叶绿体表达载体--如何构建载体

如何构建载体1 启动子的选用和改造外源基因表达量不足往往是得不到理想的转基因植物的重要原因。

由于启动子在决定基因表达方面起关键作用，因此，选择合适的植物启动子和改进其活性是增强外源基因表达首先要考虑的问题。

目前在植物表达载体中广泛应用的启动子是组成型启动子，例如，绝大多数双子叶转基因植物均使用CaMV35S启动子，单子叶转基因植物主要使用来自玉米的Ubiquitin启动子和来自水稻的Actinl启动子。

在这些组成型表达启动子的控制下，外源基因在转基因植物的所有部位和所有的发育阶段都会表达。

然而，外源基因在受体植物内持续、高效的表达不但造成浪费，往往还会引起植物的形态发生改变，影响植物的生长发育。

为了使外源基因在植物体内有效发挥作用，同时又可减少对植物的不利影响，目前人们对特异表达启动子的研究和应用越来越重视。

已发现的特异性启动子主要包括器官特异性启动子和诱导特异性启动子。

例如，种子特异性启动子、果实特异性启动子、叶肉细胞特异性启动子、根特异性启动子、损伤诱导特异性启动子、化学诱导特异性启动子、光诱导特异性启动子、热激诱导特异性启动子等。

这些特异性启动子的克隆和应用为在植物中特异性地表达外源基因奠定了基础。

例如，瑞士CIBA-GEIGY公司使用PR-IA启动子控制转基因烟草中Bt毒蛋白基因的表达，由于该启动子可受水杨酸及其衍生物诱导，通过喷酒廉价、无公害的化学物质，诱导抗虫基因在虫害重发生季节表达，显然是一个十分有效的途径。

在植物转基因研究中，使用天然的启动子往往不能取得令人满意的结果，尤其是在进行特异表达和诱导表达时，表达水平大多不够理想。

对现有启动子进行改造，构建复合式启动子将是十分重要的途径。

例如，Ni等人将章鱼碱合成酶基因启动子的转录激活区与甘露碱合成酶基因启动子构成了复合启动子，GUS表达结果表示：改造后的启动子活性比35S启动子明显提高。

吴瑞等人将操作诱导型的PI-II基因启动子与水稻Actinl基因内含子1进行组合，新型启动子的表达活性提高了近10倍（专利）。

在植物基因工程研究中，这些人工组建的启动子发挥了重要作用。

2 增强翻译效率为了增强外源基因的翻译效率，构建载体时一般要对基因进行修饰，主要考虑三方面内容：2.1添加5｀-3｀-非翻译序列许多实验已经发现，真核基因的5｀-3｀-非翻译序列（UTR）对基因的正常表达是非常必要的，该区段的缺失常会导致mRNA的稳定性和翻译水平显著下降。

例如，在烟草花叶病毒（TMV）的126kDa蛋白基因翻译起始位点上游，有一个由68bp核苷酸组成的Ω元件，这一元件为核糖体提供了新的结合位点，能使Gus基因的翻译活性提高数十倍。

目前已有许多载体中外源基因的5｀-端添加了Ω翻译增强序列。

Ingelbrecht等曾对多种基因的3｀-端序列进行过研究，发现章鱼碱合成酶基因的3｀-端序列能使NPTII基因的瞬间表达提高20倍以上。

另外，不同基因的3｀-端序列增进基因表达的效率有所不同，例如，rbcS3｀-端序列对基因表达的促进作用比查尔酮合酶基因的3｀-端序列高60倍。

2.2 优化起始密码周边序列虽然起始密码子在生物界是通用的，然而，从不同生物来源的基因各有其特殊的起始密码周边序列。

例如，植物起始密码子周边序列的典型特征是AACCAUGC,动物起始密码子周边序列为CACCAUG，原核生物的则与二者差别较大。

Kozak详细研究过起始密码子ATG周边碱基定点突变后对转录和翻译所造成的影响，并总结出在真核生物中，起始密码子周边序列为ACCATGG时转录和翻译效率最高，特别是-3位的A对翻译效率非常重要。

