组织制片技术概述
组织制片技术-病理检验技术PPT
1.常用固定液
➢ 浓度10%福尔马林（浓度4%甲醛） 配制：取40%的甲醛1份加水9份混合即成。 优点：渗透力强，组织收缩小，固定均匀； 固定后组织硬度适当 ； 可增加组织韧性 ； 成本较低，可用于固定和保存大标本。
1.常用固定液
➢ 浓度10%中性缓冲福尔马林（7.2-7.4）
定效果。 注意：因乙醇的渗透力弱，固定速度慢，细胞核
着色不太理想，所以用其固定的标本取材 要薄。
1.常用固定 ➢ 乙液醇-甲醛固定液（A-F固定液）
配制：95%乙醇或无水乙醇9份，加40%甲醛1份混 合而成。
特点：此液同时兼有固定与脱水作用，尤其适用于 皮下组织中肥大细胞的固定。
➢ 乙醇-醋酸-甲醛混合固定液（AAF固定液）
（二）固定的方法
➢ 浸泡固定法：最常用。用于浸泡固定液的体积不 得少于标本体积的5倍。
➢ 注射或灌注法：多用于整个器官或尸体的固定。 ➢ 微波固定法：主要用于少量或小块组织快速制片
时的固定。 ➢ 蒸汽固定法：主要用于可溶性物质、血液或细胞
涂片及某些薄膜组织等小而薄标本的固定。
（三）固定的注意事项
病理检验技术
组织制片技术
学习内容
➢ 组织块的处理 取材 固定及固定液选择 洗涤、脱水、透明 浸蜡、包埋
➢ 组织切片 切片机原理 切片技术
学习目标
取材、固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、脱水
掌
剂等概念
握 脱水、透明、浸蜡、包埋、切片等技术操作
熟 悉
组织切片制作的基本程序
了 常用固定液的配制和应用 解
配制：浓度40%甲醛10ml、冰醋酸5ml加入95%乙 醇85ml混 合而成。
组织切片的基本技术
生活观察不易看清细胞、组织的微细 结构，经过固定、脱水、包埋等手续 后就可把材料制成极薄的片子，再用 不同的的染色方法以显示不同细胞和 组织的形态，以及细胞和组织中某些 化学成分含量的变化。切片也便于保 存，所以是教学和科研中常用的方法。
制片方法
非切片法：整体封藏法、涂四百多年过去
……
光学显微镜
电子显微镜
普荧激暗相偏微倒
通光光视差光分置
光显共野显显干显
学微聚显微微涉微
显镜焦微镜镜差镜
微
扫镜
显
镜
描
微
显
镜
微
镜
透扫 扫环原 射描 描境子 电电 隧扫力 子子 道描显 显显 显电微 微微 微子镜 镜镜 镜显
微 镜
组织切片技术
组织切片技术是组织学、胚胎学、生 理学、动物学等生物科学及病理解剖等 医学科学，研究观察细胞、组织的生理、 病理形态变化的一种主要方法，用以补 充生活观察的不足。
包埋
切片
贴片
烤片
染色
可省略，因 为材料一直 存 于 70% 酒 精中
伊红预染1 min
高浓度酒精 时间尽可能 短些
固着蜡块：
修切好的蜡块，取小木块用蜡铲或其他金属片加上热石蜡，再 烙溶蜡块底面，速粘于木块上，冷却后装上切片机即可切 片。
切片刀、磨刀机：
切片机：
冰 冻 切 片 机
切片：
切片前要磨刀，粗磨和细磨。
切片前应注意刀的倾角不宜过大或过小，一般以4-6℃为适当， 其次调整刻度指针到要求的切片厚度，组织器官常切5-7微米即 可。
波恩氏固定液：苦味酸呈黄色要洗掉。固定好的材料放 在70%或75%的酒精洗掉黄色。然后可在70%或75%酒精 中长期保存，一段时间换一下酒精即可。加MnSO4、 ZnSO4可帮助洗去苦味酸，但过后MnSO4、ZnSO4也要洗 净。
实验一 组织制片技术(一)
实验一组织制片技术（一）【实验原理】显微鉴定法就是利用显微镜、显微技术及显微化学方法等对中药进行分析鉴定的方法。
可以确定中药的真伪、纯度、品质以及建立鉴别标准。
目前多数用于品种鉴定，部分用于定量分析。
在鉴定过程中，以采用显微镜观察动、植物的组织构造、细胞形状、内含物的特征以及矿物的光学特性等为主要内容。
按照鉴定的方法可分为组织鉴定、粉末鉴定、显微常数测定和显微定量等。
组织鉴定是粉末鉴定的基础，以粉末鉴定应用最为广泛。
显微鉴定是一项专门技术，需要有植物(动物)解剖学、矿物学的晶体光学、植物显微化学等基本知识，并掌握显微制片、显微观察和描述、显微摄影和绘图、显微测量等基本技术。
显微鉴定的主要仪器有各类光学显微镜和电子显微镜等，通常使用光学显微镜。
