发情周期不同阶段Ghrelin mRNA在猪下丘脑-垂体-卵巢轴的表达

PCR 仪 （ PTC200 ） 为 美 国 BIO-RAD 公 司 产 品 ； 电 泳 凝 胶 成 像 系 统 （ Kodak 1D Electrophoresis Documentation and Analysis System 120）为美国 Kodak 公司产品； Biophotometer（RS232C）为德国 Eppendorf 公司产品。

发情周期不同阶段 Ghrelin mRNA 在猪
下丘脑-垂体-卵巢轴的表达1
张文龙1 , 2 雷治海1 , * 苏 娟1 宁红梅1
1南京农业大学动物医学院，江苏南京(210095) 2西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌(712100)
E-mail：leizh@
3.1 发情周期中 ghrelin mRNA 在下丘脑的表达
猪下丘脑中 ghrelin mRNA 在整个发情周期都有表达，发情前期表达丰度最高，在发情 期 ghrelin mRNA 的表达降到最低，随后开始上升，间情期的水平也较高。发情期组与发情 前期组相比差异显著（P＜0.05，图-1 和图-2）。
表-1 PCR 所用的引物序列及反应条件 Table -1 Nucleotide sequences of PCR primers and PCR conditions
基因 Gene
引物 Primer
5'-TCCTCATGGCAGACTTGG-3' Ghrelin[11] 5'-TGGTCTCAGGGACAATCAC-3'
2 材料和方法
2.1 试剂与仪器
焦碳酸二乙酯 (DEPC) 、琼脂糖购自 Sigma 公司；M-MLV 反转录酶和 Oligo (dT) 引 物购自 Promega 公司； Trizol 试剂、Taq 酶、dNTPs 均购自大连宝生物技术公司； preproghrelin、GAPDH 引物由上海英骏生物技术有限公司合成；其他试剂均为市售国产分 析纯。
AF308930
性 94℃ 30 s，退火 56℃， AF017079 30 s，延伸 72℃，30 s
片段大小 Fragment
326 bp
431 bp
3.3.3 电泳及灰度分析 取 18 µL PCR 产物在 2.0%的琼脂糖凝胶上电泳，溴化乙啶染色。用 Kodak ID 凝胶图
象分析系统分析条带灰度，根据目的基因 ghrelin 和内标 GAPDH 的 PCR 产物的灰度比，确
摘要 Ghrelin 是一种主要由胃肠道分泌产生的 28 个氨基酸组成的多肽，具有促进生长激 素释放、促进摄食、参与能量代谢平衡等多种生理作用，近年来研究表明 ghrelin 也参与动 物生殖的调控。本文通过半定量 RT-PCR 技术研究了 ghrelin mRNA 在苏钟母猪发情周期不同 阶段下丘脑-垂体-卵巢轴的表达，20 头苏钟母猪（体重 75±5 kg）分为 4 个组，即发情前 期组（发情周期的第 19 天）、发情期组（发情周期的第 21 天）、发情后期组（发情周期的第 3 天）和间情期组（发情周期的第 13 天），每组 5 头。结果表明下丘脑、垂体和卵巢 ghrelin mRNA 在母猪发情周期不同阶段都有表达，并且在发情周期不同阶段表达丰度有规律性变化。 下丘脑 ghrelin mRNA 的表达在发情前期水平最高（p < 0.05），发情期最低；在垂体，发 情前期和间情期 mRNA 表达水平明显高于发情期和发情后期（p < 0.01）；而卵巢中 Ghrelin mRNA 表达模式不同于下丘脑和垂体，在发情前期水平最低，然后逐渐升高，在间情期表达 水平最高（p < 0.01）。结果提示 Ghrelin 可能在能量平衡和生殖的内分泌网络调节中发挥 重要作用。 关键词：Ghrelin；下丘脑-垂体-卵巢轴；发情周期；猪
2.2 实验动物的挑选、饲养及取材
从江苏省农业科学院苏钟猪种猪场挑选日龄相近的断奶苏钟仔母猪 20 头，在江苏省农 业科学院苏钟种猪场分栏饲养，按正常程序进行免疫接种，饲喂种母猪的标准日粮，定期观 察动物生长发育情况。到初情期时（约 5～6 月龄）仔细观察并记录每头猪的自然发情情况。 连续观察记录 3 个发情周期，掌握每头猪的发情规律，并配合阴道涂片确定每头猪所处的发 情周期的具体阶段。将 20 头实验猪（体重 75±5 kg）分为 4 个组，即发情前期组（发情周 期的第 19 天）、发情期组（发情周期的第 21 天）、发情后期组（发情周期的第 3 天）和间情 期组（发情周期的第 13 天），每组 5 头。动物放血处死后，用手锯快速打开颅腔，尽量避免 损伤脑，快速采取下丘脑、垂体和两侧卵巢，将下丘脑、垂体和卵巢置液氮中，然后于－70℃ 冰箱保存备用。
图-1 猪发情周期不同时期下丘脑 ghrelin mRNA产物扩增电泳图
Ghrelin. 目的基因片段长度为326bp; GAPDH. 内参扩增片段长度为431bp;Marker. DL2000 DNA marker。
Fig.-1 Amplificated product of ghrelin mRNA in the hypothalamus of pigs in oestrous cycle
2.3.2 RT-PCR 扩增 每个样品取 RNA 2 µg，用 Oligo dT 引物进行反转录，获得各样品RNA的cDNA。 RT 反
应体系为 25 µL，包括 2 µg 总 RNA，0.4 µmol/L Oligo dT 引物， 0.4 mmol/L dNTP，加 ddH2O 至 10 µL，70℃变性 5 min，立即放冰上冷却，再加 8U RNA 酶抑制剂，100 U M-MLV 反转 录酶，5 µL 5×RT buffer（含 250 mmol/L pH 8.3 Tris-HCl，15 mmol/L MgCl2，375 mmol/L KCl，50 mmol/L DTT），补充DEPC处理的灭菌 ddH2O 至 25 µL，37℃反应 60 min，95℃反应 5 min。同时用不加反转录酶的反转录体系作为阴性对照，用于检测总 RNA 样品中是否有基 因组 DNA 污染。反转录产物（RT产物）分装，－20℃保存备用。
5'-ATT CCA CGG CAC AGT CAA-3' GAPDH 5'-CAT CAC GCC ACA GTT TCC-3'
PCR 条件
编号 Number
PCቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ condition
of Genbank
预变性 95 ℃ 5 min，变
性 95℃ 30 s，退火 58℃， 40 s，延伸 72 ℃，30 s 预变性 94 ℃ 5 min，变
1. 引 言
Ghrelin（生长素）是日本国立循环器病中心Kojima等人于 1999 年发现的一种多肽，由 28 个氨基酸组成，为生长激素促分泌素（Growth hormone secretagogue）受体（GHS-R） 天然的内源性配体，能够促进生长激素（growth hormone，GH）释放，故命名为ghrelin 。 [1] Ghrelin及其受体在动物体内广泛分布，具有调节GH分泌、摄食、能量代谢、生殖等多种生 物学作用，已引起人们广泛的关注，成为近年的研究热点[2, 3]。
3

