体外转录与翻译
《体外转录与翻译》课件
了解体外转录与翻译的概念、研究背景和意义，开拓基因工程、药物研发和 学术研究的新方向。
1. 介绍
体外转录和翻译的概念，以及相关研究的背景和意义。探索生物学研究的新领域。
1 体外转录
2 体外翻译
揭示基因表达机制，为基因工程和药物研 发提供基础。
实现蛋白质合成，拓展学术研究和生物医 学应用的可能性。
• 提高产物质量和数量。 • 结合高通量筛选和体外翻译。 • 开发新型反应体系和翻译系统。
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原理
利用细胞提取物或重组蛋白体系，在体外合成蛋白质。
2
常用方法
采用细胞裂解、核糖体体系或基因工程策略实现体外蛋白合成。
3
实验步骤
制备细胞提取物、加入体系组分、调节反应条件和分析蛋白质产物。
4. 应用
展示体外转录与翻译在基因工程、药物研发和学术研究中的应用。促进创新和突破。
基因工程
通过体外转录与翻译技术 实现基因的调控和蛋白质 的合成。
2. 体外转录
深入了解体外转录的原理、常用方法、实验步骤和注意事项。发现基因调控的奥秘。
原理
从DNA模板合成RNA链，模拟细胞内转录过程。
2
常用方法
采用核酸聚合酶和模板DNA进行体外反应。
3
实验步骤
设计引物、制备反应体系、调节反应条件和产物分析。
3. 体外翻译
探索体外翻译的原理、常用方法、实验步骤和注意事项。揭示蛋白质合成的机制。
药物研发
应用体外转录与翻译技术 筛选药物靶点和评估药物 效果。
学术研究
拓展蛋白质研究领域，研 究蛋白质功能和相互作用。
5. 总结
总结体外转录与翻译的优缺点，探讨其发展趋势和在生命科学领域的前景。
基因的体外转录和翻译 共47页
23.07.2019
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基因体外转录体系在分子生物学和 细胞生物学研究中的用途和意义：
1、快速检测目的基因的转录情况； 2、分析转录因子调节基因转录的过程； 3、分析启动子序列的活性； 4、分析转录因子、DNA结合蛋白和RNA 剪切因子的组成和作用；
5、染色质结构调整与基因转录的关系；
6、制备RNA探针。
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一、基因体外转录的基本原理
基本原理：以DNA为模板，在无细 胞体系中一系列转录因子的作用下 经RNA聚合酶合成RNA的过程。
质粒DNA
模 板
线性DNA
核小体形式存在的DNA
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能用于体外转录的质粒载体
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基因体外翻译的基本原理 基因体外翻译的基本原理是以基因 转录产物RNA为模板，在核糖体上 进一步生产蛋白质的过程。
基因体外翻译的模板：
1、直接来自体外基因转录实验； 2、细胞内提取的mRNA； 3、通过PCR或RT-PCR产物转录后 的RNA。
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利用不同模板和翻译体系进行翻译
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（3）干扰物质少。如干扰Lowry法的K 、 Na 、Mg2 离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、 甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测 定法。 此法的缺点是： （1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳 香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法 用于不同蛋白质测定时有较大的偏差， 在制作标准曲线时通常选用 g—球蛋白 为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。
分子生物学实验技术考试题库
一、名词解释1.分配常数：又称分配系数,是指一种分析物在两种不相混合溶剂中的平衡常数.2。
多肽链的末端分析:确定多肽链的两末端可作为整条多肽链一级结构测定的标志，分为氨基端分析和羧基端分析。
3。
连接酶:指能将双链DNA中一条单链上相邻两核苷酸连接成一条完整的分子的酶.4。
预杂交：在分子杂交实验之前对杂交膜上非样品区域进行封闭,用以降低探针在膜上的非特异性结合。
5.反转录PCR：是将反转录RNA与PCR结合起来建立的一种PCR技术.首先进行反转录产生cDNA,然后进行常规的PCR反应。
6.稳定表达：外源基因转染真核细胞并整合入基因组后的表达。
7.基因敲除：是指对一个结构已知但功能未知或未完全知道的基因,从分子水平上设计实验，将该基因从动物的原基因组中去除，或用其它无功能的DNA片断取代,然后从整体观察实验动物表型，推测相应基因的功能。
8。
物理图谱:人类基因组的物理图是指以已知核苷酸序列的DNA片段为“路标”，以碱基对（bp，kb，Mb)作为基本测量单位（图距）的基因组图。
9。
质谱图：不同质荷比的离子经质量分析器分开后，到检测器被检测并记录下来，经计算机处理后所表示出的图形。
10.侧向散射光：激光束照射细胞时,光以90度角散射的讯号，用于检测细胞内部结构属性。
11。
离子交换层析：是以离子交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行的层析。
12。
Edman降解：从多肽链游离的N末端测定氨基酸残基的序列的过程。
13。
