仔猪散发亚临床猪瘟及其抗体效价分析

仔猪散发亚临床猪瘟及其抗体效价分析
吴凌;白云龙;冉旭华;夏成;邵红
【摘要】黑龙江某养猪户仔猪零星发病死亡，经PCR诊断为亚临床猪瘟。

采集了60头母猪血，采用间接ELISA试剂盒检测60头母猪猪瘟免疫抗体水平。

结果表明，该户母猪猪瘟免疫抗体水平较低，免疫抗体合格率仅为3.3%。

因此，母猪免疫失败是导致仔猪散发猪瘟的主要原因。

%Some piglets died in a pig farm sporadically, and diagnosed as subclinical swine fe-ver by a PCR test. Blood samples were collected from 60 sows for detecting immune antibody levels of swine fever. Results showed that swine fever antibody levels were low after vaccination in sow, the qualified rate of immune antibody is only 3.3%. Therefore, immune failure to swine fever in sows was the main reason caused swine fever occur sporadically in these piglets herd.
【期刊名称】《现代畜牧兽医》
【年(卷),期】2014(000)007
【总页数】4页(P35-38)
【关键词】亚临床猪瘟;间接ELISA;抗体;检测
【作者】吴凌;白云龙;冉旭华;夏成;邵红
【作者单位】黑龙江省八一农垦大学动物科技学院，黑龙江大庆 163319;黑龙江省八一农垦大学动物科技学院，黑龙江大庆 163319;黑龙江省八一农垦大学动物科技学院，黑龙江大庆 163319;黑龙江省八一农垦大学动物科技学院，黑龙江大庆 163319;黑龙江省八一农垦大学动物科技学院，黑龙江大庆 163319
【正文语种】中文
【中图分类】S858.28
猪瘟（classical swine fever，CSF）是由黄病毒科瘟病毒属的猪瘟病毒（classical swine fever virus，CSFV）引起的一种热性高度接触性传染病，不同品种各年龄段猪群均易感，世界动物卫生组织将其列为A类传染病。

近年来，猪瘟的流行和发病特点以及病理变化都发生了很大变化，主要表现为隐性感染、亚临床感染或非典型性，目前尤其是免疫母猪在临床上没有任何临床症状，但是携带病毒。

这种母猪的垂直传播病毒率高达 45%～100%，影响胎儿发育，产木乃伊仔猪，死胎，或产下带毒仔猪，这种带毒仔猪无论是吃初乳还是免疫接种疫苗均不能消除体内的病毒，临床上表现为仔猪发病，死亡[1-2]。

黑龙江某养猪户，不时有仔猪发病死亡，从临床症状、剖检变化以及核酸检测，诊断为亚临床猪瘟。

为查明病因，本研究采集母猪血液对猪瘟免疫情况进行了检测，现将结果报告如下，为以后临床亚临床猪瘟防治提供参考依据。

1.1 病料和血清无菌采取新死仔猪的脾脏、淋巴结。

随机采集免疫接种过猪瘟兔化弱毒疫苗60头母猪血清。

1.2 主要试剂 TRIZOL Reagent购自GIBCO BRL（Li fe Tech-nologies，Inc）；其他试验用酶及其他试剂，均购自大连宝生物工程公司；引物序列：P1：
5’CAGGTATGCGATCTCGTCAACCA3’，P2：5’GGGCACAGCCCA AATCCGAAGT3’，由大连宝生物工程公司合成。

扩增长度为288 bp目的片段[3]。

猪瘟病毒间接ELISA抗体检测试剂购自兰州兽医研究所，2～8℃保存，有效期为180 d。

2.1 CSFV的检测取采集的仔猪脾脏和淋巴结组织约1 g于研磨器充分研磨，用
Hanks液1∶5稀释，反复冻融3次，8 000 r/min离心10 min，取上清液
400μL，加入800μL Trizol，混匀后室温放置5 min。

加入200μL氯仿，旋涡振
荡15 s混匀，室温下放置2～3 min，12 000 r/min离心10 min。

取上清转移到新的EP管，再加入500μL异丙醇混匀，室温下放置10 min。

12 000 r/min离
心10 min，弃上清，再加入75%酒精1 000μL，旋涡振荡混匀，12 000 r/min
离心5 min，晾干，用适量无RNzse水溶解RNA。

然后取提取的RNA 10μL，Primer（P2下游）1μL，70℃ 5 min，置于冰上2 min，加入5×RT Buf fer 4μL，10 mmol/L dNTP Mixture 2μL，40 U/μL RNase Inhibitor 1μL，混匀，37℃ 5 min，加入5 U/μL AMVReverse Transcriptase XL 1μL 42℃ 2.5 h，70℃ 10 min放于冰上待用。

将合成的cDNA（CSFV）作为模板，进行PCR扩增。

反应体系为25μL，其中10× Taq酶Buf fer（Mg2+）2.5μL，MgCl2+5 U/μL Taq酶
1 μL，2.5 mmoL/L dNTP 2μL，10μmol/L的P1P2上下游引物各1μL，CSFV
的CDNA 5μL，H2O 3μL。

