细胞冻存与复苏步骤、原理及注意事项
实验十一、细胞的冻存与复苏
实验十一、细胞的冻存与复苏细胞的冻存与复苏是一种有效的保存和传播生物样品的方法。
该方法可以通过冷冻和贮存，将生物样品保存到未来任意时候使用。
本实验将介绍细胞的冻存和复苏实验步骤及注意事项。
实验步骤：1. 细胞的收集和分装首先，需要使用无菌采集工具收集待冻存细胞，如细胞培养板上的细胞。
然后，将细胞分装到无菌冷冻管中。
注意，每个冷冻管中应该放入适量的细胞，并确保其密封性。
2. 冷冻将装有细胞的冷冻管放入无菌水浴中，降温至-80℃或更低温度。
然后，将冷冻管转移到液氮罐中，进行长期保存。
3. 冻存的解除和复苏在复苏前，需要进行以下步骤：① 快速去除细胞上的冷冻剂：将冷冻管直接转移到37℃预热好的培养基中，震荡或轻轻地摇晃，使其中的冷冻剂快速融化。
② 细胞生长：将冻存细胞转移到新的培养板中，并添加适量的培养基。
然后将培养板放入培养箱中，进行细胞的生长。
注意事项：1. 冷冻剂的熟练使用DMSO是一种常用的冷冻剂，其作用是帮助细胞避免冷冻伤害。
然而，DMSO也具有一定的毒性。
因此，在使用过程中，需要注意浓度的控制以及操作时的保护措施。
2. 细胞处理的无菌性细胞的无菌性是决定细胞冻存和复苏成功的关键。
在操作期间，需要保持实验环境的无菌性，并避免细胞样品受到污染。
3. 冷冻剂和液氮的注意事项冷冻剂和液氮是极冷的物质，具有很强的腐蚀性和危险性。
在操作过程中，需要戴上手套和护目镜等防护器具，避免皮肤接触。
同时，要注意放置位置，避免冷冻剂和液氮的泄漏。
总结：细胞的冻存和复苏是一种非常有用并且实践的实验方法。
如果正确操作和保护，可以保证样品的保存和传播，并且为后续的实验提供便利。
细胞冻存与复苏步骤原理及注意事项
培养细胞的冷冻保存与复苏⏹概述✧冻存过程⏹冷冻保存与复苏的原理✧冻存结果♦冷冻速率✧讨论♦冷冻保存温度⏹冻存细胞的复苏♦复温速率♦非玻璃化冻存细胞的复苏♦冷冻保护剂✧主要材料⏹冷冻保存方法✧复苏过程♦非玻璃化冻存方法✧结果✧主要材料✧讨论✧冻存过程♦玻璃化冻存细胞的复苏✧冻存结果✧主要材料✧讨论✧复苏过程♦玻璃化冻存方法✧结果✧主要材料✧讨论⏹Ｐolge等人(１9４9)发现了甘油对低温下贮存的细胞具有保护作用,她们仍然以精子进行研究发现,加入甘油能够大大提高贮存于-７９0C下精子的存活率。
接下来的重大进展就是Luyｅｔ(１9５1)与Ｌoveｌock(1953)等多位学者发现了电解质浓度对贮存细胞的损伤作用。
她们的结论就是,电解质浓度增大就是造成贮存细胞损伤的主要原因。
冷冻理论后来得到Ｍerryman(１９5６)、Reｙ(195７)以及Ｓmｉtｈ(1９61)等学者的继续与发展。
１94９年至1９６0年这一段时间可以称为冷冻保存的“甘油时期”,这一时期对生物材料的冷冻保存一般都就是以甘油作为保护剂。
Lovｅｌock(１95９)等人发现了一种新的化学保护剂,这就就是人们熟悉的二甲基亚砜(ＤMSＯ)。
而且,用于冷冻保存的仪器也有明显的发展。
目前,无论就是冷冻保存理论、各种保护剂、冷冻用品与设备以及各种生物材料的保存与复苏技术都已十分成熟与完备。
返回页首⏹冷冻保存与复苏原理在低于-70０C的超低温条件下,有机体细胞内部的生化反应极其缓慢,甚至终止。
水在低于零度的条件下会结冰。
如果将细胞悬浮在纯水中,随着温度的降低,细胞内外的水分都会结冰,所形成的冰晶会造成细胞膜与细胞器的破坏而引起细胞死亡。
这种因细胞内部结冰而导致的细胞损伤称为细胞内冰晶的损伤。
如果将细胞悬浮在溶液中,随着温度的降低,细胞外部的水分会首先结冰,从而使得未结冰的溶液中电解质浓度升高。
如果将细胞暴露在这样高溶质的溶液中且时间过长,细胞膜上脂质分子会受到损坏,细胞便发生渗漏,在复温时,大量水分会因此进入细胞内,造成细胞死亡。
细胞学堂｜细胞冻存与复苏的技术原理和操作步骤
细胞学堂｜细胞冻存与复苏的技术原理和操作步骤细胞冻存与复苏是一种常用的细胞保存方法，用于长期保存细胞并保持其生理活性。
下面将详细介绍细胞冻存与复苏的技术原理和操作步骤。
技术原理：细胞冻存是通过将细胞在低温下快速冷冻，并加入保护剂以减少冷冻引起的细胞损伤，从而降低细胞的新陈代谢活动，保持细胞的生命特性。
具体原理如下：1.冷冻缓慢升温原理：冷冻过程中细胞内水分形成冰晶，容易损伤细胞结构。
为了降低损伤，冷冻时的降温速率应尽量缓慢。
而复苏时，也需要采取缓慢升温的方法，以避免溶解冰晶时造成的细胞破坏。
2.保护剂的添加：在冷冻过程中，加入一定浓度的保护剂能够防止细胞水分快速冻结而形成冰晶，从而减少冷冻引起的细胞膜和细胞器损伤。
一般常用的保护剂有甘露醇、二甘醇和甘油等。
操作步骤：下面将介绍细胞冻存与复苏的具体操作步骤：1.细胞选择与培养：选择要冻存的细胞，并保证细胞处于健康和活跃状态。
采用无菌操作，将细胞培养在适当的培养基中，并严格控制培养条件。
2.细胞冻存液的配制：将适当的冻存液配制好。
一般的冻存液组成包括培养基、胎牛血清/胎儿犊牛血清、20%-50%的甘油或其他保护剂。
保护剂的浓度取决于细胞的类型和耐受性。
3.细胞冻存：将培养好的细胞用冻存液冷冻保存。
首先，用培养基洗涤细胞，去除残留的培养基。
然后，添加冻存液，将细胞悬浮均匀。
最后，将细胞悬液装入标记好的冻存管中，并缓慢冷冻至-80℃或液氮中。
4.细胞复苏：将冷冻的细胞迅速取出，用温暖的手掌加热，迅速溶化冰晶。
将细胞悬液转移到离心管中，并加入预先配制好的培养基。
然后，用离心机离心，除去冻存液或保护剂。
最后，加入适当的培养基，将细胞继续培养。
5.细胞复苏后培养条件的控制：在细胞复苏后的培养过程中，需要严格控制培养条件，包括温度、CO2浓度、培养基成分和营养物质的供给等，以确保细胞能够正常生长和繁殖。
总结：细胞冻存与复苏是一种常用的细胞保存技术，可以长期保存细胞并保持其生理活性。
细胞复苏与冻存
慢冻快溶
细胞复苏的操作步骤：