又称为限制性核酸内切酶(restriction endonuclease）：是能够特异识别双链DNA 序列并进行切割的一类酶。
14.电转移：用电泳技术将凝胶中的蛋白质,DNA或RNA条带按原位转移到固体支持物，形成印迹。
15。
多重PCR：是在一次反应中加入多对引物，同时扩增一份模板样品中不同序列的PCR 过程.16。
融合表达：在表达载体的多克隆位点上连有一段融合表达标签(Tag)，表达产物为融合蛋白（有分N端或者C端融合表达）,方便后继的纯化步骤或者检测。
mrna体外转录 pcr产物
mRNA体外转录 PCR产物1. 摘要mRNA体外转录是一种重要的实验技术，可以在实验室中合成mRNA分子。
PCR（聚合酶链式反应）产物是PCR技术的产物，是DNA分子的复制产物。
本文将对mRNA体外转录和PCR产物进行分析和探讨。
2. mRNA体外转录mRNA体外转录是一种将mRNA合成用于不同实验目的的技术。
该技术可以在实验室中合成具有特定序列的mRNA分子，从而为研究人员提供了操纵RNA的可控手段。
mRNA体外转录通常需要一系列的试剂和酶，包括DNA模板、RNA聚合酶、核苷酸三磷酸和缓冲液等。
通过严格控制反应条件和参数，可以合成特定长度和序列的mRNA分子，从而用于实验室研究。
3. mRNA体外转录的应用mRNA体外转录技术在生物医学研究和生物工程领域有着广泛的应用。
在疫苗研发中，研究人员可以使用mRNA体外转录技术合成特定的病原体蛋白编码mRNA，从而用于疫苗的研究和生产。
在基因编辑和基因治疗领域，也可以利用mRNA体外转录技术将特定的基因表达序列合成为mRNA，用于研究和治疗。
4. PCR产物PCR产物是PCR技术的产物，是DNA分子的复制产物。
PCR是一种体外合成DNA的技术，可以通过扩增DNA序列从而获得大量的DNA产物。
PCR产物通常由目标DNA序列在PCR反应中的扩增产生，可以用于后续的DNA测序、克隆、分析等实验操作。
5. PCR产物的应用PCR产物在分子生物学和遗传学研究中有着广泛的应用。
在基因检测和诊断中，研究人员可以利用PCR产物进行特定基因的扩增和分析，从而获得基因型和表型信息。
在DNA测序、基因重组和DNA克隆等实验中，PCR产物也扮演着重要的角色。
6. mRNA体外转录与PCR产物的关联mRNA体外转录和PCR产物在分子生物学和生物医学研究中往往是相互关联的。
在研究基因表达和蛋白合成时，研究人员通常需要合成特定序列的mRNA，这就需要利用mRNA体外转录技术。
而在后续的分子生物学实验中，研究人员可能会需要获得大量的DNA产物，这就需要利用PCR技术进行DNA的扩增和合成。
分子生物学：基因的体外转录和翻译ppt课件
2019/12/19
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(4)收集核提取物：25000g离心 30min，收集上清液后，用缓冲液 透析2h后，4℃，25000g离心20min， 上清液置-70℃保存。
(5)核提取物的蛋白定量：核抽提物 总蛋白浓度采用Bradford法测定， 以牛白蛋白为参照。
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（3）干扰物质少。如干扰Lowry法的K 、 Na 、Mg2 离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、 甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测 定法。 此法的缺点是： （1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳 香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法 用于不同蛋白质测定时有较大的偏差， 在制作标准曲线时通常选用 g—球蛋白 为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。
缺点：分离过程中一些特殊的试剂 破坏了细胞核膜，造成核内容物的 部分流失及操作过程中精胺易使 DNA模板产生沉淀
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过程：
收集细胞：收集一定数量的培养细 胞，300g离心5min，沉淀用分离 液清洗2次。 裂解细胞纯化细胞核：沉淀中加入 预冷的匀浆液1/10(原体积)，冰浴 10min后，匀浆，镜检，至90%细
5、染色质结构调整与基因转录的关系；
6、制备RNA探针。
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基因体外转录体系
DNA模板：含有转录启动子及必要 的调控序列(起始和终止序列等)的 DNA及为研究基因转录调控的需要, 在体外组装成的核小体链(注意避免 RNase的污染)。
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细胞核抽提物的制备：
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什么是基因的体外转录和翻译
基因的体外转录和翻译是20世纪70 年代发展起来的一项分子生物学和 细胞生物学实验技术，是研究离体 条件下(非细胞体系)基因表达情况 的理想体系。
SPR技术体外转录和翻译GST融合蛋白免疫共沉淀串联亲和纯化等鉴定分析蛋白质之间相互作用介绍(精品)
Inhibitory by-products
•T7 RNA polymerase •Translation machinery E. coli •Energy regenerating system
Inhibitory by-products