混匀后置于PCR仪中扩增。

反应程序为：94℃预变
性5 min，进行30循环（94℃ 30 s、50℃ 40 s、72℃ 1 min），72℃延伸10 min，最后降温至4℃结束。

取PCR产物与10×DNA样缓冲液混合，在1%琼脂
糖凝胶上电泳20 min，用溴化乙锭染色，50 V电压电泳1 h左右后，在紫外检测仪下观察电泳结果。

2.2 CSFV阳性重组子的鉴定与测序使用小量胶回收试剂盒（上海华瞬生物工程有限公司）进行。

取纯化的DNA样品，进行电泳，观察其纯度。

然后与pMD18-T 载体进行连接，连接反应总体积10μL，16℃连接过夜；反应完毕后，全量转化
TG1感受态细胞。

涂布于含有IPTG、Xgal和Amp+LB的琼脂平板，37℃培养过夜。

挑取单菌落于5 mL含Amp+的 LB液体培养基中，37℃震荡培养过夜，按《分子克隆实验指南》的碱裂解法小剂量制备质粒的步骤进行阳性质粒提取。

根据Primer 5.0软件对CSFV基因的cDNA参考序列和pMD18-T载体的质粒图谱用
Hind III、BamHI进行重组质粒的酶切鉴定。

用0.8%琼脂糖凝胶电泳分析酶切结果。

再用PCR鉴定CSFV阳性重组子，将鉴定正确的阳性重组子送大连宝生物工
程公司测序。

2.3 血清抗体的检测用血清稀释液对阳性和阴性标准血清做1∶20稀释，每孔
50μL，阴、阳性标准血清各做2孔；待检血清样品用血清稀释液做1∶20稀释，同时设2孔不加任何血清样品的空白对照孔。

密封，37℃结合45 min。

洗板：弃去孔内液体，然后将25倍洗涤液用灭菌水或超纯水稀释成1倍工作液，每孔加入220～300μL洗板，反复4次，最后一次弃净孔内液体。

加入酶标二抗：浓缩酶标记抗体用血清稀释液做1∶100稀释，每孔加入50 μL，密封，37℃结合45 min （注意：从加入第一孔时开始计时间）。

重复洗板步骤。

加入底物：将底物A和
B作1∶50体积混匀，每孔加入50μL，轻轻震荡混匀，密封。

37℃避光作用15 min。

加样的顺序应同加入酶标二抗保持一致，从加入第一孔时开始计时间。

终止反应：每孔加入50μL终止液，轻摇混匀，测定吸光度OD490nm。

3.1 CSFV的检测结果见图1。

由图1可见，用RT-PCR方法，以逆转录合成的的cDNA为模板，用引物P1、
P2扩增出约288bp的目的片段，与预计的理论值相符。

表明发病猪场的病猪的病原为猪瘟病毒。

2.2 CSFVCSFV序列测定及同源性比较结果见图2。

分离株与GenBank中发表的同源毒株序列进行比较，其核苷酸同源性为89.41%。

从进化树的关系上看引起发病的病毒与32在同一聚类上。

3.3 血清抗体检测结果见表1和表2。

结果判定：根据OD490值计算P/N值（阳性血清OD940值/阴性血清OD490值，其中P为标准阳性血清的OD490，N为2孔标准阴性血清的平均OD490）。

当P/ N值≥5，表示试验成立，然后根据S/N值对待检血清进行判定（S为待检
血清的OD490值），阴性为S/ N≤1.5，可疑为1.5≤S/N≤2，阳性为S/N＞2，抗体保护临界值为S/N≥2.5。

在散养猪场所采60份母猪血清中，S/N≥2.5的有2孔，占3.3%，2≤S/N≤2.5
的为0，1.5≤S/N≤2的有6孔，占10%，S/N≤1.5的有40孔，占80%。

据判定标准和S/N值计算结果表明，被检测的60头仔猪免疫都没有达到抗体保护临界值，阳性反应的仅占3.3%，说明猪瘟免疫失败。

本研究表明，黑龙江省某养猪户仔猪散发病死亡的病原为猪瘟病毒。

抗体检测结果显示，猪瘟抗体保护率仅为3.3%，母猪的免疫效果差，使得仔猪不能从母乳中获得充足的母源抗体达到防控猪瘟的目的。

在饲养管理不佳、环境污染严重、应激等情况下仔猪易感染野毒引发亚临床猪瘟[4]。

该养猪户采用一般的春秋两季免疫猪瘟疫苗。

春秋两季正是春种和秋收最忙的季节，因农户家经常没人，从而未能及时接种猪瘟疫苗，致使统一免疫免疫密度不能得到完全的保证，另一方面疫苗对温度的要求也较高，农村条件有限，稀释以后的疫苗如不能及时接种，保存不当会存在失效的可能。

这些因素可能都直接或间接地导致了猪瘟免疫合格率低，母猪易成为隐性感染者[5-6]。

该养猪户种母猪带毒会产出免疫系统不健全或持续感染的仔猪，引起仔猪发生亚临床猪瘟。

或者仔猪摄入母源抗体少，抗体消失早，也易感染猪瘟病毒，进而形成了疾病的传播链。

因此，在猪瘟的控制过程中，保证种猪有一个较高的稳定的猪瘟抗体水平具有至关重要的作用；同时，淘汰隐性感染的母猪，减少仔猪感染的机会。

配合新生仔猪的超前免疫，并加强消毒、隔离等预防措施，可以保证仔猪健康[7-9]。

【相关文献】
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