1：从液氮保存罐中取出冻存管，立即放入37度水浴中，一般用烧杯倒入蒸馏水，然后放入水浴锅中预热，防止水浴锅中水污染细胞，将冻存管竖起，快速摇晃，直至冻存液完全融化。
2：将细胞悬液移入离心管，缓慢加入4ml 培养液，离心1000转每分钟，离五分钟。
3：将离心后的上清液吸出，加入PBS 清洗一下细胞，减少DMSO 对细胞的毒性作用，缓慢捶打均匀，然后离心。
4：将上清吸出，用培养液混匀沉淀的细胞，调整细胞密度，将细胞悬液吸入培养瓶中，再加入新的培养液培养，等细胞贴壁后即换液，以去掉死细胞。
细胞冻存的步骤：
1：将细胞从培养瓶上消化下来，然后加入培养液，混匀后计数，要按照每管冻存管中含有2×10 6个细胞。
2：然后将细胞悬液吸入5ml 离心管中，离心
3：将上面液体吸走，然后按计算结果加入DMEM 缓慢混匀。
4：冻存液的配制，1ml ；600ul10％DMEM 细胞悬液+300ul 血清+100ulDMSO ，
5：然后将混好的液体吸入2ml 冻存管中，冻存，先放入4度冰箱中，然后再放入-20度，最后放入液氮中保存。
简述细胞复苏流程与注意事项
简述细胞复苏流程与注意事项
细胞复苏流程：
1、将冻存的细胞从液氮罐中取出，立即放入37°C的水浴中进行融化，轻柔晃动，加速融化，直到小瓶中只剩下一小块冰，时长应控制在1min 中；
2、用70%乙醇擦拭瓶外后转移无菌操作台中，打开瓶盖前，用酒精灯火焰对瓶口进行消毒；
3、将预加热的新鲜完全培养基滴入小瓶中。
缓慢用移液枪吸取瓶中液体至15ml离心管中，加入适量浓度和体积的完全培养基，轻柔混合均匀；
4、200 ×g左右细胞悬浮液离心5-10分钟。
实际的离心速度和持续时间因细胞类型而异。
弃掉上清，加入新鲜完全培养基重悬细胞，并将其转移到适当的培养容器和推荐的培养环境中。
注意事项：
1、液氮温度低，小心低温对人造成的伤害，在液相中储存的冷冻瓶在解冻时存在爆炸的风险，因此，取出冻存管的时候，要做好个人防护。
2、通常细胞集中储藏在液氮中，取出时应迅速，避免温差对其他冻存
细胞造成影响。
3、复苏细胞的核心技术，简而言之就是快融，将在37°C水浴中快速解冻冷冻细胞(< 1分钟。
4、解冻时，冻存管先放入无菌一次性PE手套中，再放入水中融化，避免污染也方便操作。
5、用预热过的培养基慢慢稀释解冻的细胞。
6、解冻细胞后，在培养皿中培养时，应尽量维持高密度，以提高细胞存活率。
7、注意无菌操作，避免细胞发生污染。
细胞复苏及冻存的实验步骤及注意事项
细胞复苏及冻存的实验步骤及注意事项《细胞复苏及冻存：一场细胞的“冰与火之歌”》在生物实验室这个奇妙的小世界里，细胞的复苏和冻存就像是操纵细胞命运的魔法步骤。
今天呀，我就来给大家唠唠这细胞复苏及冻存的那些事儿，这里面的门道可多着呢，就像走钢丝，容不得半点马虎。
一、细胞复苏的实验步骤和趣事儿步骤一：前期准备像打仗前的粮草筹备在细胞复苏之前，得把“战场”布置好。
先把超净台用酒精仔仔细细地擦个遍，就像给它做个全面的SPA，确保里面一尘不染。
接着，打开水浴锅，把水温调到37℃，这温度可不能出差错，多一度细胞可能就像洗热水澡被烫着了，少一度就像是在冷水里打哆嗦，都不利于细胞恢复生机。
准备好相应的培养液，这就像是细胞的“营养套餐”，没它细胞可活不下去。
步骤二：复苏过程像是拯救冻僵的小生命从液氮罐里拿出冻存管的时候，感觉就像是从冰天雪地的极寒之地营救小生命。
那冻存管冻得直冰手，得迅速放到37℃的水浴锅里快速解冻，要不停地轻轻晃动，就像是在鼓励细胞：“小宝贝们，快快醒来啊！”这时候心里默默祈祷着，可别出啥岔子。
在小细胞们还迷糊着的时候，把它们转移到含有培养液的离心管里，离心的过程又像一场小小的筛选，把那些还没适应过来的杂质去除，留下顽强的细胞。
最后把细胞接种到培养瓶里，就像给它们安家落户啦，盼着它们在新家里茁壮成长。
二、细胞冻存的实验步骤和其中的小纠结步骤一：选择冻存液就像挑选合适的保护铠甲冻存液的配置可是个技术活。
一般是包括培养液、血清和保护剂（像是二甲基亚砜这类的神奇物质）。
血清就像保护层里的柔软衬里，给细胞温暖的呵护，而保护剂则像坚韧的外壳，防止细胞在冷冻过程中被冰晶刺破。
这三者的比例得拿捏得死死的，就像厨师做菜时放盐的量，多一点少一点都不行。
步骤二：缓缓降温像是送细胞进入冬眠把细胞放到冻存管里，标记好细胞类型、日期等信息，这就好比给细胞上户口，省得以后找不到“人”。
然后要进行程序降温。
想象细胞此时就像个准备冬眠的小动物，得一步步慢慢适应越来越冷的环境。
干细胞冻存及复苏步骤
干细胞冻存及复苏步骤
一、干细胞冻存及复苏步骤
1.提取干细胞
(1)首先，从捐赠者身体组织中提取干细胞，比如从头发根部提取毛发内的细胞，或从脐带血中提取干细胞。
(2)使用双曲线增殖诱导方法，通过对提取的干细胞进行双曲线增殖诱导，使其变成能够细胞分裂的干细胞。
2.干细胞细胞系建立
细胞分裂时，可以分离出更多干细胞，将这些干细胞细胞分离出来，再放入相应的培养基中，建立起细胞系。
3.干细胞冻存
(1)在细胞分离时，应当尽快进行冻存，以防止细胞活性下降。
(2)将细胞放入冰淇淋箱，将其温度降至-80℃，然后将其冻存，一般可以保存2-3年。
(3)将细胞放入低温液氮坩埚中冻存，可以保存更久，约10年。
4.干细胞复苏
(1)将细胞从低温冰箱中取出，将其温度升至4℃，然后将其放入相应的培养基中，缓慢地升温，使其复苏。
(2)缓慢地加入相应的培养液，适当的调节成分，使其复苏，并且保持活性。
(3)观察复苏的细胞，观察其繁殖情况，确保细胞复苏的质量。
5.细胞发展
(1)可以使用双曲线增殖诱导方法，结合培养基中的生长因子，诱导细胞进行分化，用于后续的发展。
细胞冻存与复苏步骤、原理及注意事项
培养细胞的冷冻保存与复苏⏹概述✧冻存过程⏹冷冻保存与复苏的原理✧冻存结果♦冷冻速率✧讨论♦冷冻保存温度⏹冻存细胞的复苏♦复温速率♦非玻璃化冻存细胞的复苏♦冷冻保护剂✧主要材料⏹冷冻保存方法✧复苏过程♦非玻璃化冻存方法✧结果✧主要材料✧讨论✧冻存过程♦玻璃化冻存细胞的复苏✧冻存结果✧主要材料✧讨论✧复苏过程♦玻璃化冻存方法✧结果✧主要材料✧讨论⏹Polge等人（1949)发现了甘油对低温下贮存的细胞具有保护作用，他们仍然以精子进行研究发现，加入甘油能够大大提高贮存于—790C下精子的存活率。