microtiterplate 96x RTS 100
PCR tubes 4x12 RTS 100
continuous exchange cell-free (CECF) principle
持续交换和非细胞体系的原理
偶联的转录和翻译过程
T7-RNA polymerase
gene
gene
E.coli lysate
DNA
coupled transcription / translation
protein
原子力显微镜检测蛋白质相互作用；
计算机方法； 化学交联技术鉴定蛋白质相
GST PULL-DOWN：通过与GST融合蛋白质 探针蛋白质相互作用从可溶性蛋白质库中亲 和纯化一个未知蛋白质，再通过GST与谷光 苷肽偶联球珠的结合收集相互作用蛋白质， 从而分离出蛋白质复合物。
GST融合蛋白纯化基本程序
1 含有表达质粒的细菌培养； 2 诱导表达； 3 收集菌体； 4 加蛋白酶抑制剂，冰上破碎细胞； 5 离心取上清，按1：1的比例加谷光苷肽琼脂糖球珠，在4C， 温和混匀30分钟； 6 离心收集琼脂糖球珠，用PBS轻轻混匀悬浮，反复三次； 7 将混合物装柱，让PBS流出； 8 加还原性的GSH将融合蛋白洗脱； 9 SDS-PAGE检测蛋白质纯化情况。
持续交换和非细胞体系的原理
供给腔 反应腔
DNA template Protein
供给腔
体外翻译系统在分子生物学研究中的应用
体外翻译系统在分子生物学研究中的应用李 前综述 孙曼霁审阅军事医学科学院毒物药物研究所(北京,100850) 摘要 体外翻译系统又称无细胞蛋白质合成系统,是分子生物学中一种常规的表达系统。
该系统可用于蛋白质快速分析鉴定,基因转录和翻译的调控机理的研究以及分子间的相互作用的研究,如蛋白质和蛋白质的相互作用,蛋白质与DN A的相互作用,蛋白质与RN A的相互作用等。
关键词 体外翻译系统; 基因表达调控 体外翻译系统又称无细胞蛋白质合成系统,是一种相对胞内表达系统而言的开放表达体系。
翻译系统内的组分和翻译条件可以根据需要进行适当的改变,因而体外翻译系统中翻译特定的基因较胞内表达系统具有许多优点如内源性mRNA干扰很小(由于体外翻译系统是用指定的模板进行目的蛋白质合成,因而可以大大降低或消除在体内翻译系统中由于内源mRNA所造成的背景);可以同时加入多种基因模板研究多种蛋白质的相互作用;体外翻译系统可以对基因产物进行特异性标记,便于在反应混合物中检测。
此外体外翻译系统是一种蛋白质快速鉴定系统,蛋白质表达可以不需要先进行克隆。
目前,体外翻译系统有兔网织红细胞系统、麦胚提取物系统、E.coli S30系统3种。
1 真核体外翻译系统在分子生物学研究中的应用1.1 兔网织红细胞系统体外翻译系统中兔网织红细胞系统是真核体外翻译系统中应用最广泛的一种,常用于较大的mR-NA种类鉴定,基因产物性质的分析,转录和翻译调控的研究,以及共翻译加工的研究等等。
兔网织红细胞用新西兰大白兔制备[1],通过纯化除去兔网织红细胞以外的污染细胞。
网织红细胞裂解后,提取物用微球菌核酸酶破坏内源m RNA,最大限度降低翻译背景。
裂解物包含蛋白质合成所必须的细胞内组分(tRNA,核糖体,氨基酸,起始、延伸、终止因子)。
为了使系统更适于m RNA的翻译,兔网织红细胞中还添加了磷酸肌酸和磷酸肌酸激酶的能量生成系统,以及氯化高铁血红素防止翻译起始的抑制,此外还添加了tRNAs混合物用于扩大m RNA翻译的范围,以及乙酸钾和乙酸镁等。
基因的体外转录和翻译PPT演示文稿
嗪乙磺酸) pH 7.9,10mmol/LKCl，
1.5mmol/L DTT(二硫苏糖醇)，0.2mmol/L PMSF(苯甲基磺酰氟)]，冰浴30min，用 玻璃匀浆器匀浆，3000rpm离心15min 得细胞核沉淀。
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（2）仍有一些物质干扰此法的测 定，主要的干扰物质有：去污剂、 Triton X-100、十二烷基硫酸钠 （SDS）和0.1N的NaOH （3）标准曲线也有轻微的非线性， 因而不能用Beer定律进行计算，而 只能用标准曲线来测定未知蛋白质 的浓度。
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什么是基因的体外转录和翻译
基因的体外转录和翻译是20世纪70 年代发展起来的一项分子生物学和 细胞生物学实验技术，是研究离体 条件下(非细胞体系)基因表达情况 的理想体系。
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基因表达包括：转录和翻译两个过 程。
基因表达的调控包括：染色体结构 的调节、DNA结构的调节、转录过 程的调控、转录后的调控、翻译过 程的调控及翻译后的调控。
DNA模板：含有转录启动子及必要 的调控序列(起始和终止序列等)的 DNA及为研究基因转录调控的需要, 在体外组装成的核小体链(注意避免 RNase的污染)。
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细胞核抽提物的制备：
细胞核抽提物：DNA转录由RNA聚合酶、 各种转录因子及必要的环境条件等，这 一切必需由细胞提供。常用于制备细胞 核抽提物的细胞有酵母细胞、兔网织红 细胞和Hela细胞
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(3)裂解细胞核：向细胞核沉淀中加
入2倍体积的低盐缓冲液(20mmol/L
基因的体外转录与翻译
2020年10月10日星期六
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Bradford法的突出优点是： （1）灵敏度高，据估计比Lowry法 约高四倍，这是因为蛋白质与染料 结合后产生的颜色变化很大，蛋白 质－染料复合物有更高的消光系数， 因而光吸收值随蛋白质浓度的变化 比Lowry法要大的多。
