细胞培养的设施与基本条件 (2)优秀课件
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细胞培养技术培训ppt课件版
严格执行突发事件上报制度、校外活 动报批 制度等 相关规 章制度 。做到 及时发 现、制 止、汇 报并处 理各类 违纪行 为或突 发事件 。
严格执行突发事件上报制度、校外活 动报批 制度等 相关规 章制度 。做到 及时发 现、制 止、汇 报并处 理各类 违纪行 为或突 发事件 。
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严格执行突发事件上报制度、校外活 动报批 制度等 相关规 章制度 。做到 及时发 现、制 止、汇 报并处 理各类 违纪行 为或突 发事件 。
见的是贴附于平面支持物细胞。在一般光镜下 生存中的细胞是均质而透明的，结构不明显。
细胞在生长期常有1-2个核仁，在细胞机能 状态不良时，细胞轮廓会增强，反差增大。
若胞质中时而出现颗粒、脱滴和腔泡等， 表明细胞代谢不良。
严格执行突发事件上报制度、校外活 动报批 制度等 相关规 章制度 。做到 及时发 现、制 止、汇 报并处 理各类 违纪行 为或突 发事件 。
倒 置 显 微 镜
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严格执行突发事件上报制度、校外活 动报批 制度等 相关规 章制度 。做到 及时发 现、制 止、汇 报并处 理各类 违纪行 为或突 发事件 。
液 氮 罐
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严格执行突发事件上报制度、校外活 动报批 制度等 相关规 章制度 。做到 及时发 现、制 止、汇 报并处 理各类 违纪行 为或突 发事件 。
细胞培养技术课件-PPT
贴壁期（细胞平均在10分钟－4小时贴壁，底物：胶原、玻 璃、塑料、其它细胞等）
潜伏期（有生长活动，而无细胞分裂，一般为6～24小时 对数生长期（细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳。
最适合进行实验研究） 停止期（平台期）（细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不
再分裂。机制：接触抑制、密度依赖性）
（悬浮细胞没有贴壁过程）
注意： 开放式操作，小心谨慎、谨防污染！
细胞冻存（慢冻）
1 细胞冻存液（1ml/管） 基础培养基70％ 胎牛血清20％ DMSO 10％ （二甲基亚砜，一种渗透性保护剂，可迅
速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓 冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞 外形成冰晶，减少胞内冰晶对细胞的损伤。）
（2）用培养液稀释后低速离心10分钟。 （3）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。 （4）隔天换液，但贴壁细胞若未贴壁则勿需处理。 复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶而损伤细胞。
细胞传代
细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上 饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数 量扩大，就必须进行传代（再培养）。
其他实验所需的试剂： 药物（如ATRA）、检测试剂（如MTT）、细胞因子 （如SCF）等
试剂标注规范
试剂名称 配制浓度 配制人 配制日期
NaCl 0.5 mM 张三
耗材
培养皿、瓶、孔板 离心管、移液管 枪尖 其他
小结二 试剂及耗材的分类及用途
培养基（成分、分类）
耗材（分类、用途）
生物安全柜
无菌培养瓶、吸管、离心管的准备 主要用于操作者的皮肤，操作台表面及无菌室内的壁面处理（蛋白凝固）（不能擦拭有机玻璃）
细胞生长过程，细胞来源
湿热（高压蒸气灭菌法）：121℃，20min，破坏微生物孢子、蛋白变性。
潜伏期（有生长活动，而无细胞分裂，一般为6～24小时 对数生长期（细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳。
最适合进行实验研究） 停止期（平台期）（细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不
再分裂。机制：接触抑制、密度依赖性）
（悬浮细胞没有贴壁过程）
注意： 开放式操作，小心谨慎、谨防污染！
细胞冻存（慢冻）
1 细胞冻存液（1ml/管） 基础培养基70％ 胎牛血清20％ DMSO 10％ （二甲基亚砜，一种渗透性保护剂，可迅
速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓 冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞 外形成冰晶，减少胞内冰晶对细胞的损伤。）
（2）用培养液稀释后低速离心10分钟。 （3）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。 （4）隔天换液，但贴壁细胞若未贴壁则勿需处理。 复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶而损伤细胞。
细胞传代
