环境激素污染生态学专题期末考试试题

环境激素污染生态学专题期末考试试题（国家海洋局第一海洋研究所2002级硕士研究生郝玉）1.1 什么叫环境激素？有那些主要特征？环境激素(Environmental hormones)，是一类人工合成（自然界也有存在）的化合物，它们能够干扰人和动物体内激素的合成、释放、运输、代谢、激素与受体的结合、功能的表达等一系列生物过程，从而扰乱人和动物的内分泌系统、神经系统和免疫系统的机能，甚至造成对生物后代生殖功能的潜在影响,亦称为内分泌扰乱化学物质（Endocrine disrupting chemical）;拟雌激素化合物（Estrogen-mimicking chemicals）;外源雌激素（Xenoestrogens）等。

主要包括一些合成的工业有机化合物，如多氯联苯(PCBs),工业洗涤剂烷基酚类化合物（Alkglphenol）,邻苯二甲酸酯类化合物等；有机氯杀虫剂DDT,甲氧滴滴涕，ß－六氯环己烷，有机磷杀虫剂马拉硫磷（Malathion）等；工业生产的副产物二恶英（Doxin）;人工合成的雌激素乙炔雌二醇（EE2）,乙烯雌酚（DES）;植物雌激素ß－谷甾醇（ß－sitosterol）;一些无机物也具有扰乱人及生物内分泌系统的作用，如镉（Cd）等。

虽然化学物质在结构上不尽相同，甚至千差万别，但他们却有着相似的化学性质：脂溶性；难于降解；易于生物积累等。

2.2 如何从遗传毒理学、分子毒理学角度解释环境激素的作用机制。

⑴直接进入细胞内环境激素直接进入细胞内，作用于细胞核内的核酸或酶系统，引发遗传变异，虽然发生的几率很小，但不排除其可能性。

⑵与荷尔蒙受体相结合天然荷尔蒙是通过细胞内或细胞膜结合受体，与特定组织相互作用的。

而某些环境激素分子结构与生物体的荷尔蒙结构类似，进而竞争受体或改变受体的识别，如多氯联苯某些化合物分子与天然甲状腺素相似，对甲状腺素产生干扰。

甲氧DDT、壬基酚等能够干扰雌激素受体，烯菌酮具有抗雄性激素的作用，这是因为它的代谢物对雄性激素的受体有亲和作用。

环境激素的介入，与细胞膜上的荷尔蒙结合位点形成配体－受体复合物，而配体－受体复合物再结合在DNA结合区的DNA反应元件上，继而mRNA翻译成蛋白质并表现出拟激素作用，启动一系列生理生化过程。

⑶阻碍天然荷尔蒙与受体的结合某些环境激素具有阻碍天然荷尔蒙合成的能力，如在类固醇的合成过程中，酮康唑可阻碍特定的酶反应，使类固醇类物质不能合成或合成量不足，比如睾丸酮是一种类固醇的物质，睾丸酮的欠缺会使精子数量以及质量均受到严重的影响，这一作用机制的观点被美国的Peter M. Vonier 教授所证实。

另外雌激素的合成可被多菌醇所阻滞，肾上腺激素的合成可被二硫化碳改变，这些都造成体内荷尔蒙水平的变化，从而导致机体失调。

⑷作用于细胞传导通路环境激素可调节细胞膜上的离子通道：细胞内的Ca2+浓度若超过10µmol/L属于不正常范围，但细胞外Ca2+的浓度却超过细胞内的万倍。

正常细胞内Ca2+的调节机理是通过细胞膜上钙受体蛋白来发挥作用，环境激素的介入，能与细胞膜上的钙受体蛋白结合，导致细胞内外的信号传导的破坏，引起细胞代谢失调甚至死亡。

如某些金属离子会干扰Ca2+在膜内的流动，硫丹可阻断γ－氨基丁酸介导的氯通道。

一些PCB8影响钙的体内平衡和蛋白激酶的活性，也就是说，环境激素可通过调节细胞信号的途径来产生应答。

⑸影响内分泌系统与其它系统的调控作用内分泌系统与免疫、神经、生殖等各个系统相互影响相互制约，内分泌调节和神经调节共同构成了机体的统一调控机制，内分泌系统的紊乱会使其它系统受到伤害，从而引发癌症、免疫毒性、神经毒性等。