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（2）测定快速、简便，只需加一种 试剂。完成一个样品的测定，只需 要5分钟左右。由于染料与蛋白质结 合的过程，大约只要2分钟即可完成， 其颜色可以在1小时内保持稳定，且 在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定 性最好。因而完全不用像Lowry法那 样费时和严格地控制时间。
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（2）仍有一些物质干扰此法的测 定，主要的干扰物质有：去污剂、 Triton X-100、十二烷基硫酸钠 （SDS）和0.1N的NaOH （3）标准曲线也有轻微的非线性， 因而不能用Beer定律进行计算，而 只能用标准曲线来测定未知蛋白质 的浓度。
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3、分离得到的细胞核比较纯且没有核蛋 白的流失。
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体外基因转录反应
体外基因转录一般用硅化的1.5ml塑 料管，在24~32℃条件下进行，为 了保证产物的稳定，反应体系中必 须加入RNase抑制剂，终止反应时，
可加入蛋白酶以降解核提取物中的 RNase。同时加入酵母tRNA作为产 物RNA的载体起到保护作用。反应
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利用不同模板和翻译体系进行翻译
时，应匹配相应的翻译起始序列。 如用原核细胞翻译体系时RNA模板 应含有SD序列，应用真核翻译体 系时，应有帽子结构；在RNA的3ˊ 未端含有合适的终止信号。
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基因工程考试重点淮师
一、名词解释1.星号活性：在非标准条件下，有些内切酶可在与其识别序列相似但不完全相同的位点发生切割反应。
这种非特异性的切割即所谓的“星号活性”。
2.质粒的不相容性：在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能在同一宿主细胞中稳定地共存，这一现象称为质粒的不亲和性，也称不相容性。
3.SD序列：存在于原核生物起始密码子AUG上游7-12个核苷酸处的一种4-7个核苷酸的保守序列，它与16SrRNA3’端反向互补，所以可将mRNA的AUG起始密码子置于核糖体的适当位置以便起始翻译。
4.启动子：是RNA聚合酶能够识别并与之结合，从而确保转录精确而有效地起始的DNA序列，通常位于基因上游。
能活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准确地相结合并具有转录起始的特异性。
5.转录终止子：在一个基因的3′端或是一个操纵子的3′端往往还有一特定的核苷酸序列，是为转录提供终止信号的一段DNA序列，是基因表达的顺式作用负调控元件。
6.多克隆位点：指载体上人工合成的含有紧密排列的多种限制核酸内切酶的酶切位点的DNA片段，以方便外源DNA片段的插入。
现在几乎所有的载体都含有一个人工合成的密集排列的系列克隆位点，称为多克隆位点。
7.Southern杂交：通过毛细管作用、电转移、真空转膜等方法，使在凝胶电泳中已分离的DNA片段转移并结合到适当的滤膜上，然后通过同已标记的单链DNA或RNA探针进行杂交，以检测被转移DNA片段，称为DNA印迹杂交技术。
又称为Southern杂交。
8.northern杂交：又称为RNA印迹法，是将RNA样品通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，再转移到硝酸纤维素滤膜上，用同位素或生物素标记的DNA或RNA特异探针针对固定于膜上的mRNA进行杂交，洗脱除去非特异性杂交信号，对杂交信号进行分析，以确定目的基因的表达组织。
9.western杂交：Western杂交亦称蛋白质免疫印迹，即通过将SDS-PAGE分离后的蛋白质组分转移到固定化基质上，再以免疫学方法用特异性抗体分析靶蛋白的存在及其含量，是将蛋白质电泳、印记、免疫测定融为一体的特异性蛋白质的检测方法。
(自学)体外转录和翻译
In Vitro Transcription
探针------原位杂交 siRNA------RNAi Transcript------体外翻译，蛋白表达
Linearized plasmid DNA is resuspended in DEPCtreated, autoclaved TE, pH7.5 at a concentration of approximately 200ng/ul prior to use.
4) The standard reaction conditions are set up containing the following quantities:
Higher specific activity compared to oligonucleotides
In Vitro Transcribed siRNAs
In Vitro Transcribed siRNAs - Equally effective as chemically synthesized siRNAs -Design effective siRNA
Rabbit reticulocyte(兔网织红细胞系统)
兔网织红细胞用活大白兔制备,通过纯化除去兔 网织红细胞以外的污染细胞.