该序列被后人称为Kozak序列，并被应用于表达载体的构建中。

例如，有一个细菌的几丁质酶基因，原来的起始密码周边序列为UUUAUGG，当被修饰为ACCAUGG，其在烟草中的表达水平提高了8倍。

因此，利用非植物来源的基因构建表达载体时，应根据植物起始密码子周边序列的特征加以修饰改造。

2.3对基因编码区加以改造如果外源基因是来自于原核生物，由于表达机制的差异，这些基因在植物体内往往表达水平很低，例如，来自于苏云金芽孢杆菌的野生型杀虫蛋白基因在植物中的表达量非常低，研究发现这是由于原核基因与植物基因的差异造成了mRNA稳定性下降。

美国Monsanto公司Perlak等人在不改变毒蛋白氨基酸序列的前提下，对杀虫蛋白基因进行了改造，选用植物偏爱的密码子，增加了GC含量，去除原序列下影响mRNA稳定的元件，结果在转基因植株中毒蛋白的表达量增加了30～100倍，获得了明显的抗虫效果。

3 消除位置效应当外源基因被移人受体植物中之后，它在不同的转基因植株中的表达水平往往有很大差异。

这主要是由于外源基因在受体植物的基因组内插入位点不同造成的。

这就是所谓的"位置效应"。

为了消除位置效应，使外源基因都能够整合在植物基因组的转录活跃区，在目前的表达载体构建策略中通常会考虑到核基质结合区以及定点整合技术的应用。

核基质结合区（matrix association region,MAR）是存在于真核细胞染色质中的一段与核基质特异结合的DNA序列。

一般认为，MAR序列位于转录活跃的DNA环状结构哉的边界，其功能是造成一种分割作用，使每个转录单元保持相对的独立性，免受周围染色质的影响。

有关研究表明，将MAR置于目的基因的两侧，构建成包含MAR-gene-MAR结构的植物表达载体，用于遗传转化，能明显提高目的基因的表达水平，降低不同转基因植株之间目的基因表达水平的差异，减少位置效应。

例如，Allen等人研究了异源MAR（来自酵母）和同源MAR （来自烟草）对Gus基因在烟草中表达的影响，发现酵母的MAR能使转基因表达水平平均提高12倍，而烟草本身的MAR能使转基因的表达水平平均提高60倍。

使用来源于鸡溶菌酶基因的MAR也可起到同样作用。

另一可行的途径是采用定点整合技术，这一技术的主要原理是，当转化载体含有与寄主染色体同源的DNA片段时，外源基因可以通过同源重组定点整合于染色体的特定部位。

实际操作时首先要分离染色体转录活性区域的DNA片段，然后构建植物表达载体。

在微生物的遗传操作中，同源重组定点整合已成为一项常规技术，在动物中外源基因的定点整合已获得成功，而在植物中除了叶绿体表达载体可实现定点整合以外，细胞核转化中还很少有成功的报道。

4 构建叶绿体表达载体为了克服细胞核转化中经常出现的外源基因表达效率低，位置效应及由于核基因随花粉扩散而带来的不安全性等问题，近几年出现的一种新兴的遗传转化技术--叶绿体转化，正以它的优越性和发展前景日益为人们所认识并受到重视。

