经基因工程改良的抗白叶枯病水稻粳型恢复系“C418-Xa21”及其杂交稻

抗性选择， 从单拷贝 !" ./ 整合的 / 个 -1 植株的 -. 代中筛选到 21 个转基因纯合系。纯合系之内与之 间， 各植株生长整齐一致， 没有发现差异， 统一命名 为 “"3/4) !" ./” 。这些株系将成为配制抗白叶枯病 杂交稻的种源。
图. 5678 .
!"./ 单拷贝整入转基因株系的 !"# 和抗性分析
含有外源基因 !" )% 的杂 的 WX+ 经 #$% 9!酶切后， 交片段应大于 OI&J8。 !"2 抗性鉴定
［%D］ 在分蘖盛期， 用剪叶法 接种白叶枯病 & 个生
理小种， 其中包括 !" )% 基因特异的鉴定小种菲律 （ !O） 。每株接种 G Y D 片叶， 接种液的浓度为 宾O号 测量病斑长度， 表型 %(L ?4ZZ[N\ 左右。接种 ) 周后， 分析中病斑长度不大于整个叶片总长度的 %DQ 视 为抗病， 大于 %DQ 的视为感病。 !"3 农艺性状的考察 转基因株系 “ "$%&* !" )%” 和 “屉优 $%&* !" )%” 及 对照恢复系 “ "$%&” 和品种 “屉优 $%&” 种于中科院遗 传所的试验田， 田间管理同常规。考察的农艺性状 主要为生育期、 株高、 每株穗数、 穗长、 每穗粒数、 结实 率和千粒重。每株系或品系考察 )( 株， 取平均值。
“F#!/” 。GFH 和抗性分析表明单拷贝整合的 3+$! 在 4! 代的分离比为 1 I !。在 4$ 代通过 GFH 和抗性分析选择了 “ F#!/. 3+$!” 。将选择的转基因纯合系 “ F#!/. 3+$!” 与常用的雄性不育系 “屉锦 J” 杂交， 产 3+$! 纯合的转基因株系 生了带有转基因 3+$! 的杂交稻 “屉优 #!/. 3+$!” （简称转基因杂交稻） 。分子分析表明转基因 3+$! 在杂交稻 “屉优 中能稳定遗传； 抗性分析表明转基因恢复系 “ F#!/. 3+$!” 和转基因杂交稻 “屉优 #!/. 3+$!” 对白叶枯病具 #!/. 3+$!” 对白叶枯 有高度的广谱抗性， 并保持了受体对照的优良农艺性状。另外我们还发现转基因杂交稻 “屉优 #!/. 3+$!” ， 这可能是遗传背景的差异所致。抗白叶枯病转基因粳型恢复系和 病的抗性水平高于转基因恢复系 “ F#!/. 3+$!” 杂交稻的育成将有益于杂交稻在我国北方稻区的推广。 关键词 水稻白叶枯病抗性， 粳型杂交稻，分子标记辅助选择，粳型恢复系，转基因 3+$! K2#1L$ 文献标识码 J 文章编号 !%%%.1%0! （$%%!） %#.%1/%.%E
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生 物 工 程 学 报 !"#$%&% ’()*$+, (- .#(/%0"$(,(12
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24.