真核 VS 原核
满足启动子和核糖体结 合位点
E. coli lysate
对大肠杆菌蛋白合成机制十分了解,成本低,不需加帽 简单高效,可偶连体外转录和翻译,不需分步优化条件 耐受性(在含有其它不同成分杂质时仍可正常工作)
第六部分体外转录和翻译
Disadvantages
-More hands-on
-Scalability
第十六页，共56页。
第十七页，共56页。
第十八页，共56页。
In vitro translation
第十九页，共56页。
测序技术(jìshù), PCR, RTPCR技术(jìshù), 芯片技术 (jìshù), RNA干扰技术(jìshù)
收集大量的生物材料纯化(材料来源受限) 重组表达的方式(费时费力) 体外表达 (In vitro translation,快速(kuài sù),高通量快速
(kuài sù)筛选)
第二十二页，共56页。
In vitro translation
利用体外表达，除了利用载体克隆，更快速的选 择是——在PCR时两端加上不同的启动子序列就 可以得到体外表达的模板材料了。
第二十三页，共56页。
体外表达可以避免过量表达对细胞的毒性(dú xìnɡ)， 或者形成不溶的包含体，以及表达产物在细胞内的降 解，因而可以表达一些对细胞具有毒性(dú xìnɡ)的或 者不稳定、容易被降解的蛋白。减少了蛋白变性复性 的困扰。
体外表达还可以在体系内添加特殊的修饰氨基酸或者 标记氨基酸，非常灵活，因而在蛋白质折叠和蛋白质 功能研究上都有重要应用。
第六部分(bù fen)体外转录和翻 译
第一页，共56页。
In vitro transcription
第二页，共56页。
In Vitro Transcription
目的: 体外得到单一(dānyī),大量的mRNA 意义: 探针------原位杂交 siRNA------RNAi Transcript------体外翻译,蛋白表达
体外转录mrna的制备
体外转录mrna的制备（最新版）目录1.体外转录的定义和意义2.体外转录的步骤2.1 提取 cDNA 质粒2.2 线性化质粒2.3 纯化质粒2.4 模板 DNA 的线性化2.5 IVT 反应（加帽）2.6 模板 DNA 的去除3.体外转录的优点和应用4.赛多利斯在 mRNA 体外转录及纯化方面的经验和优势正文一、体外转录的定义和意义体外转录是指在实验室条件下，利用特定的酶和底物，将 DNA 模板转化为 RNA 分子的过程。
体外转录技术在生物科学研究中具有重要意义，它可以帮助研究人员获得大量、纯净的目标 RNA 分子，以便于进行后续的实验分析。
二、体外转录的步骤1.提取 cDNA 质粒：从细胞或组织中提取 mRNA，并通过反转录酶的作用，将 mRNA 转化为 cDNA，然后通过 PCR 扩增，得到目的基因的 cDNA 质粒。
2.线性化质粒：利用单一的酶切位点将质粒进行线性化，以便于后续的转录反应。
3.纯化质粒：将线性化后的质粒进行纯化，去除残留的 DNA 片段和RNase 污染，以保证转录反应的准确性。
4.模板 DNA 的线性化：将纯化的质粒进行线性化，以便于进行转录反应。
5.IVT 反应（加帽）：将线性化的模板 DNA 进行体外转录，合成 mRNA，并通过加帽反应，在 mRNA 的 5"端加上帽子结构，保护 mRNA 免受核酸酶的降解。
6.模板 DNA 的去除：将转录反应后的混合物进行处理，去除残留的DNA 模板，得到纯净的 mRNA 分子。
三、体外转录的优点和应用体外转录技术具有诸多优点，如操作简单、效率高、可控性强等。
在实际应用中，体外转录技术广泛应用于基因表达调控研究、蛋白质功能研究、药物筛选等领域。
四、赛多利斯在 mRNA 体外转录及纯化方面的经验和优势赛多利斯作为全球领先的生物制药设备和耗材供应商，拥有丰富的mRNA 体外转录及纯化经验。
其提供的设备和耗材具有高度的可靠性和稳定性，能够帮助客户降低生产成本，提高生产效率，确保生产工艺可成功放大至商业化规模。
mrna体外转录工艺流程
mrna体外转录工艺流程
mRNA体外转录工艺流程大致包括以下几个步骤：
1. 选择模板DNA：选择所需转录的目标mRNA序列，并合成DNA模板，通常采用化学合成或PCR方法合成。
2. 准备DNA模板：对DNA模板进行纯化和验证，以确保模板的质量和纯度。
3. 体外转录反应准备：将DNA模板与反转录酶（如T7 RNA 聚合酶）和其他所需的反应组分（如缓冲液、酶抑制剂、核苷酸）混合，并调整反应条件（如温度、时间、pH值）。
4. 反应进行：将反应混合液置于适当的温度下，通常在37°C 至42°C之间，启动反应。
