大黄鱼肾脏组织细胞系(YCK)的建立

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大黄鱼鳍细胞系的建立与鉴定

大黄鱼鳍细胞系的建立与鉴定作者：林舒雅来源：《中国科技博览》2015年第07期[摘要]随着近年来的经济发展，城市空气质量不断下降，海洋环境污染日益严重。

造成了各种病毒性和细菌性疾病的大规模肆虐，以及鱼类的严重绝种，给鱼类养殖业带来了巨大的损失。

根据鱼类细胞系选择适合的生物检测进行对海洋中污染物的防治，建立有效快速的生物检测体系，是对当前环境污染以及对病毒的预防措施的重中之重。

利用鱼类细胞系进行关于鱼类免疫系统的研究，深入研究鱼类的病毒理学，对预防鱼类绝种以及鱼类疾病有着重要的意义。

[关键词]大黄鱼；细胞系；建立；研究中图分类号：S917.4 文献标识码：A 文章编号：1009-914X（2015）07-0324-02大黄鱼，又名为黄鱼，其肉嫩味鲜，营养丰富，是我国鱼类养殖业重点的捕捞对象。

目前是我国的重点培养对象，但是因为受环境污、病毒入侵等等人为灾害的影响，需要建立细胞系来预防病毒入侵。

同时还要开展环境检测，进行鱼类免疫系统的研究。

但是遗憾的是至今都没有太大的成效，对鱼组织细胞系的研究一直都处在深入探索之中。

一、鱼类细胞系的研究意义与价值连续性的细胞系指的是在体外可以存活的细胞系。

最初建立鱼类细胞系是为了鱼类病毒的研究，后来应用到了各个领域之中，比如鱼类免疫学、遗传学还有细胞毒理学等等各种科学研究领域。

细胞系是保留海洋动物资源的一个重要途径，建立完整的细胞系体系，对于我国海水动物建立完整的细胞库有着重要的意义，是保留海洋动物资源的重要的体系。

要对细胞系进行开发研究，对海水动物养殖中的一系列领域能够进行深入研究，比如疫苗基因、灾害防治、细胞育种、动物克隆等领域，而且对于海水养殖中动物的病毒灾害防治也有着重要的意义。

鱼类细胞系可以用于病毒分离、病毒的疫苗研制等等一系列灾害防治当中。

大大加快了我国海水养殖鱼类的病毒疫苗研究工作的进程，如果运用到医疗当中会带来巨大的经济效益，大力推动社会和经济的发展。

大黄鱼鳍细胞系的建立及久效磷对其毒性作用的研究

大黄鱼鳍细胞系的建立及久效磷对其毒性作用的研究樊廷俊;孙爱;杨秀霞;姜国建;徐晓辉;郭雪阳【期刊名称】《中国海洋大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2010(040)012【摘要】为了建市大黄鱼(Pseudosciaena crocea)鳍细胞系,为其细胞毒理学、病毒学与细胞工程等研究奠定基础,本文采用酶消化法使用含有20%胎牛血清(FBS)的DMEM/F12、Leibovitz L-15和DMEM培养液(pH7.2)在22～28℃分别启动了大黄鱼鳍组织的体外培养,通过添加促细胞贴壁和分裂的物质在最适堵养条件下对大黄鱼鳍细胞进行了原代培养和继代培养,并研究了久效磷对大黄鱼细胞系鳍细胞的毒性作用.体外培养结果显示,大黄鱼鳍细胞的最适培养液为20%FBS-DMEM/F12,最适培养温度为25℃,体外培养鳍细胞的形态主要为成纤维细胞样,22 d后便可形成汇合细胞单层,经过连续继代培养成功建立了大黄鱼的连续性鳍细胞系,目前已传至第112代;对第60代大黄鱼鳍细胞系细胞的鉴定结果显示,其群体倍增时间为50.96 h,分裂状态十分旺盛,虽然出现了染色体的非整倍性,但其特征性染色体数目仍为48条,并具有正常的6m+6sm+36t二倍体核型,证明所建立的细胞系确为大黄鱼鳍细胞系.不同浓度久效磷处理的检测结果显示,大黄鱼鳍细胞对久效磷敏感,20～160 μg/mL久效磷可引起鳍细胞乙酰胆碱酯酶活性的持续性显著降低,引起超氧化物歧化酶和谷胱甘肽-S-转移酶活性的显著升高并随着浓度的升高而逐渐降低,久效磷对该细胞系细胞的48 h半抑制浓度(IC50)为43.05 μg/mL,,证实久效磷对大黄鱼鳍细胞具有显著的毒性作用.【总页数】7页(P64-70)【作者】樊廷俊;孙爱;杨秀霞;姜国建;徐晓辉;郭雪阳【作者单位】中国海洋大学海洋生命学院海洋生物系,山东,青岛,266003;中国海洋大学海洋生命学院海洋生物系,山东,青岛,266003;中国海洋大学海洋生命学院海洋生物系,山东,青岛,266003;中国海洋大学海洋生命学院海洋生物系,山东,青岛,266003;中国海洋大学海洋生命学院海洋生物系,山东,青岛,266003;中国海洋大学海洋生命学院海洋生物系,山东,青岛,266003【正文语种】中文【中图分类】Q813.1+1【相关文献】1.石鲽鳍细胞系的建立及三丁基锡对其毒性作用的研究 [J], 魏云波;刘书花;王兴民;周延生;孙爱2.大黄中游离蒽醌对HK-2细胞系的毒性作用研究 [J], 王青秀;吴纯启;杨红莲;荆淑芳;金城;肖小河;廖明阳3.多西紫杉醇对宫颈癌细胞系Hela细胞毒性和放射增敏作用的研究 [J], 唐丽萍;徐向英;马荣;韩毅敏;于丽波4.卡培他滨对食管癌细胞系EC9706细胞毒性和放射增敏作用的研究 [J], 曲智锋;高社干;张洛;韩晶;单探幽;冯笑山5.唑来膦酸负荷骨水泥对骨巨细胞瘤、多发性骨髓瘤及肾细胞癌细胞系的毒性作用研究 [J], Zwolak P;Manivel JC;Jasinski P;杨涛因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

