蛹虫草中虫草素测定方法的比较

蛹虫草中虫草素测定方法的比较
孙军德;白立红;房琳琳;宋思丹
【摘要】The HPLC method and UV spectrophotometric method were used to measure the cordycepin of Cordyceps militaris. The recovery and RSD for the two methods were 100.1% and 2.3%; 100.21% and 1.19%, respectively. Both methods can be used for the determination of cordycepin. However the HPLC method is much more exclusive, sensitive and accurate.%采用紫外分光光度法和高效液相色谱法测定蛹虫草子实体中虫草素的含量.结果表明:这两种方法在测定蛹虫草子实体中虫草素的平均回收率分别为100.1%和100.2%,RSD分别为2.3%和1.2%.这两种方法均可作为蛹虫草子实体中虫草素含量的测定方法,但高效液相色谱法专属性强,灵敏度高,测定结果更为准确.【期刊名称】《沈阳农业大学学报》
【年(卷),期】2011(042)002
【总页数】4页(P212-215)
【关键词】蛹虫草;虫草素;高效液相色谱法;紫外分光光度法
【作者】孙军德;白立红;房琳琳;宋思丹
【作者单位】沈阳农业大学土地与环境学院,沈阳110161;沈阳农业大学土地与环境学院,沈阳110161;沈阳农业大学土地与环境学院,沈阳110161;沈阳农业大学土地与环境学院,沈阳110161
【正文语种】中文
【中图分类】S646.9
蛹虫草[Cordyceps militaris(L.)Link.]又称北虫草，是子囊菌纲肉座菌目麦角菌科
虫草属，为蛹虫草真菌寄生在鳞翅目昆虫蛹体上形成的子座与蛹体的结合体，是虫草属的模式种[1,2]。

冬虫夏草具有显著的药用价值，国内外对其需求量与日俱增[3]。

由于天然冬虫夏草产量有限，所以人工培育的蛹虫草子实体在医药、食品、
保健等领域已成为冬虫夏草的替代品[4]。

在医药领域中虫草素的地位是非常重要的，虫草素（cordecepin）又称虫草菌素，是虫草的特征性成分。

1950年由加拿大的CUNNINGHAM等[5]从蛹虫草的培养物中分离并鉴定出的其结构与腺苷非
常相似，其化学结构为3′－脱氧腺苷（3′－Deoxyadenosine）。

虫草素是蛹虫草的次生代谢产物[6－8]，是第一个从真菌中分离出来的核苷类抗菌素，具有多种生理活性和重要的药用价值。

由于蛹虫草品种繁多，虫草素含量参差不齐[9]，因此，市场迫切的需要找出一种简单、快速、准确的测定虫草素含量的方法来鉴定不同的虫草品种。

当前蛹虫草中虫草素的测定方法有很多[10]，但存在提取效率低或成本高等缺点。

因此，本研究对实验室常见的紫外分光光度法和高效液相谱法进行对比分析，以确定最佳的测定方法。

1 材料与方法
1.1 材料
蛹虫草（Cordyceps militaris）子实体由沈阳农业大学土地与环境学院微生物实
验室提供。

试验仪器与试剂为：沃斯特高效液相色谱仪，Breeze工作站，2487
紫外检测器；大连依利特C18色谱柱（4.6mm×250mm×5μm）；BL10－250A 超声波清洗仪，上海比朗仪器有限公司；752N紫外可见分光光度计，上海精研科学仪器有限公司；固萃企业SHA－C恒温震荡摇器，常州国华电器有限公司；DZF－6020型真空干燥箱，上海精宏实验设备有限公司；虫草素对照品（高纯试
剂99%）购于中国药品生物制品检定所；甲醇（色谱纯）购于天津市四友精细化学品有限公司；水（超纯水）为杭州娃哈哈集团有限公司生产，其他试剂均为分析纯。