在一定时间内进行反应，以使DNA 模板被反转录酶转录为mRNA。
5. RNA纯化：使用RNA纯化试剂盒或其他方法将反应体系中的RNA纯化，去除DNA模板、酶和其他杂质。
6. RNA质量评估：使用凝胶电泳或其他方法对纯化后的RNA 进行质量评估，验证转录的效果和纯度。
7. RNA修饰（可选）：根据需要，可以对转录得到的mRNA 进行修饰，如加入帽子结构、修饰尾端等，以提升mRNA的稳定性和转录后的翻译效率。
8. RNA浓缩和储存：使用适当的方法将mRNA浓缩，并以适当的方式储存，以便后续实验或应用。
需要注意的是，具体的工艺流程可能因特定实验目的、材料和设备的不同而有所差异，上述流程仅为一般性的描述。
在实际应用中，需要根据具体需求进行调整和优化。
mrna制备工艺
mrna制备工艺一、引言mRNA（messenger RNA）是一种重要的生物分子，它在生物体内起着将DNA信息转化为蛋白质的关键作用。
制备高质量的mRNA是生物医药领域中的关键技术之一。
本文将介绍mrna制备工艺的基本原理、常用方法和相关应用。
二、基本原理mRNA制备的基本原理是通过转录过程将DNA模板转化为mRNA分子。
在这个过程中，DNA的信息被转录成为mRNA的序列，然后mRNA通过核糖体翻译成蛋白质。
mRNA制备的关键在于选择合适的DNA模板、合成适当长度的mRNA分子，并保证其纯度和稳定性。
三、常用方法1. 基于体外转录的方法基于体外转录的方法是制备mRNA的常用方法之一。
该方法通过在体外使用RNA聚合酶将DNA模板转录成mRNA。
体外转录的优点是操作简单、高效，适用于大量制备mRNA。
常用的体外转录方法包括T7、T3和SP6体外转录系统。
2. 基于化学合成的方法基于化学合成的方法是制备mRNA的另一种常用方法。
该方法通过化学合成的方式直接合成mRNA分子。
化学合成的优点是可以合成特定序列、长度和修饰的mRNA。
常用的化学合成方法包括固相合成和液相合成。
3. 基于转染的方法基于转染的方法是一种新兴的mRNA制备方法。
该方法通过将DNA模板导入细胞内，然后利用细胞自身的转录和翻译系统合成mRNA。
基于转染的方法具有高效、低成本的优点，适用于细胞内mRNA制备。
四、mRNA制备工艺流程mRNA制备的工艺流程一般包括以下几个步骤：1. DNA模板准备选择合适的DNA模板，可以是线性DNA片段、质粒DNA或基因组DNA。
DNA模板需要经过纯化和鉴定，确保其质量和纯度。
2. DNA模板线性化将DNA模板线性化，以便于后续的转录反应。
线性化可以通过限制性内切酶切割DNA模板的特定位点来实现。
3. mRNA合成选择合适的mRNA合成方法，如体外转录或化学合成，将DNA模板转录成mRNA。
合成过程中需要添加适当的缓冲液、酶和核苷酸。
信使rna方法
信使rna方法
在分子生物学中，信使RNA（mRNA）合成的主要方法是通过体外转录。
以下是一般的步骤：
1. DNA模板准备：从源DNA中选择包含目标基因的区域，然后通过聚合酶链反应（PCR）或其他适当的方法扩增这一区域。
2. 体外转录：将DNA模板加入一个含有RNA聚合酶、核苷酸三磷酸（NTPs）、缓冲液和其他必需因子的反应体系中。
RNA聚合酶将在DNA模板上合成一条新的mRNA链，该链与DNA模板互补。
3. RNA纯化：通过使用适当的技术，如酚/氯仿提取或商业RNA纯化试剂盒，从反应混合物中纯化合成的mRNA。
4. mRNA修饰（可选）：可以在mRNA合成后对其进行修饰，如添加帽子结构和尾巴，以提高mRNA在细胞内的稳定性和翻译效率。
5. 质量控制：使用凝胶电泳或其他方法验证合成的mRNA的完整性和纯度。
这些步骤通常可以在实验室中执行，许多实验室也可以购买商业化的mRNA合成试剂盒，其中包括了所有必需的试剂和说明书。
这些mRNA合成的方法对于基因表达研究、RNA疫苗制备等领域都具有重要意义。
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基因体外转录与翻译
二、基因体外转录原理与操作
1、基因体内转录的过程 、
原核基因转录
真核基因转录
基因体外转录与翻译
二、基因体外转录原理与操作
2、基因体外转录的原理 、 基本的工作原理是以DNA为模板，在转录体系中 的一系列转录因子的作用下，经RNA聚合酶合成 RNA RNA。 基因体外转录体系在1976年由 年由PELHAM和 基因体外转录体系在 年由 和 JACKSON建立。体外转录体系逐渐成熟。 建立。 建立 体外转录体系逐渐成熟。
基因体外转录与翻译
二、基因体外转录原理与操作
3、基因体外转录的操作 、 聚合酶（ （1）RNA聚合酶（RNA Polymerases ） ） 聚合酶