【目的要求】1.掌握显微制片方法2.掌握显微测量的方法和放大倍数的使用3.掌握显微特征的观察与描述方法和显微绘图技术4.熟悉掌握显微测定尺的使用方法5.了解显微摄影技术与方法【仪器、试剂、材料】1.仪器生物显微镜，目镜测微尺，镜台测微尺，显微描绘器，镊子，解剖针，载玻片，盖玻片，酒精灯，单面刀片，粉碎机，绘图板，铅笔等。
2.试剂水合氯醛试剂，苏丹Ⅲ试液，稀甘油试剂，盐酸，硝酸，碘化铋钾试剂，氯化锌碘试液，硫酸，α-萘酚浓硫酸试液，碘试液，间苯三酚试液，钌红试液，硝酸汞试液，乙醚，石油醚，90%乙醇，70%乙醇，α-萘酚乙醇溶液，稀盐酸，稀醋酸等。
3.药材样品：牛膝、薄荷4.药材粉末：大黄、肉桂、山药【实验内容】一、显微鉴定1.组织鉴定组织鉴定是通过观察中药的组织构造特征来达到鉴定目的，主要用于个体较小的完整药材鉴别。
通常用以鉴别药材性状特征不明显或外形相似而组织构造不同的类似品、混淆品、代用品、伪品，或用于多来源药材的对比鉴别，也可用于确定某种化学成分的存在部位，以考查质量。
一般地说，组织鉴定对不同科属来源的药材鉴别比较容易，对于相同科属来源的药材鉴别比较困难。
病理学实验技术重点
1.什么是病理学技术？病理学技术（组织标本切片和染色技术）是组织学、病理学等学科用于观察和研究组织与细胞的正常形态及病理变化的常用方法。
2.组织制片的目的。
生物学标本在生活状态下多为无色透明，而且组织一旦离开机体后很快就会死亡，其结构就会失去正常状态,必须对组织采取固定、切片和染色措施！3.何谓组织制片技术？组织经过固定、切片和染色后，光波通过被检组织成分时，波长和振幅发生改变，在显微镜下能清晰的观察其组织结构，称之为光镜标本的基本制作方法或称为组织制片技术。
4.组织制片种类及其各类方法的分类。
（一）组织非切片制作方法：组织分离标本组织活体标本组织涂片标本磨片标本整体封存（压片）标本组织铺片标本组织印片标本等（二）组织切片法：1.石蜡切片法 2.火棉胶切片法 3.冰冻切片法4.超薄切片法（电镜技术） 5.树脂切片 6.碳蜡切片5.组织制片的主要程序。
取材、固定----脱水-----透明、浸渍-----包埋、切片----贴片、染色---浸洗----脱水----透明----封固6.实验动物处死常用方法及优缺点。
1）挥发性麻醉剂（吸入麻醉）包括：乙醚、氯仿等。
优点：乙醚吸入麻醉适用于各种动物，安全度亦大，动物麻醉深度容易掌握。
缺点：是对局部刺激作用大，可引起上呼吸道粘膜液体分泌增多、肺部充血，再通过神经反射可影响呼吸、血压和心跳活动，并且容易引起窒息，故在乙醚吸入麻醚时必需有人照看，以防麻醉过深而致动物死亡。
2）非挥发性麻醉剂（注射麻醉）这类麻醉剂种类较多，包括10%苯巴比妥钠、4%戊巴比妥、5%硫喷妥钠等巴比妥类的衍生物，20%氨基甲酸乙脂（乌拉坦）和1%水合氯醛、氯胺酮等，可通过肌肉注射、静脉注射、腹腔注射。
优点：这些麻醉剂使用方便，一次给药可维持较长的麻醉时间，麻醉过程较平衡，动物无明显挣扎现象。
3）断髓（脱臼）法动物处死过程中动作要迅速，尽量避免其长时间处于痛苦或濒于死亡状态，以免机体内组织或细胞结构发生改变引起人工假象。
石蜡切片冰冻切片超薄切片
石蜡切片技术虽然21世纪医学高科技迅猛发展、日新月异，新的诊断方法层出不穷，但迄今为止，即使是世界上最发达国家，疾病的确诊主要还是通过病理诊断。
病理诊断是所有其他诊断(包括临床诊断、影像诊断、实验室检查诊断乃至分子诊断)的金标准。
因此学习相关病理诊断技术具有重要意义。
病理技术不仅可以作为临床诊断的金标准，还可以帮助临床查明死因，对研究生来说还可以提供教学、科研的资料。
病理学科是一门基础与临床之间起着桥梁作用的重要学科，病理研究方法在技术工作上又是多方面的，有尸体解剖，大体标本的制作、制片技术（石蜡切片、冰冻切片、火棉胶切片、半薄切片、超薄切片）组织化学方法，免疫酶标技术、荧光技术、摄影技术等。
硕士研究生学习的课题研究阶段，往往需要自己设计并亲自动手操作，为满足研究生的实际需要，本章简要介绍常用的病理学有关技术，并注意尽量做到：①突出实用性：以行之有效的病理学常用技术为主线，围绕硕士研究生的实际需要，对病理学技术的原理、相关理论及具体操作方法、步骤等进行阐述。
②反映进展性：充分反映病理学的时代性与进展性。
第一节组织制片的概述组织制片技术的应用，从1665年由HOOk发现细胞开始，已有300多年的历史。
