实验八 荧光光光度法测定核黄素的含量

实验八 荧光光度法测定核黄素的含量（见教材p118）
一. 实验目的
1. 了解荧光法测定核黄素的原理和方法；
2. 学习荧光光度计的操作和使用。

二. 实验原理
某些具有π-π电子共轭体系的分子易吸收某一波段的紫外光而被激发，如该物质具有较高的荧光效率，则会以荧光的形式释放出吸收的一部分能量而回到基态。

建立在发生荧光现象基础上的分析方法，称为分子荧光分析法，而常把被测物称为荧光物质。

在稀溶液中，荧光强度I F 与入射光的强度I 0、荧光量子效率ϕF 以及荧光物质的浓度c 等有关，可表示为I F =K ϕF I 0εbc 。

式中为比例常数，与仪器的参数固定后，以最大激发波长的光为入射光，测定最大发射波长光的强度时，荧光强度I F 与荧光物质的浓度c 成正比。

核黄素（维生素B 2）是一种异咯嗪衍生物，它在中性或弱酸性的水溶液中为黄色并且有很强的荧光。

这种荧光在强酸和强碱中易被破坏。

核黄素可被亚硫酸盐还原成无色的二氢化物，同时失去荧光，因而样品的荧光背景可以被测定。

二氢化物在空气中易重新氧化，恢复其荧光，其反应如下：
核黄素的激发光波长范围约为440—500nm （一般为440nm ），发射光波长范围约为510—550nm （一般为520nm ）。

利用核黄素在稀溶液中荧光的强度与核黄素的浓度成正比，由还原前后的荧光差数可进行定量测定。

根据核黄素的荧光特性亦可进行定性鉴别。

注意：在所有的操作过程中，要避免核黄素受阳光直接照射。

N N
NH
N
O O C H 3C H 3OH O H OH OH N N H NH N H O
C H 3C H 3OH
O
H OH OH ＋2H
三. 仪器与试剂
1. 实验试剂：核黄素标准品；冰醋酸；核黄素药片；连二亚硫酸钠（保险粉）或亚硫酸钠
2. 实验仪器：荧光光度计（F-2500型）天平（感量0.0001g）
3. 实验器材
普通试管：25mL×9
容量瓶：100mL×1
移液管：10mL×1 5mL×1 1mL×1
烧杯：50mL×1
滤纸：9cm
研钵、漏斗、洗瓶、洗耳球、试管架、移液管架、玻棒：各1
四. 实验内容
1. 核黄素标准液（4×10-6g·mL-1）
准确称取核黄素4mg，加5mL冰醋酸和适量蒸馏水，置水浴中避光加热直
至溶解。

冷却至室温，用蒸馏水定容至1000mL。

转入棕色瓶中。

2. 样品液的制备
为了消除药片之间的差异，可取几片药片一起研磨，然后取部分有代表性
的样品进行分析。

将5片核黄素药片称量后磨成粉末，然后从中准确称取1-2mg有代表性的
样品，加0.5mL冰醋酸和适量蒸馏水，置水浴中避光加热直至溶解。

冷却至室温，用蒸馏水定容至100mL（如果有沉淀，迅速通过定量滤纸干过滤，用该滤
液在与标准溶液同样条件下测量核黄素的荧光强度）。

转入棕色瓶中。

作样品待
测液备用。

3. 绘制核黄素的激发光谱和荧光光谱
1）.固定激发波长λex（Excitation spectra）为440nm,在460-660nm处测定荧
光强度，得溶液的发射光谱，在520nm处得最大发射波长λem。

2）.再固定发射波长λem（emissionspectra）为520nm，测定激发波长λex
为400-500nm处荧光强度，得溶液的激发光谱，在440nm处得最大激发波长λex。

4. 标准曲线制作及样品测定
取8支试管，按下表所示顺序操作。

管号操作
标准核黄素浓度梯度样品1 2 3 4 5 6 ⅠⅡ
核黄素标准液
(mL)
0.25 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50
样品待测液(mL) 10.00 10.00 蒸馏水(mL) 9.75 9.50 9.00 8.50 8.00 7.50
荧光测定激发波长= 440nm，发射波长=520 nm，分别测定各管的荧光强度。

F1
还原反应
在各管中分别加入约10mg的连二硫酸钠或亚硫酸钠，混合溶解后，立即重新测定荧光强度F2
F2
注意：在测定中如果待测样品溶液的荧光强度超出100%，则需要再行稀释，并记录稀释倍数。

五. 结果处理
1. 从绘制的激发光谱和荧光光谱曲线上，确定它们的最大激发波长和最大发射波长。

2. 由1～6号管的数据，以核黄素含量(10-6g·mL-1)为横坐标，F值（F1-F2）为纵坐标，在坐标纸上绘制标准曲线；
3. 求两个样品管F的平均值—F；
4. 由—
F从标准曲线中求样品管中核黄素的含量(10μg·mL-1)；
5. 计算药片中核黄素的含量（单位用g/g鲜重），并将测定值与说明书上的值比较。

六. 注意事项
1.在所有的操作过程中，避免核黄素受阳光直接照射。

2. 使用石英样品池时，应手持其棱角处，不能接触光面，用毕后，将其清洗干净。

3. 影响荧光强度的因素很多，每次测定的条件很难完全控制一致，因此每次必须做工作曲线，且标准曲线最好与样品同时做。

F-2500分子荧光光度计操作规程
1 . 先打开仪器主机，打开电脑
2 . 点击桌面FL－Solutions
3 . 寻找激发波长：放入样品，寻找激发波长，点击Method ，出现对话框，点击General ，在Measurement 中选择wavelength scan ，点击Instrument ，在scan mode 中选择Excitation ，在data mode 中只选Fluorescence，在EM WL 中输入发射波长数值（520nm）。

在EX start 中输入激发起始波长(400nm)，在EX end WL 中输入激发终止波长(500nm)。

点击确定即可得到荧光物质的激发光谱曲线。

4. 寻找发射波长：同上法。

在scan mode 中选Emission。

在data mode 中只选Fluorescence，在EX WL中输入激发波长数值（440nm）。

在EM start 中输入发射起始波长(460nm)，在EM end WL 中输入发射终止波长(600nm)。

点击确定即可得到荧光物质的发射光谱曲线。

5. 将样品放入，在scan mode 中选Emission。

在data mode 中只选Fluorescence，在EX WL中输入激发波长数值（440nm）。

在EM start 中输入发射起始波长(460nm)，在EM end WL 中输入发射终止波长(600nm)。

点击确定即可得到荧光物质的发射光谱曲线。

记录在520nm处的荧光值F1。

加入10mg 的连二硫酸钠或亚硫酸钠，混合溶解后，立即重新测定相对荧光强度F2
6. 在完成测量之后，关闭仪器按下列步骤执行。

（1）从文件菜单（F）中，选择退出（X）指令。

⊙close the monitor window , but keep lamp operating?
Ｏclose the lamp，then close the monitor window.
选择yes，FL Solutions 程序将终止。

（2）关闭光度计的电源开关。

（3）点击Windows98 的开始按钮，选择关机（U），在关机窗口对
话框中，选择“关机“OK”按钮。

（4）关闭计算机和显示器电源（在③步中，计算机能通过某些设
定来关闭）。

（5）关闭打印机。

注：1、关灯：使用以上指令来关闭氙灯，为了再次打开氙灯，必须重新启动光度计。

2、狭缝宽度一般为5 nm 或10 nm ，如果改变狭缝宽度时先选定狭缝宽度，光栅自动关闭，自动调零。