接下来的重大进展是Luyet（1951）与Lovelock（1953）等多位学者发现了电解质浓度对贮存细胞的损伤作用。
他们的结论是,电解质浓度增大是造成贮存细胞损伤的主要原因。
冷冻理论后来得到Merryman（1956)、Rey(1957）以及Smith （1961）等学者的继续和发展。
1949年至1960年这一段时间可以称为冷冻保存的“甘油时期”，这一时期对生物材料的冷冻保存一般都是以甘油作为保护剂.Lovelock(1959）等人发现了一种新的化学保护剂，这就是人们熟悉的二甲基亚砜(DMSO）。
而且,用于冷冻保存的仪器也有明显的发展。
目前，无论是冷冻保存理论、各种保护剂、冷冻用品和设备以及各种生物材料的保存与复苏技术都已十分成熟和完备。
返回页首冷冻保存与复苏原理在低于—700C的超低温条件下,有机体细胞内部的生化反应极其缓慢，甚至终止。
水在低于零度的条件下会结冰.如果将细胞悬浮在纯水中,随着温度的降低，细胞内外的水分都会结冰，所形成的冰晶会造成细胞膜和细胞器的破坏而引起细胞死亡。
这种因细胞内部结冰而导致的细胞损伤称为细胞内冰晶的损伤.如果将细胞悬浮在溶液中,随着温度的降低，细胞外部的水分会首先结冰,从而使得未结冰的溶液中电解质浓度升高。
如果将细胞暴露在这样高溶质的溶液中且时间过长，细胞膜上脂质分子会受到损坏,细胞便发生渗漏，在复温时，大量水分会因此进入细胞内，造成细胞死亡.这种因保存溶液中溶质浓度升高而导致的细胞损伤称为溶质损伤或称溶液损伤.当温度进一步下降，细胞内外都结冰,产生冰晶损伤.但是如果在溶液中加入冷冻保护剂，则可保护细胞免受溶质损伤和冰晶损伤.因为冷冻保护剂容易同溶液中的水分子结合，从而降低冰点,减少冰晶的形成，并且通过其摩尔浓度降低未结冰溶液中电解质的浓度，使细胞免受溶质损伤，细胞得以在超低温条件下保存.在复苏时，一般以很快的速度升温，1-2分钟内即恢复到常温，细胞内外不会重新形成较大的冰晶，也不会暴露在高浓度的电解质溶液中过长的时间,从而无冰晶损伤和溶质损伤产生，冻存的细胞经复苏后仍保持其正常的结构和功能。
细胞冻存与复苏步骤原理及注意事项
细胞冻存与复苏步骤原理及注意事项细胞冻存是指将活体细胞暂时停止其代谢活动，并在低温下保存，以便今后可以复苏和继续进行研究。
这项技术对于维持细胞的长期保存和保护遗传材料非常重要。
步骤：1.细胞培养和准备：选择合适的细胞培养基和培养条件，使细胞处于最佳状态。
2.冻存液制备：制备一种含有细胞生长因子、保护剂（例如DMSO或甘油）以及缓冲剂（例如BSA或EDTA）的冻存液。
3.细胞收集和离心：将培养好的细胞通过离心来收集细胞沉淀。
4.细胞冻存和保存：将收集到的细胞与冻存液混合，将混合液分装到冷冻管中，并在极低温下保存（通常为-80°C或液氮温度）。
复苏：1.细胞溶解和补充：将冷藏的细胞迅速解冻，并将其加入到预先准备好的培养基中。
2.培养和观察：将复苏后的细胞转移到培养皿中，并在适当的条件下培养。
观察细胞的生长和形态变化。
原理：细胞冻存的原理是通过降低细胞内温度来减缓或暂时停止细胞代谢活动。
冷冻液中的保护剂可减少细胞冷冻过程中的冻伤，防止细胞膜的破裂和细胞器的破坏。
细胞冷冻过程中，细胞内的水会形成冰晶，但保护剂的存在可以防止冰晶对细胞结构的破坏。
当细胞需要复苏时，通过迅速解冻并将细胞转移到适当的培养基中，细胞可以恢复其生理功能并继续生长和分裂。
注意事项：1.使用无菌的实验室条件和器具来避免细胞冻存和复苏过程中的污染。
2.选择适当的冻存液和培养基，以确保细胞的最佳保护和生长条件。
3.控制冷冻和解冻速率，过快或过慢的速率都可能对细胞造成伤害。
通常使用准备好的细胞冷冻容器或慢速冷却设备来控制速率。
4.正确选择适合冷冻保存的细胞类型。
不同细胞可能对冷冻敏感性有所差异。
5.注明冷冻细胞的信息，例如细胞类型、冷冻日期、冻存液配方等，以便于后续的管理和查询。
细胞复苏、传代、冻存过程
细胞复苏、传代、冻存过程引言细胞复苏、传代和冻存是细胞实验中常见的操作流程。
细胞复苏指的是从冻存状态下恢复细胞的生长和功能，传代是将细胞进行繁殖，冻存则是将细胞保存在极低温下，以便长期保存和后续使用。
下面将详细讨论这些过程。
细胞复苏 Process of Cell Revival材料和设备•冻存管：包含冻存细胞的管子•暖水槽：设置在37°C的恒温水槽内•柱塞：用于搅动和混合细胞悬液•无菌培养皿•无菌培养基步骤1.将冻存管取出放在暖水槽中，快速融化冰冻细胞。
2.将融化的细胞悬液转移到无菌培养皿中。
3.加入预热的培养基，使细胞悬液与培养基充分混合。
4.将细胞培养皿放入培养箱中，维持37°C的恒温和5% CO2的含氧条件。
5.定期观察细胞的生长情况。
细胞传代 Process of Cell Passage材料和设备•细胞培养皿：含有生长的细胞•无菌培养基•显微镜•无菌移液器•15ml离心管•离心机步骤1.将培养皿放在显微镜下，观察细胞的生长情况和密度。
2.用无菌移液器将培养基吹洗细胞，移除老化细胞和细胞碎片。
3.将细胞用预热的无菌培养基均匀混合。
4.用无菌移液器将细胞和培养基移入新的细胞培养皿中。
5.定期检查和记录细胞的生长情况和数量。
冻存细胞 Process of Cell Cryopreservation材料和设备•细胞培养皿：含有生长的细胞•冻存液：包含细胞冻存所需的成分•冻存管•冷冻容器：用于储存冻存管的液体氮罐•标签：用于标记冻存管步骤1.将培养皿放在显微镜下，观察细胞的生长情况和密度。
2.用无菌移液器吹洗细胞，并移除老化细胞和细胞碎片。
3.用预热的无菌培养基将细胞均匀混合。
4.将混合的细胞和冻存液按照特定比例混合。
5.将混合液转移至冻存管中，并封闭管盖。
6.标记冻存管上的信息，包括细胞类型、传代数和日期。