最早应用冰冻切片；随后又进一步利用石蜡的硬度，以石蜡包埋组织，制成石腊切片；后来又利用明胶、火棉胶、碳蜡和塑料等物质的韧性，以其包埋组织而制作切片。
组织制片技术随着生物学和医学的发展而发展。
切片染色方法可以显示不同细胞和组织形态，以及细胞和组织中某些化学成分含量的变化。
因此，组织制片技术是教学、医学和科研中不可缺少的一个组成部分。
第二节制片的种类一、组织切片法：任何组织切片必须依靠切片机将组织切成薄片（厚度以μm计），再进行染色而得到结果。
在切成薄片以前必须设法使组织内部渗入足够的支持物质，使组织保持一定的硬度，然后使用切片机进行切片。
渗透到组织中的支持剂（物质）有多种，如石腊、明胶、火棉胶、碳蜡和塑料等。
组织切片技术
组织切片技术第一章组织制片概述组织制片技术是观察细胞、组织的生理和病理形态变化的一种主要的方法。
组织化学技术和原位杂交技术都是以组织制片为基础的。
一、制片前的准备工作1.染色缸和标本瓶的清洗用毛刷沾去污粉将染色缸和标本瓶里外擦洗，自来水冲洗干净备用。
金属银或组织化学染色时，器皿更要彻底清洗。
先去污粉洗，再洗液浸泡过夜，再自来水和蒸馏水冲洗。
洗涤液的配制：重铬酸钾300克浓硫酸300毫升蒸馏水3000毫升2.载玻片和盖玻片及其清洗载玻片简称为玻片或载片，一般尺寸为76毫米×26毫米，厚度为1-1.5毫米。
盖玻片一般为正方形或长方形，厚度为0.15-0.5毫米。
最常用的规格为18×18毫米、20×20毫米，还有其它规格的。
煮沸洗涤法: 新旧玻片均可采用。
洗衣粉水浸没玻片，加热煮沸15-20分钟，冷却，自来水冲洗，干净的白棉布或纱布擦干，保存备用。
酒精浸泡擦拭：新的玻片或载片可直接用酒精浸泡、擦拭，保存备用。
洗液浸泡法：要求严格的玻片，可在洗液浸泡后在冲洗干净。
二、制片方法的种类（一）非切片法不用切片机、没有切片手续而制成切片的方法。
常用的有以下几种：1.整体封藏法待制作的材料一般很小或为一薄片状，如无脊椎动物的水螅和草履虫等，脊椎动物的鸡胚和蛙胚等。
这些材料取下后经固定、脱水和染色就可以封藏在玻片内。
2.涂片法主要是液体或半流动性的材料，如血液、精液、细胞学检查、微生物等，直接将材料涂在玻片上，再经固定和染色制成标本。
血液涂片的制作与染色：取一干净载玻片，用左手拇指和食指夹住，然后取一小滴动物血置于载玻片右端,再取另一张边缘光滑的载玻片, 斜置于血滴左侧, 先向右稍移动轻轻触及血滴,使血液沿玻片端展开成线状, 两玻片的角度以30~40°为宜(角度过大血膜较厚,角度小则血膜薄), 轻轻将载玻片向左推进,即涂成血液薄膜,推进时速度要一致,否则血膜成波浪形,厚薄不匀. 待涂片在空气中完全干燥后,将血涂片靠近中央部分的两边(与载玻片短边平行的边)用玻璃铅笔圈上并平放在染色架上进行染色。
组织学制片技术
目的要求
1、了解组织学制片的基本程序；
2、熟悉HE染色的步骤；
3、掌握HE染色结果的观察。
一、组织学常用的几种标本类型
1．切片标本：组织经固定、切片（包括冰冻 切片、石蜡切片及火棉胶切片）染色、封固 而制成的各种玻片标本。它为组织学中最常 用的标本。
2．铺片标本：将肠系膜或皮下组织铺于载 玻片上，经固定、染色、封固而制成的标 本。
3、常用的透明剂有二甲苯、甲苯、氯仿等。 二甲苯：透明组织的能力强，但易使组织收缩和 变脆，故在二甲苯中不宜搁置太久。 氯仿：其透明能力远比二甲苯慢，透明时间可以 延长至24小时也无妨。
（五）包埋
1． 目的：由于生物体的组织有各种硬度不同的成份， 必须加石蜡等作支持物质渗入组织块内部，并将组织 块包埋起来，然后用切片机以制作极薄的切片。 2． 种类：包埋物质目前广泛采用的除石蜡外，还有 火棉胶、炭蜡、明胶以及环氧树脂、OTC(冰冻切片包 埋剂）等。
1、动物致死法： （1）颈椎脱臼法 （2）断头法 （4）空气栓塞法：
2、组织取材时应注意： (1)所取材料越新鲜越好； (2) 切取组织的刀剪刃口必 须锋利； (3) 取材时必须考虑切面的 方向； (4)组织块应力求小而薄； (5)收缩较大的新鲜组织； (6)注意清洁； （3）麻醉法
（三）标本的固定
8．活体标本：在组织细胞生活状态下进行观察 的标本，或生活状态下进行活体染色后制成 的标本。