常用的聚合酶为噬菌体来源的RNA聚合酶 聚合酶 常用的聚合酶为噬菌体来源的 T7 、SP6、T3 、 特异识别模板启动子 转录效率比大肠杆菌的聚合酶效率高 酶的来源及质量高
基因体外转录与翻译
四、基因体外翻译的原理与操作
3、基因体外翻译系统 、 （2）麦芽提取物 Wheat Germ Extract ） 麦芽提取物是不同于网织红细胞裂解物的另一个无细胞 体外合成体系。由于内源的mRNA很少，这个系统可用于各种 病毒、酵母、高等植物乃至哺乳动物蛋白的合成。当表达产物 较难与球蛋白区分（12—15kD）、或者表达产物正好可能是 哺乳动物细胞中富含而植物中没有的调控因子一类的蛋白时、 或者是不明原因表达不出时，就不妨尝试麦芽提取物体系。不 过要记住，这个体系要求RNA有帽子结构才能更好的翻译。 如果上述情况又无法给RNA加帽，就只好借助大肠杆菌体系 了。
基因体外转录与翻译
四、基因体外翻译的原理与操作
3、基因体外翻译系统 、 （1）兔网织红细胞系统 ）
兔网织红细胞用新西兰大白兔制备 ，通过纯化除去兔网织红细胞以外的污 染细胞。 染细胞。 网织红细胞裂解后，提取物用微球菌核酸酶破坏内源mRNA，最大限度降 网织红细胞裂解后，提取物用微球菌核酸酶破坏内源 ， 低翻译背景。 低翻译背景。 裂解物包含蛋白质台成所必须的细胞内组分(tRNA，核糖体，氨基酸，起 裂解物包含蛋白质台成所必须的细胞内组分 ，核糖体，氨基酸， 延伸、终止因子)。 始、延伸、终止因子 。 为使系统更适于mRNA 的翻译，兔网织红细胞中还添加了磷酸肌酸和磷酸 的翻译， 为使系统更适于 肌酸激酶的能量生成系统，以及氯化高铁血红素防止翻译起始的抑制， 肌酸激酶的能量生成系统，以及氯化高铁血红素防止翻译起始的抑制，此外 还添加了tRNAs混合物用于扩大 混合物用于扩大mRNA翻译的范围，以及乙酸钾和乙酸镁等。 翻译的范围， 还添加了 混合物用于扩大 翻译的范围 以及乙酸钾和乙酸镁等。 兔网织红细胞具有一定的翻译后加工活性，包括翻译产物的乙酰化， 兔网织红细胞具有一定的翻译后加工活性，包括翻译产物的乙酰化，异戊 二烯化，蛋白酶水解和一些磷酸化活性。 二烯化，蛋白酶水解和一些磷酸化活性。信号肽切除以及蛋白质糖基化等翻 译后加工事件可以通过加入犬微粒体膜来实现。 译后加工事件可以通过加入犬微粒体膜来实现。
质粒（ 质粒（Plasmids ）
基因体外转录与翻译
二、基因体外转录原理与操作
3、基因体外转录的操作 、 模板（ （2）线形的 ）线形的DNA模板（linear DNA template ） 模板
PCR产物（PCR Products） 产物（ 产物 ）
基因体外转录与翻译
二、基因体外转录原理与操作
基因体外转录与翻译
四、基因体外翻译的原理与操作
3、基因体外翻译系统 、 （1）兔网织红细胞系统Rabbit Reticulocyte Lysate ） 网织红细胞由红细胞分化而来，在体内主要是负责合成大量 血红蛋白（90%以上），以及球蛋白。这种未成熟的红细胞本身 不带细胞核，但却保留了这种高效翻译各种核酸信息的能力，可 减少背景，即使在较低的丰度下也能比较高效地合成产物。 根据测定，体外合成外源蛋白的效率接近完整网织红细胞自 身合成内源蛋白的效率。此外网织红细胞体系内源的核酸酶很少， 有助于长链RNA的稳定（包括有帽子或者没帽子结构的RNA）， 因而可以合成较大的蛋白。网织红细胞体系是最有希望做到微粒 体糖基化的体系。
基因体外转录与翻译
四、基因体外翻译的原理与操作
3、基因体外翻译系统 、 （1）兔网织红细胞系统 ） 体外翻译系统中 兔网织红细胞系统是 真核体外翻译系统中 应用最广泛的一种， 常用于较大的mRNA 种类鉴定，基因产物 性质的分析，转录和 翻译调控的研究，以 及共翻译加工的研究 等。
基因体外转录与翻译
3、基因体外转录的操作 、 模板（ （2）线形的 ）线形的DNA模板（linear DNA template ） 模板
寡核苷酸（ 寡核苷酸（Oligonucleotides ）
CDNA
基因体外转录与翻译
二、基因体外转录原理与操作
3、基因体外转录的操作 、 （3）基本反应体系 ）
基因体外转录与翻译
Genetic Engineering
主讲人: 主讲人 杜珍武
E-mail:phdzhw@
吉林大学 药学院
2010-12-14
基因工程教研室
1
基因体外转录与翻译
基因体外转录与翻译
in vitro transcription/translation 一、基因体外转录与翻译的意义 二、基因体外转录原理与操作 三、基因体外转录应用 四、基因体外翻译的原理与操作 五、基因体外翻译的应用