孵化至12月龄大黄鱼免疫器官的发育变化

孵化至12月龄大黄鱼免疫器官的发育变化徐晓津;谢仰杰;王军;苏永全【摘要】The growth of the lymphoid organs, such as head kidney, spleen and thymus was stueied in Larimichthys crocea, from hatching to 12 months of age. A histological and ultrastructural study was performed on the development of the head kidney, thymus and spleen aging from just hatching to the 12 months. Head kidney was first present on the 3rd day after hatching(DAH). Primordial haemopoietic stem cells were first observed in the head kidney and rapidly differentiated into different cellular types. Progenitor spleen was present on the 4th DAH, located close to the gut, soon becoming rich in blood capillaries, red blood cells and thrombocytes. The thymus occurred obviously on the 4th DAH, located on either side of the upper corner of the opercular cavity, closely under the membrance of the opercuhr cavity. The thymus was the last lymphoid organ appearing but showed quick development. The thymus consisted of outer thymocytic and inner epithelioid zones. There was no obvious demarcation between them, but both zones were visible.Head kidney, spleen and thymus grew as the fish grew. The spleen weight showed a closer correlation to body weight than they did to age. But head kidney and thymus weight showed a closer correlation to age.The total number of leucocytes in the lymphoid organs increased with age. But the number per milligram of lymphoid organ didn' t show a closer correlation to age. The head kidney was more lymphoid than the spleen. The blood componentshad no obvious ralationship with age or season during the period studied.%研究孵化至12月龄大黄鱼的淋巴器官如头肾、胸腺、脾的生长发育和免疫细胞数量的变化,首先应用显微与超微技术研究大黄鱼初孵仔鱼至12月龄免疫器官--头肾、胸腺与脾脏的发育.3日龄仔鱼出现头肾原基,原始造血干细胞最早被发现于头肾,很快分化成不同类型的细胞.4日龄仔鱼出现脾脏原基和胸腺原基.脾脏靠近内脏,含大量窦状隙,有丰富的毛细血管、血细胞与血小板.胸腺是最迟出现的淋巴器官,但发育较快.胸腺位于鳃腔背上角,主要由胸腺细胞(淋巴细胞)和上皮细胞组成,分为外区和内区,二者虽没有明显界限,但容易区分.研究结果还表明,随着年龄和鱼体重量的增长,胸腺、头肾和脾脏的重量均有增长的趋势,脾脏重量与体重的关系要比与年龄的关系更为密切,头肾、胸腺重量与年龄的关系要比与体重的关系更为密切.胸腺、头肾和脾脏的白细胞总数随着年龄的增长不断增加.但每毫克胸腺、头肾和脾脏内白细胞数量与年龄间线性关系不明显.头肾比脾脏淋巴化程度高.在研究中发现,血液内各细胞组成与大黄鱼月龄及季节的变化没有明显的改变.【期刊名称】《水产学报》【年(卷),期】2011(035)004【总页数】10页(P604-613)【关键词】大黄鱼;免疫器官;发育【作者】徐晓津;谢仰杰;王军;苏永全【作者单位】集美大学水产学院,福建省高校水产科学技术与食品安全重点实验室,福建厦门361021;厦门大学海洋学系,厦门大学亚热带海洋研究所,福建厦门361005;集美大学水产学院,福建省高校水产科学技术与食品安全重点实验室,福建厦门361021;厦门大学海洋学系,厦门大学亚热带海洋研究所,福建厦门361005;厦门大学海洋学系,厦门大学亚热带海洋研究所,福建厦门361005;厦门大学海洋学系,厦门大学亚热带海洋研究所,福建厦门361005【正文语种】中文【中图分类】Q175;S917硬骨鱼类的淋巴器官包括胸腺、头肾和脾脏等。

大黄鱼细胞适用四环素调控系统的构建与验证

大黄鱼细胞适用四环素调控系统的构建与验证葛金鑫;颜廷鼎;王克智;刘也;何志巧;申望【期刊名称】《浙江农业科学》【年(卷),期】2024(65)6【摘要】构建大黄鱼(Larimichthys crocea)细胞适用的四环素调控系统,为大黄鱼蛋白质功能研究提供可靠工具。

以pEGFP-N1质粒的CMV增强子/启动子替换四环素调控载体pTRE3G-MCS-EGFP-3×FLAG-Tetone-Puro(简称pTRE3G)转录激活子(rtTA)的EF-1α启动子及其下游5′-长末端重复序列(5′-LTR),构建重组载体pTRE3G-CMV;转染大黄鱼头肾细胞系YCK-hk细胞,Dox诱导EGFP表达,验证pTRE3G-CMV在大黄鱼细胞中驱动外源基因表达的可靠性。