9 ．血管注射标本： 一种是将树脂类铸形剂经血管灌 注后，用强酸或强碱腐蚀血管周围组织而制成的血管 铸形标本，可瓶装供肉眼观察或进一步处理后作扫描 电镜观察。另一种是将染料加明胶配制成染色液注入 血管内，然后取材、固定、包埋、切片和封固所制成 的组织切片标本。这类标本主要用于了解血管的走行 及其与所支配组织或器官的相互关系。
组织切片技术(精品)
---------------------------------------------------------------最新资料推荐------------------------------------------------------组织切片技术(精品)组织切片技术第一章组织制片概述组织制片技术是观察细胞、组织的生理和病理形态变化的一种主要的方法。
组织化学技术和原位杂交技术都是以组织制片为基础的。
一、制片前的准备工作 1.染色缸和标本瓶的清洗用毛刷沾去污粉将染色缸和标本瓶里外擦洗，自来水冲洗干净备用。
金属银或组织化学染色时，器皿更要彻底清洗。
先去污粉洗，再洗液浸泡过夜，再自来水和蒸馏水冲洗。
洗涤液的配制：重铬酸钾 300 克浓硫酸 300 毫升蒸馏水 3000 毫升 2.载玻片和盖玻片及其清洗载玻片简称为玻片或载片，一般尺寸为76 毫米26 毫米，厚度为 1-1. 5 毫米。
盖玻片一般为正方形或长方形，厚度为 0. 15-0. 5 毫米。
最常用的规格为 1818 毫米、 2020 毫米，还有其它规格的。
煮沸洗涤法: 新旧玻片均可采用。
洗衣粉水浸没玻片，加热煮沸 15-20 分钟，冷却，自来水冲洗，干净的白棉布或纱布擦干，保存备用。
酒精浸泡擦拭：新的玻片或载片可直接用酒精浸泡、擦拭，保存备用。
洗液浸泡法：要求严格的玻片，可在洗液浸泡后在冲洗干净。
1/ 16二、制片方法的种类（一）非切片法不用切片机、没有切片手续而制成切片的方法。
常用的有以下几种：1.整体封藏法待制作的材料一般很小或为一薄片状，如无脊椎动物的水螅和草履虫等，脊椎动物的鸡胚和蛙胚等。
这些材料取下后经固定、脱水和染色就可以封藏在玻片内。
2.涂片法主要是液体或半流动性的材料，如血液、精液、细胞学检查、微生物等，直接将材料涂在玻片上，再经固定和染色制成标本。
血液涂片的制作与染色：取一干净载玻片，用左手拇指和食指夹住，然后取一小滴动物血置于载玻片右端,再取另一张边缘光滑的载玻片, 斜置于血滴左侧, 先向右稍移动轻轻触及血滴,使血液沿玻片端展开成线状, 两玻片的角度以 30~40 为宜(角度过大血膜较厚,角度小则血膜薄), 轻轻将载玻片向左推进,即涂成血液薄膜,推进时速度要一致,否则血膜成波浪形,厚薄不匀. 待涂片在空气中完全干燥后,将血涂片靠近中央部分的两边(与载玻片短边平行的边)用玻璃铅笔圈上并平放在染色架上进行染色。
病理检验技术
一、取材
按照病理检查的目的和要求，切去适当大小和数量的组织 块，用于制作组织切片的过程，称为取材 注意事项：1.避免组织结构变形 2.组织块大小适当 3.及 时取材 4.标明包埋方向 5.染色包裹小标本 6.充分暴露病 灶 7.确定取材部位 8.清除多余组织 9.重复取材（补材） 10.认真核对
五、透明
使用某些化学剂（如二甲苯等）将组织中的脱水剂置换出 来，以利于浸蜡和包埋，因组织块浸入这些试剂后常呈半 透明状，故称透明（或媒浸）。使用的化学药剂称为透明 剂 透明剂：二甲苯：是最为常用的一种透明剂，它能与酒精， 丙酮相混合，又是石蜡的溶剂。在透明过程中，组织继续 发生硬化，由于二甲苯对组织的收缩性强，作用迅速，因 此，组织在二甲苯中时间不宜过长，否则组织容易变脆变 硬，一般是达到组织的透明为度，小块组织在半至一小时 内透明。
八、切片
切片的步骤： 1、将蜡块固定于切片机头上的夹座内，调整到稍离开切片能够切到 的位置上，注意蜡块组织切面与切片刀口要垂直平行。 2、再调整蜡块组织切面恰好与刀口接触，旋紧刀架，固定好机头。 3、根据需要调整切片厚度。 4、摇动切片机手轮先进行修整切片，直到切出完整的最大组织切面 后，再进行切制。 5、实践中可用右手转动切片机手轮，左手用毛笔托起蜡片，协调地 进行切片操作。 6、切下的切片带，一端用镊子轻轻拉起，应尽可能将切片带拉直展 开，用毛笔将切片带从刀口向上挑起，拉下切片带，然后轻拖铺于恒 温水面上。
二、固定