如甲状腺功能地下可造成神经系统的异常，神经与免疫系统受到损害，内分泌系统也会发生障碍。

⑹自由基学说自由基是体内不可缺少的，它可以维持体内细胞的正常功能，但若过量会对精子造成损害，如过氧阴离子等自由基的过氧化作用是精子的膜变硬，精液的流动性降低，精子活力下降，导致精子的完整性、运动性及其他的功能产生不可逆转的反应，促进理精子的死亡，所以，过量的自由基是造成男性不育的主要病因。

⑺肝酶系统的影响人体的肝酶系统可以影响荷尔蒙在体内的水平。

如DDT可诱导肝微粒体单氧酶活性，从而通过肝氧酶系统加速雄激素的清理过程。

⑻环境激素间的协同作用环境激素的种类繁多，存在各化学的协同作用、联合作用的强度远远大于单独作用的强度，当两种激素活性较弱的环境化合同时作用机体时，其激素的样作用明显增加，甚至可达到单作用的1000以上，美国新奥尔良生物环境研究中心采用含有人雌激素受体（hER）质粒传染过的酵母细胞（酵母雌激素系统简称YES）检测多种环境雌激素单独作用及联合作用的雌激素活性比较，如下图：可以看出,单独检测狄氏剂、硫丹、毒杀酚时仅表现微弱的活性,但混合在一起后的活性要高于叠加反应,产生了生物放大效应。

甚至单独作用未检出激素活性的氯丹,与其他环境激素产生极强的协同作用,且它们之间的协同作用因组合的不同而不同,致毒机理十分复杂。

3.3 请综述环境激素的生物筛选方法。

1996年美国国家环保局(U.S.EPA)提出了评价化学物质内分泌扰乱作用的渐进逼近法。

首先，根据原始数据提出化学物质筛选的优先顺序，然后进行1级筛选和2级筛选。

1级筛选主要采用活体和离体筛选技术，对1级筛选后具有内分泌扰乱作用的化学物质进行2级筛选，2级筛选主要采用活体筛选技术，方法和指标要根据1级筛选的结果进行选择，为化学物质的危险评价提供科学的定量化数据。

★离体（in vitro）筛选技术（1）乳腺癌细胞增殖筛选法雌激素活具有雌激素作用的化学物质可以刺激乳腺癌细胞的分裂增殖，因此，乳腺癌细胞十筛选内分泌扰乱化学物质的敏感细胞系。

目前应用的乳腺癌细胞系主要又两种：MCF-7和Zr-75。

MCF－7是普遍应用的一个细胞系，内分泌扰乱化学物质对细胞的增殖作用可以通过传统的细胞计数法得出结论，目前新开发的MTT荧光染色法更简便可靠。

筛选过程通常以17ß－雌二醇（E2）作为参照，对类雌激素化合物雌激素活性进行分级。

Zr-75同样含有雌激素受体（ER）,在雌激素或类雌激素的刺激下，利用细胞的分裂增殖指示内分泌扰乱化学物质的类雌激素作用。

利用乳腺癌细胞系增殖筛选法需要注意的是，培养基的指示剂－酚红也具有类雌激素的作用，可能对结果产生干扰；另外利用不同来源的血清结果可能差别很大。

（2）鱼类原代肝细胞筛选法鱼的肝细胞中有卵黄原蛋白（vtg）基因，在雌激素促机下肝细胞可分明卵黄原蛋白，如果化学物质具有类雌激素的作用，就可以在培养基中检测到诱导产生的卵黄原蛋白。

鱼的肝细胞中也含有芳烃受体（AR）,它与抗雌激素活性的表达相关，具有抗雌激素活性的内分泌扰乱化学物质与细胞色素P4501A1家族中的芳烃受体相作用，一起芳烃羧化酶的表达，分解E2等内源性雌激素，从而表达了抗雌激素的活性。