成功构建四环素调控载体pTRE3G-CMV;pTRE3G-CMV质粒转染的大黄鱼YCK-hk细胞经Dox诱导表达EGFP,表明CMV增强子/启动子在YCK-hk细胞中正常驱动rtTA表达;pTRE3G-CMV质粒转染YCK-hk细胞效率低(<1%),经嘌呤霉素筛选后EGFP 表达阳性细胞率上升至约30%,表明嘌呤霉素能有效筛选转染成功细胞,提示可结合单克隆筛选建立稳转细胞系。

研究构建的四环素调控载体pTRE3G-CMV在大黄鱼细胞中正常表达外源基因,可用于大黄鱼蛋白质功能研究。

【总页数】6页(P1285-1290)【作者】葛金鑫;颜廷鼎;王克智;刘也;何志巧;申望【作者单位】浙江海洋大学海洋科学与技术学院【正文语种】中文【中图分类】S917.4;Q952.6【相关文献】1.四环素基因表达调控系统调控HSV-tk基因表达的单载体构建2.四环素基因表达调控系统调控β-半乳糖苷酶基因在肝癌细胞中的表达3.基于四环素调控系统构建白蛋白启动子调控大鼠uPA转基因表达的慢病毒载体4.hVEGF_(165)四环素调控腺病毒载体的构建及其在大鼠成肌细胞表达5.乙型肝炎病毒S基因四环素调控体系的构建及其在真核细胞中的表达因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

三七总皂甙对大黄鱼肾细胞生长及部分免疫相关基因表达的影响

三七总皂甙对大黄鱼肾细胞生长及部分免疫相关基因表达的影响陈秀霞;郑在予;黄河;池洪树;龚晖【摘要】本试验将三七总皂甙(PNS)体外作用于大黄鱼肾细胞,通过活细胞计数和荧光定量PCR检测,初步了解PNS对大黄鱼肾细胞生长及部分免疫相关因子表达的影响.结果显示,40~200μg/mL浓度的PNS对大黄鱼肾细胞生长无明显影响,但浓度达到1 mg/mL以上时,对细胞生长有负面影响;10~1000μg/mL浓度的PNS 对大黄鱼肾细胞Toll样受体5 mRNA的表达有一定的上调作用,但对Toll样受体3的表达有一定的下调作用;PNS浓度为10~100μg/mL时对大黄鱼肾细胞碱性磷酸酶的表达无明显影响,但浓度达到1000μg/mL时对该因子的表达有下调作用;PNS浓度为10μg/mL时对大黄鱼肾细胞溶菌酶的表达无明显影响,但浓度达到100μg/mL以上时对该因子的表达具有一定的下调作用.【期刊名称】《福建畜牧兽医》【年(卷),期】2017(039)006【总页数】4页(P7-9,12)【关键词】三七总皂甙;大黄鱼;肾细胞;Toll样受体;碱性磷酸酶;溶菌酶【作者】陈秀霞;郑在予;黄河;池洪树;龚晖【作者单位】福建省农业科学院生物技术研究所福州 350003;福建省农业科学院生物技术研究所福州 350003;福建省农业科学院生物技术研究所福州 350003;福建省农业科学院生物技术研究所福州 350003;福建省农业科学院生物技术研究所福州 350003【正文语种】中文三七总皂甙（Panax notoginseng saponins，PNS）为植物三七提取的有效活性成分，其主要成分为人参皂甙R b1、人参皂甙R g1、三七皂甙R1等，具有广泛的药理作用，其中包括免疫调节作用[1-2]。

目前研究较多的是PNS对哺乳动物的免疫调节作用，有关PNS对鱼类免疫调节作用的研究报道较少，尚未见PNS对鱼类体外细胞免疫相关因子表达影响的相关研究报道。

我国科学家发布大黄鱼全基因组测序

我国科学家发布大黄鱼全基因组测序
佚名
【期刊名称】《水产科技情报》
【年(卷),期】2015(42)1
【摘要】由浙江海洋学院院长吴常文领衔，上海交通大学、复旦大学等机构科学
家参加的研究团队最近联合破译了大黄鱼全基因组测序，构建了大黄鱼基因组图谱，并成功解析其先天免疫系统基因组特征。

日前，该研究成果发表在《自然》杂志上。

这是继半滑舌鳎之后，我国公布的第二个海水鱼类的基因组图谱，也是世界上第一个石首科鱼类基因组图谱，揭开丫我国大黄鱼基因组学研究的序幕，有望解决养殖过程中大黄鱼病害频发的问题。

【总页数】1页(P50-50)
【关键词】全基因组测序;大黄鱼;科学家;基因组图谱;浙江海洋学院;上海交通大学;《自然》杂志;海水鱼类
【正文语种】中文
【中图分类】S511
【相关文献】
1.我国下一代广播电视网获技术突破/中国科学家完成柞蚕全基因组测序/我国科学家研发土壤修复技术拯救农田 [J],
2.我国科学家发布大黄鱼全基因组图谱 [J], 史娜;
3.我国科学家完成大黄鱼全基因组序列图谱绘制 [J],
4.我国科学家完成大黄鱼全基因组测序 [J],
5.中国科学家完成大黄鱼全基因组测序 [J],
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一种大黄鱼头肾细胞系及其构建方法[发明专利]

专利名称：一种大黄鱼头肾细胞系及其构建方法专利类型：发明专利
发明人：陈新华,敖敬群,王贤慧,王琨茹
申请号：CN201310474258.0
申请日：20131012
公开号：CN103484425A
公开日：
20140101
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：一种大黄鱼头肾细胞系及其构建方法，涉及细胞系。