将组织浸入某些化学试剂，使组织细胞内所含物质尽量保 持在生活状态时的形态结构和位置的过程，称为固定 固定方法： 1浸泡固定法 2.注射、灌注固定法 3.微波固 定法 4.蒸汽固定法 常用固定液有：甲醛（10%） 乙醇（80%） 乙酸 （0.3%~5%）
组织切片技术
一般组织学取材稍大，细胞学取材稍小，动物组织取 材要稍大，植物组织取材稍小。
2.1.1 人体组织标本的取材
手术切除标本，各种活检穿刺标本和尸体解剖标本。
手术切除标本的取材： 病灶在组织中的分布常存在不均一性，取材要有代表性，取材部位
石蜡切片是最基本的切片技术，冰冻切片 和超薄切片等都是在石蜡切片基础上发展起来 的。现以石蜡切片为例，介绍切片标本的制备 方法。
组织学制片步骤：
取材
固定 冲洗
脱水
透明
浸蜡 包埋 修块 切片 贴片
烤片
染色 封片 观察结果
2.1 取材
根据不同的实验目的，选择相应的材料，材料要求新 鲜、准确、完整，材料要避免挤压、挫伤、干枯。
组织学制片技术有很多不同的制片方法，一般可分为切 片法与非切片法两大类：
切片法：石蜡切片、火棉胶切片、冰冻切片等。 非切片法：铺片、涂片、压片、磨片、整装片等。
1、非切片法
即不用切片机，不经切片手续而制成切片的方法， 根据材料性质的不同，有不同的处理方法，该类方法 操作简单快捷，其中铺片法，封藏法可使原有组织结 构不被破坏，涂片法，压片法弥补了用包埋，切片法 所不可能观察清楚的不足，因此是组织标本制备中常 用的手段。
6.注意确定取材部位和包埋切面的方向，切除不需要的部分。 7.明确编号，登记
2.2 组织标本的固定
新鲜的组织被割取后,由于细胞内酶的作用和细菌的 繁殖，可引起组织的自溶和腐败。因此，割取组织块后， 应立即采用一种方法，将组织尽可能保持原有的形态结 构，且有利于保存和适于制片的操作，这一步骤称为固 定。化学固定法就是用化学试剂配制成固定液使组织固 定。
组织制片技术原理与流程及切片机的使用
组织制片技术原理与流程及切片机的使用组织制片的特点组织制片是组织学、胚胎学、病理学、生物学等学科观察和研究组织、细胞的正常形态和病理变化的常用方法。
其基本原理是用固定剂固定组织、细胞以及各种亚细胞器，保持组织的微细结构，制成薄片，并用不同的染色方法增加各部分的色差，在显微镜下观察组织、细胞的形态结构，或利用化学或物理方法显示组织、细胞内的某些化学成分，并可进行形态和化学成分的定量分析。
随着细胞和分子生物学技术的发展，组织制片也为原位显示细胞内基因表达提供了基础。
一石蜡包埋切片制作石蜡不溶于水而溶于二甲苯等有机溶剂，故固定好的组织须先用乙醇、丙酮、正丁醇等脱水剂脱去组织中的水，后用二甲苯等透明剂置换出乙醇，此过程即脱水、透明。
再用石蜡渗入组织块，冷凝后变硬，即浸蜡、包埋，就可在切片机上切片了。
1.固定细胞、组织离体后要迅速用相应的固定剂固定，使蛋白质沉淀、变性、凝固，保持组织原有的形态结构和抗原性。
一般用多聚甲醛、FAA、丙酮或Carnoy于4℃并向固定过夜。
2.脱水与透明固定后的组织须由低浓度到高浓度的乙醇逐级脱水，一般为50%、70%、85%、95%、和100%（3次）3.渗蜡与包埋渗蜡是石蜡置换组织块中透明剂的过程，一般用熔点为52-60℃的石蜡。
透明后的组织块先于1/1体积的二甲苯与石蜡中37℃渗透过夜，后温度调至58℃换入纯石蜡继续渗透，一般每间隔3h换一次纯石蜡，直到无二甲苯气味即可进行包埋。
4.切片与展片先用刀片修去组织块周围多余的石蜡，一般保留2mm左右的石蜡，修整成梯形的组织块，以便于展片时蜡带的分离。
先加热刀片，后把修好的组织块快速粘到方形的小木块上，冷凝后即可进行切片。
一般组织切片的厚度为6-12um，切片速度以40-50次/min为宜，用毛笔托起蜡带，分割后依次放到洁净的载玻片上，蜡带的光滑面朝下放，后滴上适量的蒸馏水放至展片台上于37-40℃烤片过夜。
5. 染色、脱水、透明与封片染色一般是双重染色或单染，番红与固绿是常用双重染色法，而苏木精是最优良的核染色剂。
病理制片和染色技术
4）固定剂兼有硬化作用，使组织硬化 增加组织硬义，便于制片。
5）防止细胞过度收缩或膨胀而失去其 原有形态结构。
6）经过固定的组织，能对染料产生不 同的亲和力而着色清晰，便于辩认。
由于固定的目的是在于尽量使组织和 细胞保持与生活时相仿的成分和形态。因 此，固定的组织愈新鲜愈好，固定组织时， 应使用足量的固定液，其固定液的量一般