1.2 方法
试验于2009年9月～2010年9月在沈阳农业大学土地与环境学院微生物学实验室进行。

1.2.1 虫草素提取方法目前虫草素的提取方法主要有水提法和醇提法等，本试验采用连续逆流提取法，用70%浓度乙醇按液料比7.5:1进行提取，浸泡3h后振荡3h，重复提取3次。

1.2.2 虫草素定性检测方法紫外分光光度法（UV）是将虫草素提取样品液在紫外分光光度计200～400nm波长范围内扫描，参考王陶等方法[14]，略有改动。

高效液相色谱法（HPLC）条件是依利特C18色谱柱（4.6mm×250mm×5μm），流动相甲醇-水（20：80，v/v），流速0.8mL·min-1，检测波长 260nm，进样20μL，20min 等度洗脱，参考索菲亚等方法[11]，略有改动。

1.2.3 线性关系紫外分光光度法（UV）精密称取1mg虫草素对照品，用超纯水溶解，稀释定容至10mL，制成0.1mg·L-1母溶液。

将母液稀释一定倍数，在紫外分光光度计上测定。

测定波长为200～400nm。

得到吸光度Y，以吸光度Y对虫草素质量浓度（mg·mL-1）X做标准曲线。

高效液相色谱法（HPLC）精密吸取一定量对照品溶液，分别稀释。

按色谱条件进样5次，每次进样20μL，得到峰面积Y，以峰面积Y对浓度X（mg·L-1）做标准曲线。

1.2.4 仪器精密度检验紫外分光光度法（UV）取虫草素样品提取液，稀释一定倍数，在260nm处连续测定5次。

高效液相色谱法（HPLC）精密吸取
0.05mg·mL-1浓度的虫草素对照品溶液，连续进样5针。

1.2.5 重现性检验紫外分光光度法（UV）将样品提取溶液5份，稀释一定倍数，
在260nm处连续测定。

高效液相色谱法（HPLC）将样品提取溶液5份，色谱条件分别进样。

1.2.6 稳定性检验紫外分光光度法（UV）将样品提取溶液1份，稀释一定倍数，在260nm处分别在1，2，4，8，12h测定吸收值；高效液相色谱法（HPLC）把样品提取溶液1份，分别在1，2，4，8，12h进样。

1.2.7 加样回收率试验紫外分光光度法（UV）取已知含量的样品5份，各1g精密称定，加入0.1mg·mL-1的对照品溶液。

稀释一定倍数，在260nm处测定。

高效液相色谱法（HPLC）取已知含量的样品5份，各2.5g精密称定，加入
0.1mg·mL-1的标准品溶液10mL。

2 结果与分析
2.1 虫草素定性检测方法
紫外分光光度法（UV）虫草素提取液样品液光谱扫描曲线由图1可见，在
260nm处都有最大吸收峰。

高效液相色谱法（HPLC）虫草素提取样品溶液经高效液相色谱仪测定，在
9.2min时出现峰与虫草素标准品溶液测定时出峰时间一致，说明在样品溶液中9.2min处出现的峰即为虫草素的峰（图2和图3）。

从样品定性角度来看，两种测定方法都有方法简便和操作快捷等特点。

从定性的准确性来看，在紫外分光光度法中，可以简单认为在260nm处的峰是由于虫草素的结构基团引起的，但也不排除其他物质在此波长处也有基团吸收值，这样在260nm处的总吸收值也可以认为是虫草素和其他基团物质吸收值的总和。

从高效液相色谱法测出的色谱峰的峰型、出峰时间等特点就可以充分的断定所测物质为虫草素，显而易见的排除了其他物质的混淆。

2.2 线性关系比较
紫外分光光度法（UV）通过线性关系得到回归方程为：Y=34.538X－0.1475
（R2=0.9967）。

测定样品吸光度，根据标准曲线计算虫草素的质量浓度（图4）。

高效液相色谱法（HPLC）通过线性回归得回归方程为Y=2E+08X+648346
（R2=0.9994）。

测定峰面积值，根据标准曲线计算虫草素的质量浓度（图5）。

由图4和图5可见，紫外分光光度法在样品浓度为0.005～0.04mg·mL－1的范
围内与峰面积呈良好的线性关系，高效液相色谱法在样品浓度为0.001～
0.1mg·mL－1的范围内与峰面积的线性关系良好。

