验结果看，所培养细胞是神经元，而且纯度较高．本实验不仅获得了纯度较高的海马神经元，而且其生长良好，可用于神经元存活和神经生长的相关研究．［参考文献］［1］王英，车宇，苗建亭，等．新生大鼠海马神经元原代培养方法的实验研究.细胞与分子免疫学杂志［J ］．细胞与分子免疫学杂志，2003，19（2）：197－198．［2］周明，聂箐，吕诚，等．一种大鼠海马神经元的原代培养方法［J ］．南昌大学学报（医学版），2010，50（3）：1－3．［3］TANAKA H ．Culturing hippocampal neurons ［J ］．Nippon Yakurigaku Zasshi ，2002，119（3）：163－166.［4］李劲涛，黄桂琴，王廷华，等．GFP 转基因胚胎小鼠海马神经元培养方法的建立［J ］．昆明医学院学报，2006，27（6）：23－26．［5］刘佳，罗湘颖，杨志敏，等．新生大鼠中枢神经系统不同区域细胞生长的形态学比较研究［J ］．昆明医学院学报，2006，27（6）：27－29．［6］M ARCONI P ，SIM ONATO M ，SZUCCHINI G ，et al ．Re-plication-defective herpes simplex virus vectors for neurotrophic factor gene transfer in vitro and in vivo ［J ］．Gene therapy ，1999，6（5）：904－910.［7］张惊宇，赵节绪．表达大鼠脑源性神经营养因子腺相关病毒（rAAV-BDNF ）对体外培养海马神经元保护作用的研究［J ］．中国免疫学杂志，2008，24（12）：1100－1102．［8］陈瑞庆．冰冻切片检测大鼠脊髓组织NSE 和NF 的表达［J ］．福建医药杂志，2009，31（5）：77－78．（2011－03－14收稿）。