5）尽可能避免使组织膨胀或收缩。 6）能使细胞内的成分（蛋白质）凝固或沉 淀下来。 7）增加细胞内含物的折光程度，易于鉴别。 增加媒染作用和染色能力。 8）使组织变硬，适于制片，但又不使材料 太坚硬而松脆。 9）使组织充分固定，便于保存。
第二节 介绍几种常见固定液
固定剂有简单固定剂（液）和混合固定剂两 类。作为较好的固定液，首先有强渗透力，能迅 速地渗入组织内部；其次不会使组织过渡收缩或 膨胀，并能使组织内易观察的成分得以凝固为不 溶性物质；最后能使组织达到一定硬度，获得较 佳的折光率和对某些染料具有较强的亲和力。
2．标本切开或取厚块→组织固定（冰 冻切片法）→冰冻切片→粘片→乙醇固
定及水洗→常规染色→脱水→透明→ 树胶封片。
第二章 固定、固定液和取材
第一节 组织固定方法
在制作组织切片的过程中，首 先将组织充分固定后才能进行制片， 尤其对石蜡切片，这是不可少的重 要步骤。
1、固定的意义
就是使要观察的组织构造尽量 接近于它生前的正常状态。
此固定液是应用最广的一种，它可以保 护脂类和细胞核。在作酸性染色时，入 Ｖ-Ｇ，或三重染色之前，还可以再使用 第2次固定。
第三章
洗涤、脱水、透明、浸蜡 和包埋、切片
第一节 组织洗涤
一、洗涤的目的
6、丙酮
丙酮又名醋酮或本酮，极易挥发、 易燃的无色液体，能与水、醇、氯仿、醚 及多种溶液混合。
病理科组织制片ppt课件
对切片的厚度、均匀性和染色效果进行评估 ，确保其质量和一致性。
制片技术员培训
定期对制片技术员进行培训和考核，确保他 们掌握正确的制片技术和操作流程。
病理诊断准确性
通过对病理医生提供的诊断结果进行复核， 确保制片质量和病理诊断的准确性。
02
病理科组织制片技术
石蜡制片技术
石蜡制片技术是病理科最常用的制片 技术之一，其流程包括取材、固定、 脱水、透明、浸蜡和包埋等步骤。
石蜡制片技术的缺点在于制片过程较 为繁琐，需要耗费较多的时间和人力 。
石蜡制片技术的优点在于能够长期保 存组织，并且可以制作出较为美观的 切片。
冰冻切片技术
冰冻切片技术是一种快速制片 技术，适用于手术中需要快速 病理诊断的情况。
冰冻切片技术的优点在于制片 速度快，能够及时为临床提供 诊断意见。
冰冻切片技术的缺点在于制片 质量不如石蜡制片技术，容易 出现细胞皱缩、变形等问题。
诊断感染性疾病
病理科组织制片技术还可以用于诊断 感染性疾病，通过对感染组织的病理 学观察和分析，确定感染的病原体类 型，为临床医生选择合适的抗生素提 供依据。
在科研中的应用
探索疾病机制
病理科组织制片技术可以用于探索疾病的发病机制，通过对病变组织的形态学 观察和病理学分析，揭示疾病的发生、发展和转归过程，为疾病的预防和治疗 提供科学依据。
包埋
04 将脱水后的组织放入适当的包
埋剂中，使其硬化，以便于切 片。
切片
05 将硬化的组织切成薄片，通常
为5-10微米厚。
染色
06 将切片进行染色，以便在显微
镜下观察时能够更好地分辨不 同的组织和细胞成分。
组织制片的质量控制
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固定的时间
一般情况下固定24小时既可达到 固定要求。
固定后处理 ：
流水冲洗 脱黄 脱汞 脱甲醛色素 组织漂白 脱钙（酸溶液脱钙 螯合脱钙 电解脱钙 脱钙 酸溶液脱钙 、螯合脱钙 、电解脱钙 ）
固定剂 单纯固定剂 甲醛、乙醇、冰乙酸、升汞、苦味酸、 重铬酸钾、丙酮、 铬酸、四氧化锇 混合固定剂 中性甲醛液、乙醇—甲醛液、 Bouin氏液、
胰腺—胰尾部 脊髓的运动神经元—颈膨大和腰膨大处 肺 —肺门 胃—胃底部
根据器官组织的结构特点选择切面方向
肾脏—肾门处作纵切
头皮—顺毛根的方向纵切
大小肠的环行皱襞—纵切
气管和食管—横切
应注意的问题 ：
组织新鲜 注意环境温度的影响 材料应小而薄 1．5×1．5 × 0．5厘米3 防止组织变形 防止组织损害 防止组织污染
垂体前叶等含特殊颗粒的细胞
脱水和脱水剂
脱水 脱水剂
乙醇、丙酮、正丁醇 正丁醇
乙醇 既是固定剂又是实验室常用脱水剂，脱水能力强， 能与二甲苯等透明剂较好地混合。用乙醇脱水时遵循从 低浓度向高浓度的梯度脱水原则。一般组织从70%浓度 开始至无水乙醇，胚胎组织从30%浓度开始。组织在高 浓度乙醇中停留时间不能过长，否则将会使组织脆化。