7.将冻存管放入冷冻容器中，迅速冷冻至-80°C或更低温度。
细胞冻存与复苏
细胞冻存与复苏高博，苏州大学医学部药学院药理学系冻存（1）传统方法：冷存管置于4℃，10 min→ -20℃，30 min→ -80℃ 16～18 h（或隔夜）→液氮罐长期储存。
-20℃不可超过1 h，以防止冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。
（2）程序降温：利用已设定程序的等速降温机以-1～-3℃/min之速度由室温降至（-80℃以下）-120℃，再放在液氮罐中长期储存。
适用于悬浮型细胞与杂交瘤之保存。
一、步骤：（1）冷冻前一日前更换半量或全量培养基，观察细胞生长情形。
（2）配制冷冻保存溶液（使用前配制）：将DMSO加入新鲜培养基中，终浓度为10 %，混合均匀，置于室温下待用。
（3）依细胞传代培养操作，收集培养细胞，取少量细胞悬浮液（约0.1 ml）计数细胞浓度及冻前存活率。
（4）离心，去除上清液，加入适量冷冻保存溶液，使细胞浓度为1～5×106 cells/ml，混合均匀，分装于已标示完全之冷冻保存管中，1 ml/vial，并取少量细胞悬浮液作污染检测。
二、注意事项：（1）欲冷冻保存之细胞应在生长良好（对数生长期，logphase）且存活率高之状态，约为80～90%致密度。
（2）冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质，例如杂交瘤应在冷冻保存前一至二日测试是否有抗体之产生。
（3）注意冷冻保护剂之品质。
DMSO应为试剂级等级，无菌且无色（以0.22 micron FGLP Telflon过滤或是直接购买无菌产品，如Sigma D-2650），以5～10 ml小体积分装，4℃避光保存，勿作多次解冻。
甘油（Glycerol）亦应为试剂级等级，以高压蒸汽灭菌后避光保存。
在开启后一年内使用，因长期储存后对细胞会有毒性。
复苏1、从液氮中取出冻存管、迅速置于37℃温水中并不断搅动。
使冻存管中的冻存物在1 min之内融化。
2、打开冻存管，将细胞悬液吸到离心管中。
细胞冻存和细胞复苏的方法步骤
细胞冻存和细胞复苏的方法步骤细胞冻存是将细胞保存在极低的温度下，以延缓其新陈代谢过程，从而达到长期保藏的目的。
细胞复苏则是将冻存的细胞重新恢复到正常生活状态的过程。
下面将详细介绍细胞冻存和细胞复苏的方法步骤。
细胞冻存的方法步骤：1.细胞培养：首先，需要获得足够数量和质量的细胞进行冻存。
通过细胞培养技术，将细胞培养在含有适当营养物质的培养基中，使其生长繁殖。
2.细胞分离和检测：将细胞从培养基中分离出来，并进行质量检测，确保细胞的纯度和活力。
3.冻存液的制备：制备适当的冻存液，通常是含有细胞保护剂的冻存液，可以起到保护细胞免受低温伤害的作用。
4.冻存管的准备：准备干净的冻存管，并确保管内没有污染物。
5.细胞冻存：将细胞悬浮液和冻存液混合，将混合液加入冻存管中。
随后，将管子放入冷冻器中，逐渐降低温度，使其达到细胞存活所需的最低温度，通常为液氮温度（-196℃）。
6.冻存管理：冻存后的细胞需要进行管理，包括记录存储位置、维护存档和监测保存条件等。
细胞复苏的方法步骤：1.细胞解冻：将冻存管从液氮中取出，迅速放入37℃的温水中，并轻轻摇晃，以加快冻存液的溶解。
待细胞解冻完成后，立即将细胞转移到含有培养基的离心管中。
2.细胞复苏培养：将细胞悬浮液转移到培养基中，然后放入培养箱中进行培养。
培养基的组成与之前的培养条件相似，以帮助细胞适应新的环境。
3.细胞复苏检测：在细胞复苏后的一段时间内，需要对细胞进行监测和检测，包括细胞存活率、生长状况、形态特征等。
4.细胞复苏管理：对细胞进行管理和维护，包括定期更换培养基、检测细胞的多项指标、记录细胞的生长状态等，以确保细胞的健康状态和长期保存。
细胞冻存和细胞复苏的方法步骤需要严格控制和执行，以保证细胞的活性和质量。
冻存和复苏过程中的温度、冻存液的配方、时间等因素都会对细胞的生存和恢复产生影响，因此，在实施这些方法时需要权衡各种参数，并根据具体情况进行调整和优化。
同时，冻存和复苏过程中的操作要保持无菌、无污染，以保证细胞的无菌状态和纯度。
细胞冻存(Cell Freezing)和复苏技术原理和操作步骤
细胞冻存（Cell Freezing）和复苏技术原理和操作步骤一、原理在不加任何条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水都会形成冰晶，能导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、PH改变、蛋白变性等，能引起细胞死亡。
如向培养液加入保护剂，可使冰点降低。
在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水份在冻结前透出细胞。
贮存在－130℃以下的低温中能减少冰晶的形成。
细胞复苏时速度要快，使之迅速通过细胞最易受损的－5～0℃，细胞仍能生长，活力受损不大。
目前常用的保护剂为二甲亚砜（DMSO）和甘油，它们对细胞无毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细胞。
二、操作步骤（一）冻存1、消化细胞，将细胞悬液收集至离心管中。
2、1000rpm离心10分钟，弃上清液。
3、沉淀加含保护液的培养，计数，调整至5×106/ml左右。
4、将悬液分至冻存管中，每管1 ml。
5、将冻存管口封严。
如用安瓿瓶则火焰封口，封口一定要严，否则复苏时易出现爆裂。
6、贴上标签，写明细胞种类，冻存日期。
冻存管外拴一金属重物和一细绳。
7、按下列顺序降温：室温→4℃（20分钟）→冰箱冷冻室（30分钟）→低温冰箱（－30℃ 1小时）→气态氮（30分钟）→液氮。
注意：操作时应小心，以免液氮冻伤。
液氮定期检查，随时补充，绝对不能挥发干净，一般30立升的液氮能用1～1.5月。