所述大黄鱼头肾细胞系为大黄鱼头肾细胞系LYCK，保藏编号为CCTCC NO：C2013113。

所述大黄鱼头肾细胞系的构建方法，包括以下步骤：1）配制细胞培养基；2）原代培养的建立；3）传代培养。

建立的大黄鱼头肾细胞系形态为纤维状，该细胞系可以连续传代，大黄鱼头肾细胞系已传70代以上；能大量提供大黄鱼的头肾细胞系；该细胞系可以直接应用于各种大黄鱼免疫相关功能基因研究。

该细胞系可应用于细胞生物学、分子生物学、病毒学、毒理学、肿瘤学、遗传学和免疫学等重要研究。

申请人：国家海洋局第三海洋研究所
地址：361005 福建省厦门市思明区大学路178号
国籍：CN
代理机构：厦门南强之路专利事务所(普通合伙)
代理人：马应森
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大黄鱼早期发育过程中免疫器官的发生

基金项目：国家８６３计划（２００２ＡＡ６０３０２１，２００４ＡＡ００１１８０，２００４ＡＡ６２３０１Ｏ）资助项目作者简介：徐晓津（１９６９一），女，福建省三明市人，博上研究生，从事海洋生物学研究＊通信作者，ｙｑｓｕ＠］ｉｎｇｘｉａｎ．ｘｒｉｌｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
间水温２５．６～２９．４℃ ，盐度３１．７～３２．３．
２．２方法
等．近３０ａ来，随着鱼类免疫学的迅速发展，国内外
许多学者在鱼类免疫相关组织和器官的结构、功能及免疫机理方面作了不少研究，在鱼类免疫相关器
中图分类号：Ｑ９５９．４８３文献标识码：Ａ文童编号：Ｏ２５３４１９３（２００７）０３ — ０１０５ — ０９
１引言
免疫器官（组织）和细胞是鱼类防御系统的基础，是鱼类防止病原侵入的最初防线．参与鱼类免疫
埋．通过ＩｅｉｃａＲＭ２１２８型切片机横、纵向连续切片
了大黄鱼初孵仔鱼至 Байду номын сангаас ０日龄幼鱼免疫器官的发育，研究结果将为大黄鱼养殖病害的免疫防治研究提供
（厚３～５ｍ），于ＬｅｉｃａＡＵＴ０ＳＴＡＩＮＥＲＸＩ染色机中进行Ｈ・Ｅ染色，中性树胶封片．ＩｅｉｃａＤＭ

大黄鱼(Larimichthys crocea)fAFLP方法的建立

ＥａｓｔＣｈｉｎａＳｅａ，ＭｉｎｉｓｔｙｒｏｆＡｃｕｌｔｕｒｅ（ＪｉｍｅｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ），Ｘｉａｍｅｎ３６１０２１，Ｃｈｉｎａ；３．ＦａｃｕｌｔｙｏｆＡｎｉｍａｌＳｃｉｅｎｃｅａｎｄ
ｍｉｚｅｄｆｏｒｌａｒｇｅｙｅｌｌｏｗｃｒｏａｋｅｒＬａｒｉｍｉｃｈｔｈｙｓｃｒｏｃｅａｉｎｔｈｅｐｒｅｓｅｎｔｓｔｕｄｙ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＹｔｍｎａｎＡｃｕｌｔｕｒｌａＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｋｕｎｍｉｎｇ６５０２０１，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＴｈｅｍａｊｏｒｉｎｌｆｕｅｎｃｅｆａｃｔｏｒｓｏｎｌｌｅｄＡＦＬＰ（ｆＡＦＬＰ）ｗｅｒｅｅｘｐｌｏｒｅｄａｎｄｏｐｔｉ－
（１．集美大学水产学院，福建厦门３６１０２１；２．农业部东海海水健康养殖重点实验室，
福建厦门３６１０２１；３．云南农业大学动物科学技术学院，云南昆明６５０２０１）
［摘要］以大黄鱼为材料，探索及优化了影响荧光标记ＡＦＬＰ（ｆＡＦＬＰ）分析体系的主要因素．结果表明：内切酶ＥｃｏＲＩ与ＭｓｅＩ各０．３５Ｕ，双酶切３５０ｎｇ大黄鱼基因组ＤＮＡ，依次反应４ｈ可得最佳效果；Ｔ４ＤＮＡ连接酶２．５ｕ，１６℃过夜连接３酶切产物与接头时效果最佳；以１连接产物作底物，ＥｃｏＲＩ与ＭｓｅＩ预扩引物分别为０．３Ｉｘｍｏｌ／Ｌ与１．５ｔ￣ｍｏｌ／Ｌ时预扩效果最佳；预扩产物稀释超过１００倍作为选择性扩