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分离。抗性鉴定与 !"# 分析完全一致， 同时 $%&’() *+, 杂交分析进一步证实了 !"# 和抗性鉴定的结果 （结果未显示） 。 -. 代的转基因杂合系 （对应于 -/ 代杂合株） 和转基因纯合系 （对应于 -/ 代转基因纯 合株） 的比例符合 . 0 / 的分离比。结合分子分析和
!"# 9,: +*;6;’9,<* 9,9=>;*; %? 9 ’+9,;7*,6< =6,* @6’( 9 ;6,7=* <%A> ’(* ’+9,;7*,* !"./ ?+%B -1 ’% -. 7*,*+9’6%,
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图 % 利用转基因 !")% 培育抗白叶枯病粳型杂交稻技术路线 ,-./ % 012314.5 672 82449-:. ;; 24<-<13:1 =3>7:-?3 @582-9 2-?4 A-1@ 1@4 123:<.4:4 !")%
（结果未显示） 。从 !"# 阳性和对鉴定小种 !O 抗性 ’( 到 ’) 世代对不同的转基因系进行 !"# 和抗性鉴 定， 图 ) 显示了一个具有单拷贝整合的转基因系的 分析结果。 !"# 扩增引物为 C% 和 H% ， ’( 转基因植株 能扩增出 % 条来自 !" )% 基因的 %I$J8 的特异带和 % 条来自非转基 因 对 照 的 %IGJ8 的 背 景 带 （图 )+） 。 选择含有单拷贝整合的 ’( 植株进行自交 得 到 ’% 代， 通过 !"# 和抗性鉴定对转基因 !" )% 在 ’% 代的 遗传进行分析。不同单株研究发现： ’% 代植株中产 抗性植株 （包括转基因纯合株和 生 ) 种 !"# 带型， 杂合株） 都能扩增出 %I$J8 和 %IGJ8 的条带， 而感病 植株只能扩增出 %IGJ8 的条带。 !"# 和抗性分析的 结果完全符合， 均显示出单拷贝整合的转基因 G ] % 分离 （图 )+） ， 没有看到转基因沉默或失活的现象。 选择 ’% 代具有抗性的植株进行自交得到 ’) 代， 从 每个 ’) 代株系中任意选择 )D 个以上的单株用于鉴 定分析， 经 !"# 分析发现 ’) 代株系有两种类型， 即 （图 );） 。 转基因 !" )% 杂合系和转基因 !" )% 纯合系 转基因纯合系中每株都能扩增出 %I$J8 和 %IGJ8 的 条带； 而转基因杂合系中有些单株能扩出这两条带， 有些单株只能扩出 %IGJ8 的条带， 转基因仍然按 G ] %
!"%
&’( 分析 ［&］ 的报道， 合成一对引物 C% ： 据 B3:. 等人 DE*
"F+’"FF’+’++"+F"++++"*GE， H% ： DE*+’+F"++"’* 转 F+’’F"’’FF*GE。利用这对引物进行 !"# 扩增， 基因 !" )% 可扩出 % 条 %I$J8 特异片段， 阴性对照可 扩出 % 条 %IGJ8 的片段。 !"# 反应在 !K*$&( 热循环 仪上按下列程序进行： 预变性 L$M DN-:； 然后 L$M 共 GD 个循环； 最后保温 DOM %N-:， P)M )N-:， %N-:， P)M %(N-:。 !"# 产物在 %Q 琼脂糖凝胶上于 % R ’+K 缓冲液中电泳检测。 !") *+,-./01 杂交分析 ［ ］ 杂交 07S1@42: 杂交参照翟文学等人的方法 %% ，
中图分类号
杂种优势的利用在世界水稻的生产中有着重要 的地位， 尤其在我国杂交水稻已占水稻生产总面积 的 E%M 和总产量的 0%M［!］。长期以来杂种优势的 利用一直局限在籼稻中， 通常认为粳稻没有明显的 杂种优势 。近年来几个粳型恢复系的选育成功促 进了粳 型 杂 交 稻 的 快 速 发 展， 尤其是粳型恢复系 “F#!/” 具有广亲和性、 高配合力和品质好等诸多优
［!!］ 采用 已 建 立 的 转 化 方 法 ， 对粳型恢复系
病具有广谱抗性的显性抗性基因， 而且利用定位克 隆的策略克隆了该基因 。利用克隆的 3+ $! 基因 ［"］ 。目前 通过遗传转化可快速培育抗白叶枯病品种 通过基因枪或农杆菌介导的转化系统已将 3+ $! 基 ［/ P !$］ ， 但该基因尚未引入粳型 因导入几个水稻品种
$期