（二）复苏1、准备一个茶缸或1000ml的烧坏，内装2/3杯37℃的温水。
2、从液氮中取出冻存管、迅速置于温水中并不断搅动。
使冻存管中的冻存物在1分钟之内融化。
3、打开冻存管，将细胞悬液吸到离心管中。
4、1000rpm离心10分钟，弃去上清液。
5、沉淀加10ml培养液，吹打均匀，再离心10分钟，弃上清液。
（细胞数量少的情况下，复苏时可省略步骤5。
）6、加适当培养基后将细胞转移至培养瓶中，37℃培养，第二天观察生长情况。
三、试剂和器材器材：液氮罐、冻存管（塑料螺口专用冻存管或安瓿瓶）、离心管、吸管、离心机等。
细胞冻存与复苏步骤
细胞冻存与复苏步骤一、细胞冻存步骤1.细胞准备：选择需要保存的细胞，如细菌、真核细胞或植物细胞等。
确保细胞在保存前是健康和活跃的。
2.细胞培养：将细胞培养在适当的培养基中，提供足够的营养物质供细胞生长和增殖。
3.预冷处理：在冰箱中对细胞进行预冷处理，以适应环境的改变，减少冷冻过程中对细胞的伤害。
4.冷冻介质配制：配制适合冷冻细胞的冷冻介质。
常见的冷冻介质包括甘油、DMSO（二甲基亚砜）等。
5.细胞冷冻：将培养好的细胞与冷冻介质混合均匀，并分装到冷冻管或冻存袋中，然后将其放入液氮罐中进行冷冻。
6.冷冻保存：将冷冻好的细胞保存在液氮罐中，温度通常保持在-196℃以下。
二、细胞复苏步骤1.预备工作：首先需要准备好细胞复苏所需的培养基和试剂。
培养基通常包括适当浓度的多糖、氨基酸和生长因子等。
2.细胞解冻：将冷冻的细胞从液氮罐中取出，迅速放入37℃的水浴中解冻，避免长时间暴露在室温。
3.细胞离心：解冻后将细胞离心，以去除残留的冷冻介质和杂质。
4.细胞重悬：将离心得到的细胞重悬于预先准备的培养基中。
5.细胞培养：将细胞转移至培养皿中，放入恒温培养箱中，通常为37℃，5%CO2的条件下继续培养。
6.细胞观察：观察培养皿中细胞的生长情况，通过显微镜观察细胞形态和数量的变化。
1.选择适当的冷冻介质：不同细胞类型对冷冻介质的耐受性不同，需要选择能够保护细胞完整性和生物活性的冷冻介质。
2.控制冷冻速率：过快或过慢的冷冻速率都可能导致细胞冻存失败。
通常使用控制冷冻速率的设备，如液氮罐或冷冻机。
3.防止细胞冻伤：冻存过程中细胞易受到冻伤的伤害，应尽量减少或避免冻伤的发生。
例如，在细胞冷冻前使用细胞保护剂可以提高细胞的存活率。
4.保存条件控制：细胞冷冻保存时，需要精确控制温度，确保保存温度稳定，以防止细胞失活或变异。
液氮罐中的细胞保存时间通常可以达到数年以上。
细胞冻存与复苏技术的发展为细胞研究和应用提供了更多的可能性，同时也为人类疾病的治疗和预防带来了希望。
细胞冻存和复苏
细胞冻存和复苏
关键词：细胞 DMSO 血清试剂标准物质北京标准物质网
一、细胞冻存
细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。
细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少人力、经费，减少污染，减少细胞生物学特性变化。
细胞冻存原则是慢冻快融。
当细胞冷到0℃以下，会造成细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。
如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反，结晶就大，大结晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。
复苏过程应快融，目的是防止小冰品形成大冰品，即冰晶的重结晶。
在细胞冻存时加入低温保护剂，能大大提高冻存效果。
常用的低温保护剂是DMSO，它是种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。
常用配方为2×冻存液(40％血清培养基+40％血清+20％DMSO)。
目前已经有商业化无DMSO无血清细胞冻存液，它是一种化学成分确定、不含动物源成分，也不含DMSO的冻存液。
可直接使用，无需梯度降温。
二、细胞复苏
细胞复苏是将冻存在液氮中的细胞解冻后重新培养。
细胞复苏过程升温要快，防止在解冻过程中水分进入细胞，形成冰晶，影响细胞存活。
具体步骤：从液氮中取出冷冻管，迅速投入37℃水浴中，使其融化(1分钟左右)。
5分钟内用培养液稀释至原体积的10倍以上，800rpm低速离心10分钟，去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。
细胞冻存、复苏及传代
细胞冻存步骤
1、将细胞冻存液（10%DMSO+90%FBS)配好并放置冰箱预冷；
2、当10 cm培养皿中的RBMSC细胞汇合到80%-90%时，用胰蛋白酶将细胞消化下来，1200 rpm离心，去上清；
3、加入PBS重悬细胞，以洗去残留的胰蛋白酶，1200 rpm离心，去上清；
4、加入1ml细胞冻存液重悬后，将细胞重悬液放入冻存管中，并快速将冻存管放入冻存盒中(冻存盒需先复温),再将冻存盒放入-80℃冰箱中过夜，再转移至液氮中保存。
细胞复苏步骤
1、先将培养基配好并复温，在15ml离心管中加入3ml培养基
2、将从液氮罐取出的冻存细胞置于37℃水浴锅中1-2min溶解后，立即将细胞悬液转移至
15ml离心管中，1200 rpm离心3 min，弃上清；
3、加入6ml培养基重悬细胞，并将细胞悬液转移至6cm培养皿中培养，贴壁12h后换液。
4、复苏的细胞应传代2-3代后方可用于实验。
细胞传代步骤
1、当培养皿或培养瓶内的细胞增殖为80-90%时，可进行传代。
2、弃上清，PBS洗2-3次，6cm（10cm）培养皿中加入600μl（800 μl）胰蛋白酶消化1-2min
后，在显微镜下观察细胞是否变成圆形，当细胞变成圆形后，应立即加入培养基终止消化，以免细胞消化过度。
3、1200 rpm离心3min，弃上清，加入1ml培养基重悬，将细胞重悬液转移至含有培养基