大黄鱼性腺原代细胞培养技术的建立

㊀第２５卷㊀第５期集美大学学报（自然科学版）Ｖｏｌ．２５㊀Ｎｏ．５㊀㊀２０２０年９月ＪｏｕｒｎａｌｏｆＪｉｍｅｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（ＮａｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅ）Ｓｅｐ．２０２０㊀㊀［收稿日期］２０１９－１１－２７［基金项目］海水鱼产业技术体系项目（ＣＡＲＳ－４７－Ｇ０４）［作者简介］郭一兰（１９９５），女，硕士生，从事水产动物遗传与育种研究㊂通信作者：王志勇（１９６３），男，教授，博导㊂从事水产动物遗传与育种研究㊂Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｚｙｗａｎ＠ｊｍｕ．ｅｄｕ．ｃｎ［文章编号］１００７－７４０５（２０２０）０５－０３２１－０７ＤＯＩ：１０．１９７１５／ｊ．ｊｍｕｚｒ．２０２０．０５．０１大黄鱼性腺原代细胞培养技术的建立郭一兰１，２，王志勇１，２（１．集美大学水产学院，福建厦门３６１０２１；２．农业农村部东海海水健康养殖重点实验室，福建厦门３６１０２１）［摘要］为建立大黄鱼精巢和卵巢组织的原代细胞培养技术，获得单层的性腺原代细胞，采用组织块贴壁法，对来源于大黄鱼的卵巢和精巢组织的细胞进行原代培养，并使用０２５％胰酶消化法尝试传代培养㊂在２６ħ条件下，添加２０％胎牛血清，在１００ＩＵ／ｍＬ青霉素（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）和１００μｇ／ｍＬ硫酸链霉素（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙ⁃ｃｉｎ）的ＤＭＥＭ／Ｆ－１２（ＨＡＭ）１ʒ１培养基中培养大黄鱼卵巢和精巢组织的细胞㊂结果显示：１）大黄鱼卵巢组织在贴壁后第４天成纤维细胞开始迁出，呈辐射状生长；贴壁后第６天迁移出上皮样细胞，呈铺石路状生长；贴壁后第１７天左右出现不同程度贴壁抑制㊂２）大黄鱼精巢组织在贴壁后第５天迁出成纤维细胞；第９１７天，部分成纤维细胞呈长梭形涡旋状生长，部分呈三角形均匀分布增殖；贴壁后第１８天左右部分细胞空泡化严重㊂３）在培养后第８天对卵巢和精巢组织原代细胞进行胰酶消化传代培养，传代培养第２天部分细胞贴壁分裂增殖，传代培养３ｄ后可进行第二次传代，第二次传代后细胞长势变缓，细胞空泡化加快㊂［关键词］大黄鱼；精巢；卵巢；原代细胞培养［中图分类号］Ｑ８１３１ＥｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔｏｆＰｒｉｍａｒｙＣｅｌｌＣｕｌｔｕｒｅＴｅｃｈｎｉｑｕｅｆｏｒＧｏｎａｄａｌＴｉｓｓｕｅｏｆＬａｒｇｅＹｅｌｌｏｗＣｒｏａｋｅｒＧＵＯＹｉｌａｎ１２ＷＡＮＧＺｈｉｙｏｎｇ１２１．ＦｉｓｈｅｒｉｅｓＣｏｌｌｅｇｅＪｉｍｅｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＸｉａｍｅｎ３６１０２１Ｃｈｉｎａ２．ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＨｅａｌｔｈｙＭａｒｉｃａｌｔｕｒｅｆｏｒｔｈｅＥａｓｔＣｈｉｎａＳｅａｏｆＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅＪｉｍｅｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＸｉａｍｅｎ３６１０２１ＣｈｉｎａＡｂｓｔｒａｃｔＩｎｏｒｄｅｒｔｏｅｓｔａｂｌｉｓｈｔｈｅｐｒｉｍａｒｙｃｅｌｌｃｕｌｔｕｒｅｔｅｃｈｎｉｑｕｅｏｆｔｈｅｔｅｓｔｉｓａｎｄｏｖａｒｙｔｉｓｓｕｅｏｆｌａｒｇｅｙｅｌｌｏｗｃｒｏａｋｅｒＬａｒｉｍｉｃｈｔｈｙｓｃｒｏｃｅａａｎｄｏｂｔａｉｎｍｏｎｏｌａｙｅｒｇｏｎａｄａｌｐｒｉｍａｒｙｃｅｌｌｓｔｈｅｐｒｉｍａｒｙｃｅｌｌｓｆｒｏｍｏｖａｒｙａｎｄｔｅｓｔｉｓｏｆｌａｒｇｅｙｅｌｌｏｗｃｒｏａｋｅｒｗｅｒｅｃｕｌｔｕｒｅｄｂｙｄｉｒｅｃｔａｄｈｅｒｅｎｔｍｅｔｈｏｄａｎｄｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅｄｂｙ０２５％ｔｒｙｐｓｉｎｄｉｇｅｓｔｉｏｎ．ＣｅｌｌｓｗｅｒｅｃｕｌｔｕｒｅｄｉｎＤＭＥＭ／Ｆ⁃１２ＨＡＭ１ʒ１ｗｉｔｈ２０％ＦＢＳ１００ＩＵ／ｍＬＰｅｎｉｃｉｌｌｉｎａｎｄ１００μｇ／ｍＬＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎａｔ２６ħ．Ｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓｂｅｇａｎｔｏｍｉｇｒａｔｅｆｏｒｍｔｈｅｏｖａｒｙｔｉｓｓｕｅｏｆｌａｒｇｅｙｅｌｌｏｗｃｒｏａｋｅｒｏｎｔｈｅ４ｔｈｄａｙａｆｔｅｒａｄｈｅｒｅｎｔ．Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓｍｉｇｒａｔｅｄｏｕｔａｎｄｇｒｅｗｓｔｏｎｅ⁃ｌｉｋｅｏｎｔｈｅ６ｔｈｄａｙａｆｔｅｒａｄｈｅｒｅｎｔ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｄｅｇｒｅｅｓｏｆａｄｈｅｒｅｎｔｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｗｅｒｅｏｂｓｅｒｖｅｄａｒｏｕｎｄｔｈｅ１７ｔｈｄａｙａｆｔｅｒａｄｈｅｒ⁃ｅｎｔ．Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓｂｅｇａｎｔｏｍｉｇｒａｔｅｆｏｒｍｔｈｅｔｅｓｔｉｓｔｉｓｓｕｅｏｆｌａｒｇｅｙｅｌｌｏｗｃｒｏａｋｅｒａｎｄｏｎｔｈｅ５ｔｈｄａｙａｆｔｅｒａｄｈｅｒ⁃ｅｎｔ．Ｄｕｒｉｎｇｔｈｅ９ｔｈｄａｙｔｏｔｈｅ１７ｔｈｄａｙａｆｔｅｒａｄｈｅｒｅｎｔｓｏｍｅｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓｇｒｅｗｌｉｋｅｖｏｒｔｅｘｗｉｔｈｌｏｎｇｓｐｉｎｄｌｅｓｈａｐｅａｎｄｓｏｍｅｗｅｒｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄｅｖｅｎｌｙｉｎｔｒｉａｎｇｕｌａｒｓｈａｐｅ．Ｓｏｍｅｃｅｌｌｓｃａｖｉｔａｔｅｄｓｅｒｉｏｕｓｌｙａｆｔｅｒｃｕｌｔｕｒｅｔｏａｂｏｕｔｔｈｅ１８ｔｈｄａｙａｆｔｅｒａｄｈｅｒｅｎｔ．Ｔｈｅｐｒｉｍａｒｙｃｅｌｌｓｏｆｏｖａｒｙａｎｄｔｅｓｔｉｓｔｉｓｓｕｅｗｅｒｅｄｉｇｅｓｔｅｄａｎｄｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅｄｂｙｔｒｙｐｓｉｎｏｎｔｈｅ８ｔｈｄａｙａｆｔｅｒａｄｈｅｒｅｎｔ．Ｏｎｔｈｅｓｅｃｏｎｄｄａｙａｆｔｅｒｄｉｇｅｓｔｉｏｎｓｏｍｅｃｅｌｌｓａｔｔａｃｈｅｄｔｏｔｈｅｗａｌｌｄｉｖｉｄｅｄａｎｄ㊃２２３㊃集美大学学报（自然科学版）第２５卷ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｅｄ．Ｔｈｅｓｅｃｏｎｄｐａｓｓａｇｅｃｏｕｌｄｂｅｃａｒｒｉｅｄｏｕｔｏｎｔｈｅ３ｔｈｄａｙａｆｔｅｒｄｉｇｅｓｔｉｏｎ．Ａｆｔｅｒｔｈｅｓｅｃｏｎｄｐａｓｓａｇｅｔｈｅｇｒｏｗｔｈｏｆｃｅｌｌｓｓｌｏｗｅｄｄｏｗｎａｎｄｔｈｅｖａｃｕｏｌｉｚａｔｉｏｎｏｆｃｅｌｌｓａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ．ＫｅｙｗｏｒｄｓｌａｒｇｅｙｅｌｌｏｗｃｒｏａｋｅｒＬａｒｉｍｉｃｈｔｈｙｓｃｒｏｃｅａｔｅｓｔｉｓｏｖａｒｙｐｒｉｍａｒｙｃｅｌｌｃｕｌｔｕｒｅ０㊀引言大黄鱼（Ｌａｒｉｍｉｃｈｔｈｙｓｃｒｏｃｅａ）属鲈形目（Ｐｅｒｃｉｆｏｒｍｅｓ），石首鱼科（Ｓｃｉａｅｎｉｄａｅ）黄鱼属（Ｌａｒｉｍｉｃｈｔｈｙｓ），是我国传统四大海产之一［１］㊂大黄鱼肉质鲜嫩，经济价值较高，市场需求量较大，为当前养殖量最大的经济海水鱼类，具有较高的研究意义㊂随着社会需求的增长，大黄鱼亲鱼资源枯竭，种质退化严重，人工养殖的大黄鱼出现了生长速度慢㊁肉质下降㊁抗病力弱等现象［２］㊂这些严重影响了大黄鱼养殖产业的健康发展，因此对大黄鱼病害防治㊁良种选育㊁遗传背景的研究极为迫切㊂大黄鱼为海水鱼类，对养殖条件要求较高；大黄鱼１２年才性成熟，活体试验周期较长；采用大黄鱼活体进行试验对设备㊁人力需求量大；大黄鱼应激性强，试验或运输过程中活体极易死亡㊂因而，转基因㊁ＲＮＡ干扰㊁基因编辑等新型技术较难在大黄鱼活体中开展㊂而使用鱼类细胞进行病毒学［３－４］㊁免疫学㊁生理生化研究㊁遗传学和药理学等领域［５－６］研究，具有试验周期短，试验数据获取较快，设施耗材较简单，人力物力需求量不大，实验稳定性㊁重复性较好，能有效避免个体间差异等活体鱼实验无法比拟的优点［７］㊂因此，进行鱼类原代细胞培养技术的探索及鱼类细胞素建立的深入研究非常重要，不仅能丰富鱼类细胞学知识，提供理论基础，也能为鱼类生理生化研究㊁病毒学㊁病理学㊁遗传学等研究提供合适的实验材料，具有实际应用的重要价值㊂目前，大黄鱼心㊁脑㊁肾脏㊁肝脏㊁肌肉㊁鳍㊁吻端以及脾脏等８种细胞的培养技术已有研究介绍［３，８－１０］，但关于大黄鱼性腺组织原代细胞的培养研究鲜见报道㊂而大黄鱼部分性别相关基因的表达具有组织特异性，在性腺中特异表达，当进行性别相关研究时若使用非性腺组织细胞作为实验材料，很难得到真实且准确的实验结果㊂本文拟建立大黄鱼性腺组织（卵巢和精巢）的原代细胞培养方法，旨在为今后大黄鱼性腺细胞系的建立奠定基础，为后续科研探索提供一个合适的实验材料㊂１㊀材料与方法１１㊀实验材料１１１㊀实验鱼实验用４００ｇ左右性成熟的