药品水溶液将其细胞间质消化溶去，再用机械分离的方法， 如利用水的震荡冲击力等，使小块组织分离成单个而又完整 的细胞，经染色后涂于载玻片上封固的标本。例如平滑肌分 离标本，脊髓的运动神经细胞等。
将所采的观察标本加生理盐水后直 接滴于载玻片上在显微镜下观察。 一种是将胚胎或小动物经前期固定 后整体封藏于盛满固定剂的透明容器中。 另一种是将发育至某一阶段的鸡胚整体取出，经固 定、染色、脱水、透明后封固于载玻片上的标本。 一种是将有色物质注射进 血管，用酸或硷将血管周围的组织腐蚀后做成的整 体封藏的血管标本。 另一种是将有色物质注射进血管后，经一系列 制片技术处理后封固于载玻片上供显微镜下观察的 标本。
染色的原理
化学反应
在组织细胞内一般认为都含有酸性物质和
碱性物质。染色时酸性物质与碱性染料中的阳离子结合，碱 性物质与酸性染料中的阴离子结合。在细胞核中主要由酸性 物质组成（如核酸等），所以与苏木精等碱性染料有很强的 亲和力。细胞质主要由硷性物质组成，所以与伊红等酸性染 料有很强的亲和力。能被碱性染料着色的物质称为嗜碱性 (basophilia) 物 质 ， 能 被 酸 性 染 料 着 色 的 物 质 称 为 嗜 酸 性 (acidophilia)物质。
骨切片
骨组织作切片观察，必须将骨的钙质除去，仅保留软组 织才能切片，这一过程就是“脱钙” 。 脱钙 将厚约2~3mm的骨片放入脱钙剂中24~48小时 5 ml 3~5g
脱钙剂 ： 浓硝酸 尿素
蒸馏水 100 ml 脱钙后可按一般组织标本的脱水、透明、包埋、切片及染色 过程进行处理。 骨髓切片、 骨髓切片、冰冻切片
中性甲醛液
配制方法： 40%甲醛 120ml 磷酸二氢钠 4g 固定时间： 24小时。 蒸馏水 880ml 磷酸氢二钠 13g
固定后处理： 流水冲洗24小时。 适用组织： 实验室常备固定剂，适用多种组织的固定。
乙醇—甲醛液（ 乙醇 甲醛液（A—F液） 甲醛液 液
配制方法： 固定时间： 95%乙醇90ml 40%甲醛10ml
取材的方法： 取材的方法：
选择动物 选择取材部位 选择切面方向
根据实验工作的目的选择动物
取材应根据实
验工作的目的选择动物的种类、组织部位和材料大小。 肝脏—猪肝 卵巢—猫 胃—狗 运动终板—爬虫类动物 肥大细胞—大、小白鼠的皮下组织 间皮和内皮—蛙的肠系膜铺片最好
根据器官组织的结构特点选择部位： 根据器官组织的结构特点选择部位：
包
埋
组织浸蜡完成后，接着进行组织块包埋。用于包埋的 是硬蜡。使用前须在恒温箱中多次溶化，利用热胀冷缩的 原理挤出原石蜡里的空气，再加入一定数量的（约十分之 一）蜂蜡（或旧蜡）相混合，提高石蜡的密度和粘度，以 使切片时便于形成完整的蜡带。蜂蜡也称黄蜡，是一种动 物蜡，溶点约在54℃，粘滞度比石蜡高。 组织块包埋一般采用包埋框来进行，包埋框由两块“L” 型的金属框和一块金属底板相对拼合而成。包埋组织时应 注意将组织块的切面朝下放平，包埋镊应加温后使用。组 织包埋好后，应等石蜡凝固后才可将包埋框打开。修整蜡 块时，组织块应距蜡块边缘2—3毫米，以利于连续切片。
丙酮
沸点56℃，脱水能力比乙醇强，但对组织的收缩脆
化作用也比乙醇强，因此主要用于组织的固定兼脱水或切 片的快速脱水，以保护某些特殊染色的标本不被褪色。 正丁醇 沸点100--118℃，脱水能力较弱，但很少引起
组织的收缩和脆化。因能与乙醇和石蜡混合，因此经正丁 醇脱水的组织可直接浸蜡包埋。脱水方法：组织块经固定 洗涤后入50%、70%和80%乙醇中作基础脱水，然后转入 正丁醇中脱水12—24小时，再浸蜡包埋。
浸
蜡
用于组织块浸蜡的石蜡分为低溶点蜡和高溶点蜡。 低溶点蜡溶点在48℃--50℃，也称软蜡；高溶点蜡溶点 在60℃--62℃，也称硬蜡。因此，浸蜡的恒温箱相应地 分为软蜡箱和硬蜡箱两种：软蜡箱的温度控制在52℃— 54℃之间，组织浸蜡时间一般可达2—4小时；硬蜡箱 的温度控制在62℃--64℃之间，组织浸蜡时间一般不超 过1小时。组织块浸蜡的成功与否与温度和时间有很大 的关系，温度愈高，时间愈长，则组织块的收缩愈大， 脆化愈明显
铺片
将需要观察的薄片组织用手工的方法直接铺于载
玻片上，然后经过固定、染色等程序制成的标本。例如蛙的 肠系膜铺片，直接在磨石