细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上 饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数 量扩大，就必须进行传代（再培养）。
其他实验所需的试剂： 药物（如ATRA）、检测试剂（如MTT）、细胞因子 （如SCF）等
试剂标注规范
试剂名称 配制浓度 配制人 配制日期
NaCl 0.5 mM 张三
耗材
培养皿、瓶、孔板 离心管、移液管 枪尖 其他
小结二 试剂及耗材的分类及用途
培养基（成分、分类）
耗材（分类、用途）
生物安全柜
无菌培养瓶、吸管、离心管的准备 主要用于操作者的皮肤，操作台表面及无菌室内的壁面处理（蛋白凝固）（不能擦拭有机玻璃）
细胞生长过程，细胞来源
湿热（高压蒸气灭菌法）：121℃，20min，破坏微生物孢子、蛋白变性。
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清洗示意图
白箭头：玻璃制品 黑箭头：橡胶制品
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消毒方法
物理消毒法：射线、紫外线、干热、 湿热、过滤、煮沸等
化学消毒法：乳酸、甲醛、过氧乙 酸、新洁尔灭、乙醇等
抗生素灭菌
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二、细胞培养的基本内容
细胞传代培养* 细胞冻存与复苏*
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pH调整液
5.6%NaHCO2 HEPES 1NHCL 10%HAC 1NNaOH
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无菌操作
洗手 着装 近火焰操作 试剂瓶等斜放
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实验前准备
清洗： 玻璃、塑料、橡胶、金属类等 消毒： 无菌室、培养用液、培养器皿 （玻璃、塑料、橡胶、金属）等
新鲜的正常：PH7.2～7.4，桃红色； 培养后，细胞产酸，变黄，需换液；
透明度：清亮透明，混浊多为污染（悬 浮细胞除外）
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培养液短期内变黄：
1、是否有细菌污染； 2、可能培养皿没清洗干净，有残留物； 3、细胞生长太快； 4、细胞接种量过大。
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细胞的生长状态
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微生物污染
传代或换液后24h～48h可观察到； 细菌、真菌污染的典型表现：培养液混浊，液 体内漂浮有菌丝或细菌； 支原体污染：不明显，细胞生长明显变缓，胞 质内颗粒增多，有中毒表现，但培养液多不发 生混浊。
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培养基分类
美国模式培养物集存库 ATCC https:///
• DMEM（高糖，葡萄糖4500 mg/L ）：成纤维、 上皮细胞（293），一些实体瘤（Panc-1），原 代神经元
• DMEM（低糖，葡萄糖1000 mg/L ）：间充质 干细胞，单抗细胞融合
• RPMI 1640： 血液细胞（HL60）、一些实体瘤 细胞（BT474）
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3
一 实验设备
超净工作台，生物安全柜 CO2培养箱 倒置显微镜 离心机 电热恒温水槽 液氮罐 纯水仪 压力蒸汽消毒器 电热干燥箱
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4
超净台
生物安全柜
酒精灯（√），离开要熄灭 ！
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酒精灯（×）
5
CO2培养箱
CO2培养箱设定的条件为 37℃，5％CO2 。
灭菌的方法： -紫外线（超净台、生物安全柜） -高压蒸汽灭菌（准备好放在准备室502） -75%酒精（表面消毒，小心酒精灯明火）
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四 细胞培养
生长类型 细胞来源 细胞复苏 细胞传代
细胞冻存 细胞计数 活力测定 污染种类
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细胞的生长类型
粘附型细胞：附着在某一固相支持物表面才能生长的细胞。 （绝大多数正常细胞及实体瘤细胞）
3 贴壁细胞传代 采用酶消化法传代。常用的0.25％的胰酶。
吸掉上清，加入PBS缓冲液洗涤，弃掉洗液，加入适 量胰酶消化液，37℃消化1分钟左右，加入含血清的培养 基终止消化，并离心去上清，重新稀释后接种。
注意： 开放式操作，小心谨慎、谨防污染！
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细胞培养室的设置、设备和准备工作 PPT课件
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2. 高温湿热灭菌:压力蒸汽灭菌是最常用的高温湿热灭菌 方法。对生物材料有良好的穿透力，能造成蛋白质变性凝 固而使微生物死亡。布类、物、璃器皿、属器皿、胶和某 些培养液都可以用这方法灭菌。 不同压力蒸汽所达到的温度不同，不同消毒物品所需的有 效消毒压力和时间不同。从压力蒸汽消毒器中取出消毒好 的物品（不包括液体），应立即放到60-70℃烤箱内烘干， 再贮存备用，否则，潮湿的包装物品表面容易为微生物污 染。煮沸消毒也是常用的湿热消毒方法，它具有条件简单、 使用方便等特点。