已报道的鱼类肝细胞筛选方法主要是应用红鳟鱼(Oncorhynchus mykiss)的原代肝细胞。

这种筛选方法的优点是不仅可以反映内分泌然乱化学物质中类雌激素的作用，也可以反映抗雌激素的作用。

（3）转导酵母细胞筛选法转导酵母细胞生物筛选系统（RCBA recombinant yeast cell bioassay），也称为酵母雌激素筛选系统（YES, yeast esteogen system）,原理是把人类雌激素受体（hER）基因序列整合导酵母细胞DNA上，同时转导的还有含有雌激素反应元件（estrogen responsive element ,ERE）和报告基因lac-Z(编码β－半乳糖苷酶)的质粒。

如果有雌激素或具有类雌激素作用的化学物质存在，就会使ß－半乳糖苷酶表达并分泌进入培养基中，引起颜色反应，使培养基由黄变红，从而确定雌激素的活性。

这个筛选系统对雌激素非常敏感，而且简便、经济、快速，Nick等报道其敏感性比MCF-7细胞系和小白鼠子宫上皮筛选系统分别大3和5倍。

（4）雌激素受体竞争筛选法雌激素受体竞争筛选法使内分泌扰乱化学物质筛选中常用的方法之一，它使根据类雌激素化合物与雌激素受体结合能力的大小，判定化合物的雌激素活性。

常用的雌激素受体有小鼠子宫上皮细胞的雌激素受体及雌鱼肝细胞雌激素受体。

由于雌激素受体筛选法是以化合物与雌激素受体结合能力为基础的，因而并不能全面反映化合物的雌激素活性，有时与活体筛选法的结论差异很大，需要其它的方法的结果作为参照。

以上4种离体筛选法的优势是明显的：耗资少，材料易于培养，可以大规模的筛选，有较好的重复性。

但是也有明显的不足，因为这些方法是建立在类雌激素化合物与雌激素受体相互作用的基础之上，尤其没有考虑到生物积累和生物代谢等因素，不能全面反映内分泌扰乱化学物质的作用机制及对生物体产生对危害。

★活体筛选技术目前，国内外活体筛选技术所选择的模型动物有鱼类、两栖类、爬行类、鸟类、啮齿类和灵长类等。

（1）以雄鱼卵黄原蛋白为指标的筛选法卵黄原蛋白（Vitellogenin vtg）是一种高分子量的脂磷聚糖蛋白（Lipophospoglycoprotein）,是雌鱼的特异性蛋白，在卵黄形成期雌激素的刺激下，由肝脏产生，通过血液循环进入卵巢，被卵巢吸收。

因为幼鱼和雄鱼肝脏中也含有雌激素受体和卵黄原蛋白基因，因而雌激素和内分泌扰乱化学物质也能诱导雄鱼卵黄原蛋白的分泌，甚至低浓度的内分泌扰乱化学物质也可引起卵黄原蛋白的分泌，因而卵黄原蛋白是一个非常敏感和方便的筛选指标。

卵黄原蛋白的生物标记方法有很多，定量方法有放射免疫测定法，酶链免疫吸收法(ELISA)；定性方法有免疫印记(Western blot),SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），常规聚丙烯酰胺凝胶电泳（Native-PAGE）等。

因为卵黄原蛋白的种间差异，所以定性方法对每一种鱼都需要纯化抗体。

但是，Charles等用鲤鱼（Cyprinus carpio）的卵黄原蛋白抗体监测胖头鱼（Pimephales promelas）的卵黄原蛋白也取得了较好的结果，因而认为同科鱼的卵黄原蛋白抗体可以交叉使用。

卵黄原蛋白对雄鱼来说是一种多余的蛋白质，它的分泌对雄鱼可产生一定对消极影响：引起体内Ca2+流失及肾功能的衰竭，还会引起生殖能力的降低并抑制精巢的生长。

对雌鱼来说，如果卵黄原蛋白的分泌量降低表明抗雌激素的存在，过低的卵黄原蛋白水平会使卵中卵黄含量降低，从而影响卵的孵化率和仔鱼的成活率，并可能引起卵巢成熟的延迟。

（2）以雄鱼卵膜蛋白产生为指标的筛选法卵膜蛋白(Z ona radiata proteins, zr-proteins),是组成鱼类卵壳的蛋白质，含有αβγ三个单体，具有保护卵发育时免受机械损伤等作用。