上用手工磨成大约50微米左右的薄片，然后再进行染色封固 在载玻片上的标本。
消化分离
将组织分离成小块，然后利用相应的化学
苯甲酸甲脂
为无色透明的液体，易挥发，透明能力强，
对组织块的收缩和脆化的影响较小。透明时间12--24小时。 组织块经各级乙醇至95%浓度脱水后可直接入苯甲酸甲脂 透明。由于苯甲酸甲脂可溶解火棉胶，也可用于火棉胶切 片的透明。 三氯甲烷 也称氯仿，无色透明的液体，极易挥发，透
明能力较差，透明时间可长达24小时，但氯仿不易使组织 收缩和变脆。目前广泛用于火棉胶胶块的透明。 冬青油
非组织切片法 组织不经过切片手续制成的
观察标本的方法为非组织切片法。 包括：涂片、压片、铺片、磨片、消化分离、 活体标本、整装标本、血管注射标本。
涂片
将所采的血液或骨髓样品涂抹于载玻片上 经瑞氏或姬姆萨染色后的标本。
压片
先将组织处理成小块物质，然后经化学药 品软化和染色，再用盖玻片压封于载玻片上的标 本。例如运动终板等。
透明和透明剂
透明
透明剂
二甲苯、苯甲酸甲脂、三氯甲烷 、冬青油
二甲苯
为无色透明的液体，易挥发，长期接触对呼吸 道粘膜有较强的刺激作用。二甲苯透明能力强。但组织在 二甲苯中浸泡时间过长时较易发生过度收缩和脆化现象。 用二甲苯透明时，小块组织20分钟至1个小时，大块组织 可适当延长时间。如果组织块在透明时呈白色浑浊不透明 状态时，则为脱水不彻底所致。此时应返回重新脱水。
切片的注意事项： 切片的注意事项：
① 切片前要将切片机各部位的螺丝旋紧，否则会引起切 片机各部件震动，造成切片厚薄不匀。 ② 块的切面和切片刀的倾斜度之间的夹角应按切片机 刀台上的刻度作适当调整。 ③ 恒温水箱的温度应比包埋蜡的溶点低5℃--6℃。 ④ 环境温度高时蜡块容易变软。应使用冰块使蜡块的 表面迅速冷却，以增加蜡块表面的硬度。
活体标本
整装标本
血管注射标本
组织切片标本制作的基本程序: 组织切片标本制作的基本程序
取材—固定—固定后处理—脱水—
透明—浸蜡—包埋—切片—染色—封固
取 材
动物的处死
处死动物要求手法迅速、快捷，避免动物因过度痛苦 而产生组织细胞的变化。 处死动物的几种常用方法：
麻醉法 空气栓塞法 击头法 颈椎脱臼法 破坏脑和脊髓 股动脉放血
组织标本制作的方法
组织切片法 非组织切片法
组织切片法
利用化学试剂将组织经过一系
列的固定(fixation)、脱水、透明后，再利用石 蜡或火棉胶和明胶等支持物渗透进组织内部， 使组织保持一定的硬度，并包埋(embedding) 成块，然后依靠切片机(microtome)将包埋好的 组织块切成以微米计的薄片，再根据需要进行 各种染色得到的供显微镜下观察的标本的方法。 石蜡切片、火棉胶切片、 石蜡切片、火棉胶切片、明胶切片 冰冻切片
切 片
石蜡切片
用石蜡作为包埋剂制作的切片称为石蜡切片，是组织切 片中应用最为广泛的一种切片，其优点是易于制作大量菲 薄的组织标本，而且石蜡包埋块又可长期保存。 仪器及器材准备 切片机 切片刀 恒温水箱式摊片仪
经过清洁处理的载玻片 眼科弯镊子 中号羊毫毛笔 粘片剂
切片过程： 切片过程：
调节水温至47℃左右； 固定蜡块； 修整包埋面； 调节切片厚度至4—6微米； 切片； 摊片； 烤片。
染料和染色
染料 是指分子中含有发色团和助色团的有机化合物，有 鲜艳的色彩，对于组织有极强的亲和力。 根据来源可分为两类： 天然染料（卡红、苏木精） 天然染料 人工合成染料（苦味酸、桔黄G） 人工合成染料 根据其化学性质分为： 碱性染料(basic dye) 碱性染料 酸性染料(acid dye) 酸性染料 中性(neutrophilia)染料 染料 中性
苦味酸—硫酸液 、Carnoy氏液 、Helly氏液 氏液
甲醛(Formeldedhyde)
固定浓度： 固定时间： 10%--20%水溶液 12小时—24小时
固定后处理： 流水冲洗12小时—24小时 配制方法： 甲醛原液10ml—20ml
生理盐水（或蒸溜水）90ml—80ml 90ml—80ml 特性： 甲醛原液浓度为40%。甲醛放置时间过长易产生 白色沉淀“三聚甲醛”，氧化后变为甲酸，使溶液变为 酸性，严重时可影响到细胞核着色。因此需长期保存的 甲醛溶液应加入适量的碳酸镁或碳酸钙作为中和剂。酸 性甲醛固定的组织易产生甲醛色素，固定后须用硷性溶 液洗涤