基因体外转录与翻译
四、基因体外翻译的原理与操作
3、基因体外翻译系统 、 （3）细菌提取物 ）
E. coli Cell-Free System
原核系统主要利用大肠杆菌的提取物进行表达。 原核系统主要利用大肠杆菌的提取物进行表达。利用大肠杆菌体系进 行体外表达，某些蛋白质每小时每个反应（ 行体外表达，某些蛋白质每小时每个反应（50ul）产物量可高达数百微克， ）产物量可高达数百微克， 在优化的批量系统中蛋白最终的产量达到1mg/ml也是可能达到的，这一 也是可能达到的， 在优化的批量系统中蛋白最终的产量达到 也是可能达到的 产率还可以通过连续反应器进一步得到提高。 产率还可以通过连续反应器进一步得到提高。 人们可以根据需要加入特殊添加剂如蛋白酶抑制剂，分子伴侣， 人们可以根据需要加入特殊添加剂如蛋白酶抑制剂，分子伴侣，代谢 非天然氨基酸甚至是少量的变性剂， 物，非天然氨基酸甚至是少量的变性剂，也可掺入特殊标记的氨基酸获得 带标记蛋白质。这样这种体系的弹性就非常大， 带标记蛋白质。这样这种体系的弹性就非常大，可以加入许多其它优化成 份以提高产率和提高溶解性。 份以提高产率和提高溶解性。 大肠杆菌的材料来源成本最低，实用性高， 大肠杆菌的材料来源成本最低，实用性高，表达效率也高
基因体外转录与翻译
三、基因体外转录应用
1、制备病毒RNA片段 、制备病毒 片段 用于证明病毒的侵染性 利用长链RT-PCR技术方法 利用长链RT-PCR技术方法 扩增出病毒全长cDNA，克隆入 扩增出病毒全长 ， 带有T7 聚合酶启动子质粒， 带有 RNA聚合酶启动子质粒， 聚合酶启动子质粒 以此cDNA为模板作体外转录， 为模板作体外转录， 以此 为模板作体外转录 转录产物转染细胞后观察到了典 型的病毒病变。 型的病毒病变。从而判定病毒的 侵染性
锤头状核酶
基因体外转录与翻译
三、基因体外转录应用
4、获得RNA探针 、获得 探针
基因体外转录与翻译
四、基因体外翻译的原理与操作
1、基因体内翻译的过程 、
基因体外转录与翻译
四、基因体外翻译的原理与操作
2、基因体外翻译的原理 、 无细胞蛋白质合成系统是一种以 外源mRNA或DNA为模板 通过在细 为模板,通过在细 外源 或 为模板 胞抽提物的酶系中补充底物和能源 物质来合成蛋白质的体外系统. 物质来合成蛋白质的体外系统 与传统的体内重组表达系统相 比,体外无细胞合成系统具有多种优 体外无细胞合成系统具有多种优 点,如可表达对细胞有毒害作用或含 如可表达对细胞有毒害作用或含 有非天然氨基酸(如 氨基酸 氨基酸)的特 有非天然氨基酸 如D-氨基酸 的特 殊蛋白质,能够直接以 能够直接以PCR产物作为 殊蛋白质 能够直接以 产物作为 模板同时平行合成多种蛋白质,开展 模板同时平行合成多种蛋白质 开展 高通量药物筛选和蛋白质组学的研 究等. 究等
基因体外转录与翻译
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
一、基因体外转录与翻译的意义
基因体外转录与翻译
一、基因体外转录与翻译的意义
体内操作
费事、费力、 费事、费力、工序烦琐
？？？
体外操作
研究蛋白质、 研究蛋白质、RNA方便需要 方便需要
快速、方便获得蛋白质、RNA
基因体外转录与翻译
二、基因体外转录原理与操作
1、基因体内转录的过程 、
基因体外转录与翻译
二、基因体外转录原理与操作
3、基因体外转录的操作 、 聚合酶（ （1）RNA聚合酶（RNA Polymerases ） ） 聚合酶
基因体外转录与翻译
二、基因体外转录原理与操作
3、基因体外转录的操作 、 模板（ （2）线形的 ）线形的DNA模板（linear DNA template ） 模板 要求： 聚合酶识别的双链启动子， 要求：有RNA聚合酶识别的双链启动子，被转录基 聚合酶识别的双链启动子 因。
基因体外转录与翻译
四、基因体外翻译的原理与操作
3、基因体外翻译系统 、 （3）细菌提取物 ）
E. coli Cell-Free System
s30原核体外翻译系统的E．colis30提取物是由OmpT内 切蛋白酶和Lon蛋白酶缺陷的E．coliB菌株制备，所以在s30 系统中表达基因可以增加产物的稳定性，尤其适用于在体外表 达时易被蛋白酶降解的蛋白质 。s30体外翻译系统也适台表达 那些在体内表达时由于宿主编码的抑制酶作用而表达水平低的 蛋白质，使其能高水平表达 。s30系统还可用于转录和翻译调 控的研究 此外，s30体外翻译系统的应用还包括台成少量标记 蛋白质用于蛋白纯化中作为示踪物质以及在蛋白质中掺人非天 然的氨基酸用于研究蛋白质的结构功能