的6cm培养皿中进行培养。
细胞冻存和复苏的原则
细胞冻存和复苏的原则
1.保护细胞膜：细胞膜是细胞内部和外部环境之间的重要屏障，保护
细胞膜是冻存和复苏的关键。
冻存前，必须将细胞放入适当的保护剂中，
例如甘油、DMSO等，保护细胞膜免受冷冻过程中的损伤。
在复苏过程中，使用适当的解冻缓冲液缓慢地回温，避免细胞膜急剧收缩或破裂。
2. 控制冷冻速度：细胞冷冻的速度必须缓慢，以避免冻结引起的细
胞破坏。
最佳的冷冻速度取决于细胞类型和冷冻条件，通常应在-
1°C/min以下。
可以使用特殊的冷冻器进行控制，或通过降低温度梯度
来减缓细胞的冷冻速度。
3.恢复培养环境：在冻存的细胞复苏过程中，必须立即将细胞恢复到
培养环境中。
这包括向培养基中添加适当的营养物，例如葡萄糖、氨基酸、维生素等，在适宜的温度、氧气和二氧化碳条件下培养。
4.检测细胞的活力和质量：冷冻和复苏过程都会对细胞产生损伤，因
此必须定期检测细胞的活力和质量。
这可以通过测量细胞增殖率、形态、
细胞周期及细胞凋亡等生化和形态指标来评估。
总之，一个成功的细胞冻存和复苏过程需要考虑多个因素，包括保护
细胞膜、控制冷冻速度、恢复培养环境和检测细胞活力和质量。
只有通过
精心设计和执行这些步骤，才能最大限度地减小细胞冻存和复苏过程中的
损伤和质量损失。
细胞冻存与复苏 步骤
细胞冻存一、实验用品：二甲基亚砜（DMSO）、胎牛血清、高糖DMEM培养基、0.25%含EDTA 的胰蛋白酶、移液器、枪头、玻璃离心管、冻存管二、实验方法1、配细胞冻存液（培养液+保护剂）：DMEM培养基：胎牛血清：DMSO=7:2:1，配成1ml2、过程（1）对数生长期细胞，弃去旧培养液；（2）PBS洗清2-3次细胞（3）0.25%含EDTA胰蛋白酶消化细胞，制成细胞悬液，1000r/min 离心5min，弃上清液；（4）加入冻存液，轻轻吹吸均匀（5）按每管1.0ml的量，分装入冻存管，拧紧管盖；（6）在冻存管上做标记，包括细胞代号及冻存日期；（7）分级冷冻：4℃冰箱内30-40min，转入-20℃冰箱60min，放入-80℃冰箱，将冻存管放入-196℃液氮罐中保存。
细胞复苏一、实验用品离心管、培养瓶、尖吸管、无菌试管，胎牛血清，DMEM培养基、大镊子、无菌纱布、二、细胞复苏1、准备工作：（1）将恒温水浴箱中的水温调至37℃（2）离心管、培养瓶，瓶口均过火（3）尖吸管，过火处理后插入无菌试管中（4）配培养液，放入超净台，瓶口过火，盖拧松，待用。
2、复苏和培养：迅速取出冻存管（1）大镊子夹其盖部，在37℃温水中快速摇动，待有残留小冰核时，快速用含有消毒水的纱布擦拭，放入超净台（2）冻存管迅速过火开盖，手持无菌尖吸管将其底部的细胞轻轻吹打起来，转移至刻度离心管中，用过的尖吸管插回原试管中（3）培养瓶盖子打开过火，用另一尖吸管往离心管中加入培养液，拧上盖子，过火（4）1000r/min离心5min（5）离心管管口过火，拧开，过火，液体倒入废液缸，再过火，加入适度含20%的FBS的DMEM新鲜培养液，轻轻吹打离心管底部的细胞，随后将其转移至培养瓶中（6）观察细胞状态，放入5%CO2培养箱中培养。
细胞冻存和复苏的基本原则
细胞冻存和复苏的基本原则在科学的世界里，细胞就像我们的好朋友一样，既珍贵又脆弱。
想象一下，如果能把这些小家伙冷冻起来，等到需要的时候再把它们复苏，这简直是个梦吧！不过，冻存和复苏可不是随便一冻一热就能搞定的，今天咱们就来聊聊这背后的基本原则，让你轻松掌握这些小窍门。
1. 冻存的基本原则1.1 冻存前的准备首先，冻存之前可得好好准备。
这就像是出去旅行之前得收拾行李一样。
要确保细胞的健康状态，最好先让它们在适合的环境中“养精蓄锐”，这样才能确保它们的“战斗力”。
对了，培养基可别忘了换，培养环境也要保持稳定，不然细胞可受不了这种折腾，估计连个“自我保护”的机会都没有。
1.2 冻存剂的选择接下来，我们得选好冻存剂。
市面上有各种各样的冻存剂，最常用的就是二甲基亚砜（DMSO）和甘油。
这些东西就像是细胞的“保暖内衣”，能帮助它们抵御严寒。
用冻存剂的时候，记得浓度别太高，太浓了反而对细胞不好。
你想啊，就像喝酒一样，太烈了，谁受得了？所以，适量最重要。
1.3 冻存过程现在，到了最关键的环节，冻存过程。
这个时候，细胞需要缓慢降温，让它们适应冷冻的环境。
通常，咱们会用一个叫“程序化冷冻”的设备，把温度控制得稳稳的，像个温柔的妈妈，慢慢带着宝宝入睡。
记得，细胞在80°C或者液氮环境下存放，一年又一年，它们依然保持着“青春永驻”。
2. 复苏的基本原则2.1 复苏前的准备好了，冻存结束，接下来是复苏。
复苏可得快点，细胞在冰箱里待久了，可是受不了冷的，像是被冻住的小龙虾，急需解救！在复苏前，我们需要准备好复苏的培养基，确保它是温暖的，就像是冬天里的一杯热可可，温暖又舒心。
2.2 复苏过程复苏的时候，要小心翼翼，把冻存的细胞迅速放入37°C的水浴中，快速解冻。
这就像是在冰天雪地里给小家伙们来一场“温泉浴”，让它们感受到春天的气息。
解冻的时间可得掌握好，太长了会让细胞崩溃，太短了又不够，所以就像是调味料，恰到好处才是王道。
细胞冻存与复苏的主要操作步骤
细胞冻存与复苏的主要操作步骤嘿，大家好！今天我们来聊聊细胞冻存和复苏的那些事儿，别担心，我会把这些操作讲得通俗易懂，带点幽默感，让你听得轻松又开心。
准备好了吗？那我们就开始吧！1. 细胞冻存的准备工作1.1 细胞的准备首先，细胞冻存之前，你得准备好你的“细胞宝宝”。
这就像给小朋友穿上厚厚的冬衣，你得确保细胞们在冻存前的状态良好。
先要确认细胞生长得旺盛、状态好，这样冻存后复苏才不会掉链子。
别让它们觉得自己快要去北极了，还是要保持好心情哦！1.2 冻存液的配制接下来，你得准备冻存液。
这东西就像给细胞们准备的“冰淇淋”，它的作用是防止细胞在冷冻过程中被冻坏。
通常冻存液里会有含有保护细胞的成分，比如二甲基亚砜（DMSO）或者甘油。
把这些成分混合在一起，就像调制一杯鸡尾酒，让细胞在寒冷中也能有滋有味地待着。