到目前为止，已在烟草、水稻、拟南芥、马铃薯和油菜（侯丙凯等，等发表）5种植物中相继实现了叶绿体转化，使得这一转化技术开始成为植物基因工程中新的生长点。

由于目前多种植物的叶绿体基因组全序列已被测定，这就为外源基因通过同源重组机制定点整合进叶绿体基因组奠定了基础，目前构建的叶绿体表达载体基本上都属于定点整合载体。

构建叶绿体表达载体基本上都属于定点事例载体。

构建叶绿体表达载体时，一般都在外源基因表达盒的两侧各连接一段叶绿体的DNA序列，称为同源重组片段或定位片段（Targeting fragment）。

当载体被导入叶绿体后，通过这两个片段与叶绿体基因组上的相同片段发生同源重组，就可能将外源基因整合到叶绿体基因组的特定位点。

在以作物改良为目的的叶绿体转化中，要求同源重组发生以后，外源基因的插入既不引起叶绿体基因原有序列丢失，又不致于破坏插入点处原有基因的功能。

为满足这一要求，已有的工作都选用了相邻的两个基因作为同源重组片段，例如rbcL/accD，16StrnV/rpsl2rps7,psbA/trnK,rps7/ndhB。

当同源重组发生以后，外源基因定点插入在两个相邻基因的间隔区，保证了原有基因的功能不受影响。

最近，Daniel等利用烟草叶绿体基因trnA和trnI作为同源重组片段，构建了一种通用载体（universal vector）。

由于trnA和trnI的DNA序列在高等植物中是高度保守的，作者认为这种载体可用于多种不同植物的叶绿体转化。

如果这种载体的通用性得到证实，那么这项工作无疑为构建方便而实用的新型叶绿体表达载体提供了一个好的思路。

由于叶绿体基因组的高拷贝性，定点整合进叶绿体基因组的外源基因往往会得到高效率表达，例如McBride等人首次将Bt CryIA(c)毒素基因转入烟草叶绿体，Bt毒素蛋白的表达量高达叶子总蛋白的3%～5%，而通常的核转化技术只能达到0.001%～0.6%。

最近，Kota等将Bt Cry2Aa2蛋白基因转入烟草转入烟草叶绿体，也发现毒蛋白在烟草叶子中的表达量很高，占可溶性蛋白的2%～3%，比细胞核转化高出20～30倍，转基因烟草不仅能抗敏感昆虫，而且能够百分之百地杀死那些产生了高抗性的昆虫。

Staub等最近报道，将人的生长激素基因转入烟草叶绿体，其表达量竟高达叶片总蛋白的7%，比细胞核转化高出300倍。

这些实验充分说明，叶绿体表达载体的构建和转化，是实现外源基因高效表达的重要途径之一。

5 定位信号的应用上述几种载体优化策略主要目的是提高外源基因的转录和翻译效率，然而，高水平表达的外源蛋白能否在植物细胞内稳定存在以及积累量的多少是植物遗传转化中需要考虑的另一重要问题。

近几年的研究发现，如果某些外源基因连接上适当的定位信号序列，使外源蛋白产生后定向运输到细胞内的特定部位，例如：叶绿体、内质网、液泡等，则可明显提高外源蛋白的稳定性和累积量。

这是因为内质网等特定区域为某些外源蛋白提供了一个相对稳定的内环境，有效防止了外源蛋白的降解。

例如，Wong等将拟南芥rbcS亚基的转运肽序列连接于杀虫蛋白基因之前，发现杀虫蛋白能够特异性地积累在转基因烟草的叶绿体内，外源蛋白总的积累量比对照提高了10～20倍。

最近，叶梁、宋艳茹等也将rbcS亚基的转运肽序列连接于PHB 合成相关基因之前，试图使基因表达产物在转基因油菜种子的质体中积累，从而提高外源蛋白含量。

另外，Wandelt等和Schouten等将内质网定位序列（四肽KDEL的编码序列）与外源蛋白基因相连接，发现外源蛋白在转基因植物中的含量有了显著提高。

显然，定位信号对于促进蛋白质积累有积极作用，但同一种定位信号是否适用于所有的蛋白还有待于进一步确定。

6 内含子在增强基因表达方面的应用内含子增强基因表达的作用最初是由Callis等在转基因玉米中发现的，玉米乙醇脱氢酶基因（Adhl）的第一个内含子（intron 1）对外源基因表达有明显增强作用，该基因的其他内含子（例如intron8,intron9）也有一定的增强作用。