高效液相色谱法的线性范围要
比紫外分光光度法的线性范围宽，即可测范围较大，但紫外分光光度法的线性范围有一定的局限性，限用于低浓度样品溶液的测定。

2.3 仪器精密度、重现性、稳定性结果比较
由表1可见，两种方法对在仪器重复5次测定同一样品，紫外分光光度计的RSD
为0.055%，高效液相色谱法RSD为0.092%，UV法的稳定性较好，精密度相对较高，而且误差小。

两种方法在重复测定同一样品时，高效液相色谱法RSD为
4.39%，紫外分光光度法RSD为0.16，HPLC测定的结果重现性较好。

在稳定性
试验中，紫外分光光度法RSD为0.38%，稳定性良好，高效液相色谱法RSD为0.55%，测试结果在12h内稳定。

表1 仪器精密度、重现性和稳定性测定结果Table 1 Comparing with the results仪器精密度Device precision RSD/%0.055 RSD/%0.092重现性试验Repeatability test 4.3900.160稳定性试验Stability test UV 0.107 0.108 0.107 0.107 0.108 0.108 0.200 0.105 0.09 0.111 0.100 0.109 0.108 0.107 0.109
0.380 HPLC 9818884 9907487 10057390 10282428 9897277 150608025 151081688 153448347 153103247 152629059 150408025 151081688 151671123 151103247 152629059 0.550
2.4 加样回收率试验比较
由表2可见，紫外分光光度法加样回收率平均值为100.1%，RSD为2.3%，回收试验良好；高效液相色谱法加样回收率平均值为99.914%，RSD为1.2%，回收试验良好。

3 结论
通过对HPLC法和UV法进行比较的，结果表明，其线性范围、稳定性、精密度、回收率、重复性等无明显差异，均稳定可靠，可以作为蛹虫草子实体中虫草素的含量测定方法，但考虑到HPLC测定方法具有样品处理简单、测定快速、方法重现性好、专属性强、灵敏度高、测定结果更为准确等特点，故本品的含量测定方法选择HPLC法。

紫外分光光度法虽然没有HPLC法那样精密准确，但其具有测定速度快速、成本低、稳定等优点，适合于预试验时期的初步探索测定方法。

表2 高效液相色谱法加样回收率试验结果（n=5）Table 2 Result of recovery test(n=5)样品含量/mg·mL-1 Sample content 0.375 0.376 0.382 0.381 0.380加入量/mg·mL-1 Added amount 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1测得量/mg·mL-1 Detected amount 0.465 0.479 0.481 0.483 0.484回收率/%Recovery 97.895 100.63 99.793 100.42 100.83 X/%Average recovery 99.914 RSD/%1.2
高效液相色谱法中，随着化学键合相色谱迅速的发展，已有很多关于核苷酸类化合物的分离。

由于虫草素不含磷酸根，所以最适用C18柱分离。

郭澄等用高效液相色谱法测定蛹虫草菌丝体中的虫草素，选择的流动相是磷酸二氢钠-氢氧化钠缓冲液（pH6.8，加1%四氢呋喃），得到满意的回收率[15]。

本试验在在筛选流动相过程中，曾选用甲醇-磷酸盐流动相，分离度尚佳，保留时间也较适合。

但是，磷
酸盐缓冲液容易堵塞而损害机器，不适合长时间使用。

经过多种不同流动相试验最后确定甲醇与水作为流动相，这种组成的流动相对机器的损伤较小，便于机器的清洗维护，而且使定量分析的准确性也得到提高。

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