活体大黄鱼５尾，采自福建省宁德市蕉城区金铃水产科技有限公司，在实验室暂养至解剖取性腺组织㊂１１２㊀实验试剂Ｈａｎｋｓ平衡盐溶液无酚红（ＨＢＳＳｂａｓｉｃ）（１Ｘ）㊁胎牛血清（ＦＢＳ）均为Ｇｉｂｃｏ公司产品，ＰＢＳ（ｐＨ＝７４）缓冲液㊁ＤＭＥＭ／Ｆ－１２（ＨＡＭ）１ʒ１培养基㊁胰蛋白酶消化液ＴｒｙｐｓｉｎＥＤＴＡＳｏｌｕｔｉｏｎＡ（０２５％胰酶和００２％ＥＤＴＡ）均为ＢＩ公司产品，双抗（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ１００００ＩＵ／ｍＬ－Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ１０ｍｇ／ｍＬ）为ＭＰ公司产品㊂完全培养基配方为：在基础培养基ＤＭＥＭ／Ｆ－１２中添加２０％（体积分数）ＦＢＳ㊁１％（体积分数）的双抗㊂１２㊀实验方法１２１㊀性腺组织处理方法取实验室暂养的活体大黄鱼于干净的解剖盘中，先用７５％（体积分数）酒精喷洒消毒鱼体表面，防止细菌污染影响后期组织细胞培养，再用高温灭菌过的解剖工具快速解剖鱼体并取出性腺组织㊃３２３㊃㊀第５期郭一兰，等：大黄鱼性腺原代细胞培养技术的建立（卵巢和精巢），将性腺组织放入含１％（体积分数）双抗的预冷ＰＢＳ溶液中㊂接着，移入提前灭菌处理的超净工作台上，用镊子和手术刀剥离去除卵巢或精巢组织中的生殖细胞后，将组织置于含１％双抗的ＰＢＳ溶液中，以６００ｇ低速离心收集组织，除去液体，用ＰＢＳ溶液重悬后重复离心洗涤至少３次㊂１２２㊀原代细胞培养方法将洗涤后的组织取出放置在干净的培养皿中，加入少许含１％双抗的ＨＢＳＳ并保持组织湿润㊂先用手术刀去除血液等杂物，再用两把手术刀交叉切割将组织切成１ｍｍˑ１ｍｍˑ１ｍｍ的小块㊂随后用ＨＢＳＳ低速离心洗涤２次，取出一些小块组织放入２５ｃｍ２细胞培养瓶中，使其均匀铺满瓶底，待组织附壁后，轻轻将培养瓶翻转过来，将适量培养液加到非细胞生长面上，注意翻瓶时勿令组织小块流动，然后将细胞瓶倒置放在２７ħ培养箱中密闭培养１８２４ｈ㊂从培养箱中取出细胞培养瓶，４６ʎ斜持培养瓶，向瓶内轻轻注入５ｍＬ完全培养液，然后缓缓把培养瓶翻转过来，让培养液慢慢覆盖附于瓶底的组织小块，置温箱中静止培养㊂此后每２３ｄ更换８０％培养液，继续培养㊂从加入培养基开始每天于倒置显微镜下观察和记录细胞的迁出和生长状况㊂１２３㊀传代细胞培养方法弃旧培养基，用１ｍＬＰＢＳ缓冲液洗涤细胞后弃掉ＰＢＳ，加入１ｍＬ０２５％（体积分数）的胰蛋白酶消化液，消化大约５ｍｉｎ至细胞开始脱落，弃掉胰蛋白酶后立即加入３ｍＬ完全培养基终止消化㊂用移液管吹打１０次左右，平均接种到３个新的细胞培养瓶中，补充完全培养基至５ｍＬ，放入２７ħ培养箱中继续培养㊂２㊀结果２１㊀大黄鱼卵巢组织原代细胞培养结果大黄鱼卵巢组织从贴壁后第４天开始迁移出的成纤维细胞，呈多突的纺锤形或三角形细胞；贴壁后第６天上皮细胞开始迁出，呈多边形，与成纤维细胞相比生长速度较缓慢；贴壁后第８１４天成纤维细胞和上皮细胞繁殖旺盛，成纤维细胞呈辐射状成簇生长且生长速度快，上皮细胞呈铺路石状均匀贴壁生长；贴壁后第１２天前期迁出的成纤维细胞出现空泡化；贴壁后第１４１６天空泡化的成纤维细胞脱落，上皮细胞生长状态良好；贴壁后第１７１９天成纤维细胞和上皮细胞出现贴壁抑制现象，生长变缓慢（见图１）㊂２２㊀大黄鱼精巢组织原代细胞培养结果大黄鱼精巢组织从贴壁后第５天开始迁出的成纤维细胞，呈长梭形㊁多角纺锤形，细胞较大，缓慢增殖；贴壁后第７天迁出的成纤维细胞开始成簇生长，细胞紧密呈长梭形；贴壁后第１２天成纤维细胞生长较快，少部分成纤维细胞开始出现空泡化，接下来一两天空泡化细胞会逐渐死亡㊁脱落；贴壁后第９１７天成纤维细胞繁殖旺盛，排列紧凑，大部分呈长梭形，涡旋状生长繁殖（细胞较小），少部分细胞呈三角形且均匀分布繁殖，期间两种形态细胞均有小部分细胞死亡脱落；贴壁后第１８１９天细胞紧凑，繁殖速度逐渐变缓，部分细胞出现严重空泡化，细胞变肥大，边界模糊，逐渐死亡（见图２）㊂２３㊀传代培养结果大黄鱼性腺（卵巢和精巢）组织在原代细胞培养第８天时细胞生长旺盛，因此使用胰酶消化法进行传代培养㊂室温状态下胰酶消化５ｍｉｎ左右后细胞形态变圆，缓慢脱落㊂收集脱落的细胞转至新的培养瓶继续培养㊂传代培养的第２天有部分细胞贴壁，贴壁的细胞开始分裂增殖㊂传代培养的第３天细胞出现空泡化，部分细胞变圆脱落，进行第二次传代㊂传代后细胞较少数贴壁，细胞增殖变缓，形态变化，生长状态不佳，之后渐渐死亡㊂㊃４２３㊃集美大学学报（自然科学版）第２５卷A—贴壁后第5天多突纺锤形的成纤维细胞迁出，生长缓慢；B—贴壁后第10天多边方形的上皮细胞生长迅速；C—贴壁后第11天成纤维细胞和上皮细胞同时存在，分别为黑框和紫框所示；D—贴壁后第15天部分成纤维细胞出现箭头所示空泡化，上皮细胞生长良好如框内所示；E—贴壁后第17天空泡化的成纤维细胞脱落，上皮细胞出现贴壁抑制现象，部分上皮细胞脱落如框内所示；F—贴壁后第19天部分上皮细胞空泡化严重，边界模糊。

