分离工程第二章,细胞分离与破碎

随着重组DNA技术和组织培养技术上的重大进展， 以前认为很难获得的蛋白质现在可以大规模生产。
2.2 细胞破碎
2、目标产物的定位
胞外
一些微生物在代谢过程中将产物分泌到细胞之 外的液相中（称胞外酶），这些产品主要为医药 和保健产品，如胰岛素、某些细胞因子和疫苗亚 单位成分等。
这些蛋白质在细胞培养时被宿主细胞分泌到 培养液中，提取过程只需直接采用过滤和离心进 行固－液分离，然后将获得的澄清滤液再进一步 纯化即可。其后续分离和纯化都相对简单。
超声波破碎的机理
• 一般认为在超声波作用下液体发生空化作用 （ cavitation),空穴的形成、增大和闭合产 生极大的冲击波和剪切力，使细胞破碎。超声 波的细胞破碎效率与细胞种类、浓度和超声波 的声频、声能有关。
超声波破碎的适用范围
• 超声波破碎是很强烈的破碎方法，适用于多数微 生物的破碎。
• 超声波破碎的有效能量利用率极低，操作过程产 生大量的热，因此操作需在冰水或外部冷却的容 器中进行。由于对冷却的要求相当苛刻，所以不 易放大，主要用于实验室规模的细胞破碎。
4.1.3 渗透压冲击法
• 渗透压冲击是较温和的一种破碎方法，将细胞 放在高渗透压的溶液中（如一定浓度的甘油或 蔗糖溶液），由于渗透压的作用，细胞内水分 便向外渗出，细胞发生收缩，当达到平衡后， 将介质快速稀释，或将细胞转入水或缓冲液中， 由于渗透压的突然变化，胞外的水迅速渗入胞 内，引起细胞快速膨胀而破裂。
• 大概不述同。
• 革兰氏阴性菌比阳性菌复杂，在电子显微镜超薄切 片观察，可见革兰氏阳性菌细胞壁较厚，具有20～ 80nm的肽聚糖层，约占细胞壁成分的40～90％，此 外细胞壁还含有大量磷壁酸(eichoic acid)。
• 而革兰氏阴性菌的肽聚糖层较薄，仅2～3nm，占细 胞壁成分的10％左右，由于肽聚糖之间仅由四肽侧 链直接连接，缺乏五肽桥，故层较疏松，而且肽聚 糖居于细胞壁最内层，紧贴在细胞膜上。
处理
溶胞 作用
珠磨法 压榨 高 压 匀 浆
超 酶溶法 声 破 碎
化学法 物理法
4.1 机械法
高压匀浆破碎法（homogenization） 高速搅拌珠研磨破碎法（fine grinding） 超声波破碎法（ultrasonication）
4.2 非机械法破碎方法
渗透压冲击破碎法（osmotic shock） 冻融破碎法（freezing and thawing） 酶溶破碎法（enzyme lysis） 化学破碎法（chemical treatment） 去垢剂破碎法（detergents）
浆器或多次循环通过等方式，也可连续操作。
为了控制温度的升高，可在进口处用干冰调节 温度，使出口温度调节在20℃左右。在工业规模的 细胞破碎中，对于酵母等难破碎的及浓度高或处于 生长静止期的细胞，常采用多次循环的操作方法。
标准阀
细胞破碎阀
锯齿阀
刀型阀
锥型阀 球型细胞破碎阀
高压匀浆器各种阀型设计
高压匀浆法适用的范围
动物细胞没有细胞壁，仅有细胞膜。通常细胞壁 较坚韧，细胞膜脆弱，易受渗透压冲击而破碎，因 此细胞破碎的阻力主要来自于细胞壁。
基于遗传和环境等因素，不同类生化物质其细胞 壁的结构和组成不完全相同，故细胞壁的机械强度 不同，细胞破碎的难易程度也就不同。此外，不同 的生化物质其稳定性有较大差别，在破碎过程中应 防止变性和被胞内的酶水解，因此，破碎方法的选 择和操作条件的优化是十分必要的。
生物分离工程
swflgc@
第二章 细胞分离与破碎 2.1 细胞分离（简介）
• 2.1.1 重力沉降： Stokes定律 ，式2.6 • 2.1.2 离心沉降： 和重力沉降的联系 • 差速离心分级（图2.1） • 区带离心：差速区带离心和平衡区带离心，
前者最大密度小于待分离的目标产物的密度 • 管式离心机 公式2.23和2.23（a）
与细菌细胞壁一样，破碎酵母细胞壁的阻力 主要决定于壁结构交联的紧密程度和它的厚度。
红面包霉菌(Neurospora crassa)的 细胞壁结构示意图
红面包霉菌细胞壁的结构示意图
• 主要存在三种聚合物，葡聚糖（主要以β1,3 糖 苷 键 连 接 ， 某 些 以 β-1,6 糖 苷 键 连
• 概接蛋述）白，。几最丁外质层（(a以)是微α纤-维和状β态-葡存聚在糖）的以混及糖合
举例：几种由大肠杆菌表达的胞内重组药物
药物名称 胰岛素Biblioteka 宿主 大肠杆菌用途 治疗糖尿病
人生长激素（HGH） 大肠杆菌
α-干扰素
大肠杆菌
治疗侏儒病
治疗毛状细胞 白血病和卡波 济肉瘤
3、细胞结构（微生物、生物化学；细菌、酵母、植物 细胞）
微生物细胞和植物细胞外层均为细胞壁，细胞壁 里面是细胞膜，细胞膜和它所包围的细胞浆合称原 生质体。