李晓兵等： 经基因工程改良的抗白叶枯病水稻粳型恢复系 “ "$%&* !")%” 及其杂交稻
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!"# 用转基因 !"$! 培育抗白叶枯病杂交稻技术路线 利用 !"# 和抗性分析对粳型恢复系 “ "$%&” 的 ’( 、 ’% 和 ’) 代转基因株系进行选择。从 ’) 代的转 并与雄性不 基因株系中选择转基因 !" )% 纯合系， 育系杂交配制抗白叶枯病的杂种稻。整个过程见图 “ "$%& ” 的转基因纯合系 %。本研究 中 粳 型 恢 复 系 “"$%&* !" )%” 与雄性不育系 “屉锦 +” 杂交， 配制的转 基因杂交稻为 “屉优 $%&* !" )%” 。
及其配制的杂交稻对革兰氏阴性菌稻黄单孢菌白叶 枯病致病变种 （ 3+$/"(4($+& (*25+% NO ) (*25+% ， 3(( ） 引起的白叶枯病非常敏感， 在病害流行时可造成严 重的产量损失 （杨振玉， 未发表结果） 。为了保证优 良恢复系 “F#!/” 及其配制的杂交稻的大面积推广， 迫切需要改善对白叶枯病的抗性。 目前控制水稻白叶枯病最经济有效的方法是将
［0］
“ F#!/” 成熟胚的愈伤组织进行转化。组织培养所用
［!1］ 的基本培养基为 *3 。选择培养基含 E%%:@\] 头 孢霉素和 E%%:@\] 潮霉素。
收稿日期： 修回日期： $%%!.%!.!%， $%%!.%#.$%。 基金项目： 国家 /01 高技术课题 （!%!.%$.%$.%!） ， 国家转基因植物专项 （ +22.3.%%0） /0.!%.0#/"%#2!； 678： /0.!%.0#/"1#$/； 9.:7;(： <8=>7;? @5A5B;CD) 7C) CA " 联系作者。 45(：
其 探针是从质粒 >"TU%G(% 上扩增的 %I$J8 的片段， 对应于 !" )% 基 因 的 DE 编 码 区， 扩 增 引 物 为 V) DE* VG DE*F’"’’F"* +’’F++’++’’"+"’FFF’+’’FF*GE， "’’F"+"’’"’F"+"F+*GE。根 据 质 粒 >"TU%G(% 的 内切酶图谱， 典型 ’*WX+ 整合的 !" )% 转基因植株
［$， 1］ 。但 “ F#!/” 良性状， 正被广泛用于杂交稻的生产 ［$］
杂交稻品种。本研究将 3+ $! 基因导入生产上正在 从转基因后 大面积推广的粳型杂交稻恢复系 F#!/， 代筛选获得了单拷贝整合的转基因纯合系 “ F#!/. ， 并进一步将 “ F#!/. 3+ $!” 与常用的雄性不育 3+ $!” 系 “ 屉 锦 J” 杂交产生转基因杂交稻 “ 屉 优 #!/. 。研究表明转基因恢复系 “ F#!/. 3+ $!” 和转 3+ $!” 基因杂交稻 “屉优 #!/. 3+ $!” 均保留了对白叶枯病 的广谱抗性和原有的优良农艺性状。
［#， E］ 。 Baidu Nhomakorabea+ $! 是一个对白叶枯 抗性基因导入感病品种
"
"#"
材料与方法
质粒和水稻品种
［!!， !$］ ， 完整的 3+ $! 基因 转化载体为 NFQR!1%! （2L0ST 的 67$ U 片段） ， 位于 4.V*J 上两个标记基因
WXY 和 YZ[ 之间。含有转化载体 NFQR!1%! 的农杆 菌 菌 株 9WJ!%E 用 于 转 化 水 稻 的 粳 型 恢 复 系 “ F#!/” 。 "#$ 转化和组织培养
$
结果与分析
“ ’%!4” 的 !" $! 转基因系的产生 $"! 粳型恢复系 与选择
［%%， %)］ 用业 已 建 立 的 农 杆 菌 介 导 转 化 系 统 ， 将
“ "$%&” 中， 转基因植株及 !" )% 基因转入粳型恢复系 其后代的分析与选择过程见图 %。通过转化共产生 （ ’( ） ， 分析表明所有 ’( 植株均为 %% 株转基因单株
经基因工程改良的抗白叶枯病水稻粳型恢复系 “!#!/. !" $!” 及其杂交稻
李晓兵! 裔传灯$ 翟文学!" 杨振玉1 朱立煌!
! （中国科学院遗传研究所， 北京 1 $ 扬州 !%%!%!） （扬州大学农学院农学系，
$$E%%2）
（辽宁省农业科学院北方杂交水稻中心， 沈阳
!!%!%!）
摘
要
通过农杆菌介导的转化系统， 将业已克隆的水稻抗白叶枯病基因 3+$! 导入重要的粳型杂交稻恢复系