2. 细胞冻存的操作2.1 冻存前的处理冻存的过程开始啦！首先，你得把细胞从培养瓶里取出，像搬家一样，把它们小心放入冻存管里。
记住，操作时要尽量轻柔，别让细胞们觉得自己被“抛弃”了。
然后，把之前准备好的冻存液加入细胞管中，确保每个细胞都得到“冬衣”的保护。
2.2 冷冻过程现在来到了关键一步，冷冻！这个过程就像给细胞们上“冰雪世界”的体验了。
细胞管要放进冷冻箱中，逐渐降低温度，最好是每分钟下降1°C，这样可以防止细胞内形成大的冰晶，保护细胞不受伤害。
记得设置好降温曲线，确保细胞们能平安度过寒冬。
3. 细胞复苏的操作3.1 复苏前的准备好了，细胞们在冷冻中已经度过了漫长的冬季，现在该是复苏的时候了。
首先，你得把冻存管从冷冻箱里取出来，像迎接老朋友一样，准备好温暖的环境。
复苏液的温度要在37°C左右，就像给细胞们提供一个温暖的春天。
3.2 细胞复苏最后一步是复苏！把冻存管放在37°C的水浴中，温柔地摇晃一下，直到细胞液完全融化。
注意啊，动作要轻柔，千万别让细胞感到惊吓。
然后，把细胞转移到预热的培养基中，让它们重新恢复生长。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
培养细胞的冷冻保存与复苏⏹概述✧冻存过程⏹冷冻保存与复苏的原理✧冻存结果♦冷冻速率✧讨论♦冷冻保存温度⏹冻存细胞的复苏♦复温速率♦非玻璃化冻存细胞的复苏♦冷冻保护剂✧主要材料⏹冷冻保存方法✧复苏过程♦非玻璃化冻存方法✧结果✧主要材料✧讨论✧冻存过程♦玻璃化冻存细胞的复苏✧冻存结果✧主要材料✧讨论✧复苏过程♦玻璃化冻存方法✧结果✧主要材料✧讨论Polge等人（1949）发现了甘油对低温下贮存的细胞具有保护作用，他们仍然以精子进行研究发现，加入甘油能够大大提高贮存于-790C下精子的存活率。
接下来的重大进展是Luyet（1951）与Lovelock（1953）等多位学者发现了电解质浓度对贮存细胞的损伤作用。
他们的结论是，电解质浓度增大是造成贮存细胞损伤的主要原因。
冷冻理论后来得到Merryman（1956）、Rey（1957）以及Smith （1961）等学者的继续和发展。
1949年至1960年这一段时间可以称为冷冻保存的“甘油时期”，这一时期对生物材料的冷冻保存一般都是以甘油作为保护剂。
Lovelock（1959）等人发现了一种新的化学保护剂，这就是人们熟悉的二甲基亚砜（DMSO）。
而且，用于冷冻保存的仪器也有明显的发展。
目前，无论是冷冻保存理论、各种保护剂、冷冻用品和设备以及各种生物材料的保存与复苏技术都已十分成熟和完备。
返回页首冷冻保存与复苏原理在低于-700C的超低温条件下，有机体细胞内部的生化反应极其缓慢，甚至终止。
水在低于零度的条件下会结冰。
如果将细胞悬浮在纯水中，随着温度的降低，细胞内外的水分都会结冰，所形成的冰晶会造成细胞膜和细胞器的破坏而引起细胞死亡。
这种因细胞内部结冰而导致的细胞损伤称为细胞内冰晶的损伤。
如果将细胞悬浮在溶液中，随着温度的降低，细胞外部的水分会首先结冰，从而使得未结冰的溶液中电解质浓度升高。
如果将细胞暴露在这样高溶质的溶液中且时间过长，细胞膜上脂质分子会受到损坏，细胞便发生渗漏，在复温时，大量水分会因此进入细胞内，造成细胞死亡。
这种因保存溶液中溶质浓度升高而导致的细胞损伤称为溶质损伤或称溶液损伤。
当温度进一步下降，细胞内外都结冰，产生冰晶损伤。
但是如果在溶液中加入冷冻保护剂，则可保护细胞免受溶质损伤和冰晶损伤。
因为冷冻保护剂容易同溶液中的水分子结合，从而降低冰点，减少冰晶的形成，并且通过其摩尔浓度降低未结冰溶液中电解质的浓度，使细胞免受溶质损伤，细胞得以在超低温条件下保存。
在复苏时，一般以很快的速度升温，1-2分钟内即恢复到常温，细胞内外不会重新形成较大的冰晶，也不会暴露在高浓度的电解质溶液中过长的时间，从而无冰晶损伤和溶质损伤产生，冻存的细胞经复苏后仍保持其正常的结构和功能。
冷冻保护剂对细胞的冷冻保护效果还与冷冻速率、冷冻温度和复温速率有关。
而且不同的冷冻保护剂其冷冻保护效果也不一样。
返回页首冷冻速率冷冻速率是指降温的速度，直接关系到冷冻效果。
细胞在冷冻过程中会发生如下变化：当细胞被冷至-50C时，因溶液中加有冷冻保护剂而降低溶液的冰点，细胞内外溶液仍未结冰；当被冷至-5～-150C之间时，细胞外溶液先出现结冰而细胞内仍保持未结冰状态。
细胞内未结冰的水分子会比细胞外部分结冰溶液中的水分子具有更高的化学能。
其结果是，细胞内水分子为了和细胞外水分子保持化学能的平衡，会向细胞外流动。
冷冻速度不同，细胞内水分向外流动的情况也不相同：如果冷冻速度慢，细胞内水分外渗多，细胞脱水，体积缩小，细胞内溶质浓度增高，细胞内不会发生结冰；如果冷冻速度快，细胞内水分没有足够的时间外渗，结果随着温度的下降而发生细胞内结冰；如果冷冻速度非常快（即超快速冷冻），则细胞内形成的冰晶非常小或不结冰而呈玻璃状态（玻璃化冷冻）。
Luyet （1973）证实液体的凝固可分为两种形式：一种是晶体化，溶液中的分子呈有序排列；另一种情况是非晶体即玻璃化，液体中的分子呈无序状态，保持未凝固前的状态。
不同的冷冻速度既然能使细胞内发生不同的生理变化，也可以对细胞产生不同的损伤。
当冷冻速度过慢时，细胞脱水严重，细胞体积严重收缩，超过一定程度时即失去活性。
同时冷冻速度过慢，还会引起细胞外溶液部分结冰，从而使细胞外未结冰的溶液中溶质浓度增高，产生溶质损伤。
当冷冻速度过快时，细胞内水分来不及外渗，会形成较多冰晶，造成细胞膜及细胞器的破坏，产生细胞内冰晶损伤。
超快速玻璃化冷冻对细胞存活来说是最为理想的冷冻方法。
细胞内外呈玻璃化凝固，无冰晶形成或形成很小的冰晶，对细胞膜和细胞器不致造成损伤，细胞也不会在高浓度的溶质中长时间暴露而受损。
不同细胞的最适冷冻速率不同。
小鼠骨髓干细胞、酵母、人红细胞的最适冷冻速率分别为1.60C/min、70C/min和2000C/min。