高压匀浆器的种类
高压匀浆器的种类较多 WAB公司的AVP Gaulin 31MR型
最大操作压力为24MPa 最大处理量为为100dm3/h
Bran and luebbe 公司SHL40型 最大操作压力为20-63MPa 最大处理量为为2.6-34 m3/h
细胞破碎分率关系式
破碎属于一级反应速度过程，被破碎的细胞分率 符合如下公式： ln[1/(1-R)]=KNPɑ
• 一般来说哪一种细菌容易破壁？
酵母细胞壁的结构示意图
破碎酵母细胞壁的阻力
酵母细胞壁的结构示意图如图15－2所示， 细胞壁的最里层是由葡聚糖的细纤维组成，它 构成了细胞壁的刚性骨架，使细胞具有一定的 形状，覆盖在细纤维上面的是一层糖蛋白，最 外层是甘露聚糖，由1,6一磷酸二酯键共价连 接，形成网状结构。在该层的内部，有甘露聚 糖-酶的复合物，它可以共价连接到网状结构 上，也可以不连接。
• 2.1.3过滤 • 恒压过滤 公式2.33 • 恒速过滤 公式2.36
2.2 细胞破碎
1. 概念
细胞破碎（cell rupture）：技术是指利用外力 破坏细胞膜和细胞壁，使细胞内容物包括目的产物成 分释放出来的技术。
细胞破碎技术是分离纯化细胞内合成的非分泌型生 化物质（产品）的基础。(图1.1）
• 超声波破碎法（Ultrasonication)利用超声波 振荡器发射的15-25kHz的超声波探头处理细胞 悬浮液。
• 超声波振荡器有不同的类型，常用的为电声型， 它是由发生器和换能器组成，发生器能产生高 频电流，换能器的作用是把电磁振荡转换成机 械振动。
• 超声波振荡器以可分为槽式和探头直接插入介 质两种型式，一般破碎效果后者比前者好。
Ｄyno珠磨机
德国Netzsch LM-20型珠磨机
LM-20型珠磨机
• 园盘以两种位置交错地安装在轴上，一种处于 径向，一种和轴倾斜，径向园盘使磨料沿径向 运动，倾斜园盘则产生轴向运动。
• 由于交错的运动，提高了破碎效率。除磨室有 冷却夹套外，搅拌轴和园盘也可以冷却。
4.1.2 超声波破碎
半乳糖醛酸聚糖 、 鼠李半乳糖醛酸聚糖
果胶物质 半乳聚糖和阿拉伯半乳聚糖
蛋白质 结构蛋白 各种酶类
凝集素
• 目前已发展了多种细胞破碎方法，以便适应不同 用途和不同类型的细胞壁破碎。
• 破碎方法可规纳为机械法和非机械法两大类。
4. 细胞破碎方法分类
破碎方式
机械法
非机械法
固体剪切 作用
液体剪切
干燥
作用
• 酶解是利用溶解细胞壁的酶处理菌体细胞，使细胞 壁受到部分或完全破坏后，再利用渗透压冲击等方 法破坏细胞膜，进一步增大胞内产物的通透性。
• 溶菌酶（lysozyme)适用于革兰氏阳性菌细胞的分 解，应用于革兰氏阴性菌时，需辅以EDTA使之更有 效地作用于细胞壁。
• 真核细胞的细胞壁不同于原核细胞，需采用不同的 酶。
Brokman等人已研究了能适应于高压操作的匀浆 阀，试验表明在约175 MPa的压力下，破碎率可达 100％，但是也有试验表明当压力超过一定的值后， 破碎率增长得很慢，在工业生产中，通常采用的压 力为55－70Mpa。
破碎作用方程
• 破碎作用是相对于时间的一级反应速度过程， 符合下列公式：
•
ln[1/(1-R)]=Kt
高压匀浆法适用的范围： 酵母和大多数细菌细胞的破碎。 料液细胞浓度可达到20%左右。 ☆团状和系状菌易造成高压匀浆器的堵塞，不宜
使用高压匀浆法。
高压匀浆法使用时注意事项
高压匀浆器的操作温度上升约２－３℃/10MPa 为了保护目标产物的生物活性，需要对料液作冷
却处理。
多组破碎操作中需要在级间设置冷却装置可有效 防止温度上升，保护产物活性。
4.1.1 高压匀浆器（High pressure homogenizer）
阀座
阀杆 撞击环 阀杆
压力控制手轮
APV Manton Gaulin 高压匀浆器针型阀结构简图
操作原理
细胞浆液通过止逆阀进入泵体内，在高压下迫 使其在排出阀的小孔中高速冲出，并射向撞击环上， 由于突然减压和高速冲击，使细胞受到高的液相剪 切力而破碎。在操作方式上，可以采用单次通过匀
酵母菌的细胞结构
5 细胞核 1 细胞壁 2 细胞膜 3 细胞质 4 液泡
细菌的细胞结构
真核细胞
细胞核 核仁
糙面内质网
光面内质网
线粒体
中心粒
溶酶体
线粒体
颗粒 嵴
核糖体
• 概述
细胞膜的结构
细胞壁的组成和结构（细菌肽聚糖结构示 意图）
几乎所有细菌的细胞壁都是由肽聚糖 （peptidoglycan）组成，它是难溶性的聚糖
式中 R — 破碎率，为N次循环后，蛋白质的 释放量Rn与最大释放量Rm之比； K － 与温度有关的速度常数； N － 悬浮液通过匀浆器的次数； P － 操作压力，MPa； ɑ－ 与微生物种类有关的常数。