大黄鱼鳍细胞系的建立与鉴定

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表２不同温度下大黄鱼鳍组织迁出细胞的数目
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有细胞毒理学等等各种科学研究领域。细胞系是保留海洋动物资源的一个重要途径，建立完整的细胞系体系，对于我国海水动物建立完整的细胞库有着重要的意义，是保留海洋动物资源的重要的体系。要对细胞系进行开发研究，对海水动物养殖中的一系列领域能够进行深人研究，比如疫苗基因、灾害防治、细胞育种、动物克隆等领域，而且对于海水养殖中动物的病毒灾害防治也有着重要的意义。鱼类细胞系可以用于病毒分离、病毒的疫苗研制等等一系列灾害防治当中。大大加快了我国海水养殖鱼类的病毒疫苗研究工作的进程，如果运用到医疗当中会带来巨大的经济效益，大力推动社会和经济的发展。鱼类细胞系可以制作成细胞模型，用来研究与鱼类病毒相关的研究，大力推动了我国对于疫苗基因的研究。还可以用于进行病毒环境的研究，检测环境中的污染物品。：，大黄鱼鳍细胞系的建立将大黄鱼放人２Ｏ２摄氏度的高双抗消毒水中２４小时之后，取出其鳍组织。用磷酸缓冲液洗两遍之后放人７５％酒精中，大约一分钟之后，进行第二次漂洗。然后再用０．５％的透明质酸酶和０．２％的原酶进行混合，等到４５分钟之后进行离心，将沉淀物收集。再用大约５％的胎牛血清ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＬｅｉｂｏｖｉｔｚＬ－１５和ＤＭＥＭ培养液进行稀释，在２２、２５、２８摄氏度中分别进行原代培养。对鳍组织的细胞迁出、细胞贴壁、细胞生长、细胞分裂等状况进行分析，研究出最适合培养的的温度。对于处理好的鳍组织要在最适合的温度下进行原代培养，等到细胞变成了细胞单层，运用樊严俊的方法进行继代培养，每３＂５天进行更换一次培养液。细胞到了第ｌ５代以后，就不必在培养液中加壳寡糖、硫酸软骨素等等。按照樊廷俊的方法进行实施之后，将取出的第６０代的大黄鱼鳍细胞接种到带２４孔培养板中，每过１２个小时就取出３个孔细胞进行计算，画出细胞生长曲线图，计算群体培养需要的时间。对于染色体标本的制作依然按照樊廷俊的方法，取第６０代鱼鳍细胞，放入秋水仙素中ｌＯ￣ｄ－，时之后进行细胞收集。经过低渗、固定、滴片、干燥之后，开始用Ｇｉｅｍｓａ进行染色，在显微镜下观察染色之后的染色体。三大黄鱼醴细胞系的研究经过在透明质酸酶和原酶混合之后的黄鱼鳍组织，启动原代培养７天之后有大面积的细胞迁出，大约占了瓶底的１５％。而且从生长到分裂的速度极陕。在Ｌ — ｌ５和ＤＭＥＭ中培养的鱼鳍组织细胞迁出的很少，仅仅占瓶底面积的１０￣／ｏ；￣右，而且从生长到分裂的速度极慢，如表１。表１大黄鱼鳍组织迁出细胞的数目