细胞与细胞之间的最适冷冻速率可在1.60C～3000C/min，故对一种细胞进行冷冻保存之前，首先需要测定其最适冷冻速率，以保证获得最高的冷冻存活率。
返回页首冷冻保存温度冷冻保存温度是指能长期保存细胞的超低温度，在此温度下，细胞生化反应极其缓慢甚至停止，但经过长期保存，在复苏后仍能保持正常的结构和功能。
不同的细胞和生物体以及使用不同的冷冻保存方法要取得同样的冷冻保存效果，冷冻保存温度可以不同。
但从实际和效益的观点出发，液氮温度（-1960C）是目前最佳的冷冻保存温度。
在-1960C时，细胞的生命活动几乎完全停止，但复苏后细胞的结构和功能完好。
如果冷冻过程得当，一般生物样品在-1960C下均可保存十年以上。
应用-700C～-800C保存细胞，短期内对细胞的活性无明显影响，但随着冻存时间延长，细胞存活率明显降低。
在冰点到-400C范围内保存细胞的效果不佳。
返回页首复苏速率冷冻保护体外培养物，除了必须有最佳的冷冻速率、合适的冷冻保护剂和冻存温度外，在复苏时也必须有最佳的复温速率，这样才能保证最后获得最佳冷冻保存效果。
复温速率是指在细胞复苏时温度升高的速度。
复温速率不当也会降低冻存细胞存活率。
一般来说，复温速度越快越好。
常规的做法是，在370C水浴中，于1-2分钟内完成复苏。
复温速度过慢，细胞内往往重新形成较大冰晶而造成细胞损伤。
复温时造成的细胞损伤非常快，往往在极短的时间内发生。
返回页首冷冻保护剂冷冻保护剂是指可以保护细胞免受冷冻损伤的物质。
冷冻保护剂常常配制成一定的溶液。
一般来讲，只有红细胞、大多数微生物和极少数有核的哺乳动物细胞悬浮在不加冷冻保护剂的水或简单的盐溶液中，并以最适的冷冻速率冷冻，可以获得活的冻存物。
但对于大多数有核哺乳动物细胞来说，在不加冷冻保护剂的情况下，无最适冷冻速率可言，也不能获得活的冷冻物。
例如将小鼠骨髓细胞悬浮在不加冷冻保护剂的平衡盐溶液中，并以0.3～6000C/min的冷冻速率降温冷冻，98%以上的细胞会死亡；而加入甘油冷冻保护剂进行冷冻保存时，98%以上的细胞都可存活。
冷冻保护剂可分为渗透性和非渗透性两类。
渗透性冷冻保护剂可以渗透到细胞内，一般是一些小分子物质，主要包括甘油、DMSO、乙二醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇等。
其保护机制是在细胞冷冻悬液完全凝固之前，渗透到细胞内，在细胞内外产生一定的摩尔浓度，降低细胞内外未结冰溶液中电解质的浓度，从而保护细胞免受高浓度电解质的损伤，同时，细胞内水分也不会过分外渗，避免了细胞过分脱水皱缩。
甘油和DMSO并不防止细胞内结冰，在使用该类冷冻保护剂时，需要一定的时间进行预冷，让甘油或DMSO等成分渗透到细胞内，在细胞内外达到平衡以起到充分的保护作用。
目前DMSO的应用比甘油更为广泛，但要注意的是，DMSO在常温下对细胞的毒性作用较大，而在40C时，其毒性作用大大减弱，且仍能以较快的速度渗透到细胞内。
所以，冻存时DMSO平衡多在40C下进行，一般需要40～60分钟。
非渗透性冷冻保护剂不能渗透到细胞内，一般是些大分子物质，主要包括聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白以及羟乙基淀粉等。
其保护机制的假说很多，其中有一种可能是，聚乙烯吡咯烷酮等大分子物质可以优先同溶液中水分子结合，降低溶液中自由水的含量，使冰点降低，减少冰晶的形成；同时，由于其分子量大，使溶液中电解质浓度降低，从而减轻溶质损伤。
不同的冷冻保护剂有不同的优、缺点。
目前一般多采用联合使用两种以上冷冻保护剂组成保护液。
由于许多冷冻保护剂（如DMSO）在低温下能保护细胞，但在常温下却对细胞有害，故在细胞复温后应及时洗涤冷冻保护剂。
返回页首冷冻保存方法按照冷冻保护液在冻结后是否形成冰晶来划分，冻存方法可分为非玻璃化和玻璃化冻存两种。
非玻璃化冻存是利用各种温级的冰箱分阶段降温至-700C～-800C，然后直接投入液氮进行保存；或者是利用电子计算机程控降温仪以及利用液氮的气、液，按一定的降温速率从室温降至-1000C以下，再直接投入液氮保存的方法。
以该种方法冻结的细胞悬液或多或少都有冰晶的形成。
玻璃化冻存则是指利用多种高浓度的冷冻保护剂联合形成的玻璃化冷冻保护液保护悬浮细胞，直接投入液氮进行冻存的方法。
以该中方法冻结的细胞悬液没有冰晶的形成。
但目前细胞冻存最常用的仍是前一种方法。
返回页首非玻璃化冻存方法下面以肿瘤细胞和杂交瘤细胞为例，介绍非玻璃化冻存细胞的详细过程。
返回页首主要材料（1）仪器设备：普通冰箱、-300C低温冰箱和-700C～-800C超低温冰箱、液氮冻存罐、高速离心机、电子计算机程控降温仪等；（2）冻存管：容量为1ml或1.5ml；（3）冷冻保护液：一般是以9份小牛血清或细胞培养液与1份DMSO混合而成。
现配现用，或配制后防入普通冰箱冰盒内冷冻保存。
使用前，于室温下水浴溶解；（4）待冻存细胞：各种肿瘤细胞或杂交瘤细胞。
返回页首操作过程1.待冻存细胞悬液的制备(1)按常规方法消化处于对数生长期的细胞培养物，制备单细胞悬液，并计算细胞总数；(2)将细胞悬液以800～1000r/min离心5min，去上清夜；(3)向细胞沉淀物中加入冷冻保护液，轻轻吹打混匀，使细胞密度达1×106～1×107个/ml；(4)按每管1～1.5ml的量分装于冻存管内，拧紧管盖；(5)再冻存管上做好标记，包括细胞代号及冻存日期。
2.分级冷冻(1)先将冻存管放入普通冰箱冷藏室（4～80C），约40min；(2)接着将冻存管置于普通冰箱冷冻室（-100C～-200C），约30～60min；(3)将冻存管转入低温冰箱（-300C），放置30min左右；(4)然后将冻存管转移到超低温冰箱（-700C～-800C），过夜；(5)最后将冻存管投入液氮保存。
3.记录做好冻存记录。
记录内容包括冻存日期、细胞代号、冻存管数、冻存过程中降温的情况、冻存位置以及操作人员。
返回页首冻存结果如此冻存的细胞，其存活率可达90%以上。