定样品中目的基因 ghrelin mRNA 表达的相对含量。 3.3.4 统计分析
结果以平均数±标准误（Mean ± SE）表示，数据用 SPSS11.0 软件统计，差异显著性 用独立样本ｔ检验和单因子方差分析（ one-way ANOVA, LSD），不同组间两两比较用 LSD 确 定差异显著性。P ＜0.05，表示差异显著；P ＜0.01，表示差异极显著。
2

2.3 半定量 RT-PCR 方法检测样品中 ghrelin mRNA 的表达
2.3.1 总 RNA 提取 利用 Trizol 一步法提取下丘脑、垂体和卵巢总 RNA。每个样品取约 0.1g，加 Trizol
试剂匀浆，按试剂说明书操作方法提取组织总 RNA。然后用变性琼脂糖凝胶电泳鉴定 RNA 的 质量。用核酸蛋白测定仪测定其浓度及纯度，稀释为 1 µg/ µm，分装。RNA 样品放入－70 ℃ 冰箱保存备用。
研究表明在生殖和能量代谢之间存在着重要的相互联系。实验证实禁食可抑制动物促黄 体生成素（LH）的分泌以及延迟动物青春期的启动和繁殖行为，如果解除动物的禁食，动物 则在数分钟到数小时内恢复 LH 的正常脉冲分泌[4, 5]。另一些实验证明，禁食抑制动物LH的 分泌，是因为禁食后GnRH分泌量减少而导致的。如果外部注射GnRH，则LH的分泌恢复正常[6]。 性腺激素也可以通过多种途径影响能量代谢[7]。Ghrelin对动物生长和能量代谢具有重要的 调节作用，近年来的研究表明它参与对生殖的调控。Ghrelin及其受体在动物体内分布非常
3 结果
在猪的整个发情周期中下丘脑-垂体-卵巢轴中都有 ghrelin mRNA 的表达，但它们的表 达模式不一样，下丘脑和垂体的表达规律基本相似，在发情前期 ghrelin mRNA 的丰度最高， 而发情期水平最低；在卵巢中则是不同的表达特点，在发情前期表达丰度最低，然后逐渐升 高，在间情期水平最高。
以3-磷酸甘油醛脱氢酶 （GAPDH）作内源性参照，用混合样品（各待测样品等比例混合） 对PCR反应条件和循环圈数等来进行优化，建立最佳的反应条件和校正不同批次间RT和PCR 效率的差异。PCR 反应体系为25 µL：包括10×PCR buffer 2.5 µL；2.5 mM dNTPs 2 µL； 20 pM上下游引物各1 µL；Taq 酶1.0 U；50 ng cDNA 模板2 µL；加灭菌 dd H2O 补足。反 应所用的引物序列及条件见表-1。目的基因引物在下丘脑、垂体和卵巢的循环圈数分别为34、 31和35圈；内标在下丘脑、垂体和卵巢的循环圈数分别为27、26和28圈。每个样品作2次重 复，同时用灭菌双蒸水和RNA 样品分别取代RT产物作对照，以检验是否有外源和基因组DNA 污染。