滤 器
8
储藏区
储存区要求是取放物品方便。主要存放各类冰箱﹑ 干燥箱﹑液氮罐﹑ 无菌培养液﹑培养瓶等，此环境也 需要清洁﹑无尘。
9
清洗和消毒灭菌区
清洗和消毒灭菌区应与其他区域分开，主要进行 所有细胞培养器皿的清洗﹑ 准备﹑ 消毒及三蒸水制 备等工作。
10
1.1.2 细胞培养实验室的设备
常用的基本设备 较高级的特殊设备
33
二、包装
对细胞培养用品进行消毒前，要进行严密 包装，以便于消毒和贮存。常用的包装材料： 牛皮纸、硫酸纸、棉布、铝饭盒、较大培养皿 等，近几年用铝箔包装，非常方便，适用。培 养皿、注射器、金属器械等用牛皮纸包装后再 装入饭盒内，较大的器皿可以进行局部包扎。
34
三、消毒和灭菌
微生物污染是造成细胞培养失败的 主要原因。
24
培养用品的清洗
一、清洗 离体条件下，有害物质直接同细胞接 触，细胞对任何有害物质十分敏感，极少 残留物都可以对细胞产生毒副作用。因此 ，新的或重新使用的器皿都必须认真清洗 ，达到不含任何残留物的要求。
25
（一）玻璃器皿的清洗 一般经过浸泡、刷洗、 浸酸、和清洗四个步骤。
2. 高温湿热灭菌:压力蒸汽灭菌是最常用的高温湿热灭菌 方法。对生物材料有良好的穿透力，能造成蛋白质变性凝 固而使微生物死亡。布类、物、璃器皿、属器皿、胶和某 些培养液都可以用这方法灭菌。 不同压力蒸汽所达到的温度不同，不同消毒物品所需的有 效消毒压力和时间不同。从压力蒸汽消毒器中取出消毒好 的物品（不包括液体），应立即放到60-70℃烤箱内烘干， 再贮存备用，否则，潮湿的包装物品表面容易为微生物污 染。煮沸消毒也是常用的湿热消毒方法，它具有条件简单、 使用方便等特点。
滤 器
8
储藏区
储存区要求是取放物品方便。主要存放各类冰箱﹑ 干燥箱﹑液氮罐﹑ 无菌培养液﹑培养瓶等，此环境也 需要清洁﹑无尘。
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清洗和消毒灭菌区
清洗和消毒灭菌区应与其他区域分开，主要进行 所有细胞培养器皿的清洗﹑ 准备﹑ 消毒及三蒸水制 备等工作。
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1.1.2 细胞培养实验室的设备
常用的基本设备 较高级的特殊设备
33
二、包装
对细胞培养用品进行消毒前，要进行严密 包装，以便于消毒和贮存。常用的包装材料： 牛皮纸、硫酸纸、棉布、铝饭盒、较大培养皿 等，近几年用铝箔包装，非常方便，适用。培 养皿、注射器、金属器械等用牛皮纸包装后再 装入饭盒内，较大的器皿可以进行局部包扎。
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三、消毒和灭菌
微生物污染是造成细胞培养失败的 主要原因。
24
培养用品的清洗
一、清洗 离体条件下，有害物质直接同细胞接 触，细胞对任何有害物质十分敏感，极少 残留物都可以对细胞产生毒副作用。因此 ，新的或重新使用的器皿都必须认真清洗 ，达到不含任何残留物的要求。
25
（一）玻璃器皿的清洗 一般经过浸泡、刷洗、 浸酸、和清洗四个步骤。
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1.4 无菌操作室
无菌操作室主要用于实验材料的接种操作，所以又叫接种室。通 常由里外两间组成，外间是缓冲间，用于准备工作，还有防止污染的 作用。缓冲间的门应该与接种室的门错开，两个门也不要同时开启， 以保证无菌室不因开门和人的进出带进杂菌。缓冲间内应该设有水槽、 实验台、鞋帽架、柜子、紫外灯。无菌操作室的内壁应当用塑钢板或 瓷砖装修，工作人员进入操作间前要穿上消过毒的工作服和拖鞋。
离心机、酶联免疫检测仪、天平、PCR仪等
显微镜
PCR 酶标仪
2.2 温室
为试管苗提供满足生长的适宜环境条件。
1.2 常用仪器与设备
基本设备：水纯化装置、 冰箱、天平、酸度计、电炉、培养基分 装器、搅拌器、离心机及离心管、移液器（管）、吸管等。
灭菌设备： 蒸汽压力灭菌锅、电热干燥箱、过滤除菌装置、喷雾 消毒器、紫外灯。
天平
移液器
pH计
1.3 消毒间
用于培养细胞所用器械、培养基的消毒与灭菌。 配备实验台、高压灭菌锅、排风灭火设备、细菌过滤设备、干燥箱、 消毒柜、电炉等。灭菌锅的选择应根据不同的要求选择不同型号的灭菌 锅。一般实验室可选用小型的医用手提式高压灭菌锅，较大的实验室可 选用立式自动控制压力和温度的灭菌锅。生产性的实验室可选用大型的 卧式灭菌锅。 如果没有条件的话，可以将上述工作间合并成一个准备间，要求设 备的安装和排列要合理、房间要宽敞、明亮、透风，地面要便于清洁、 防滑。
向对侧，形成气流屏障以保持工作区无菌；在净化气流和外边气
作
体交界处可因气流的流动出现负压，使少许未净化气体混入，有
台
发生污染的可能性
外流式（或水平层流式）超净工作台：使净化后的空气面向操作
者流动，外方气流不致混入操作区；不能进行有害物质实验操作；
因多为开放式，没有防护挡板，操作和拿取物品方便，但可能受
室内应配有超净工作台、紫外灯、酒精灯、解剖镜、各种接种器 械等。
离心机
超净工作台
1.5 培养室
为了控制培养室的温度和光照，培养室的房间不要窗户，但应当 留一个通气窗，并安上排气扇。天花板和内墙最好用塑料钢板装修， 地面用水磨石或瓷砖铺设，一般要分两间，一为光照培养室，一为暗 培养室。培养室外应有一预备间或走廊。室内温度由空调控制，光照 时间及其强度由日光灯和自动定时开关控制。
还应配置落水架、干燥箱、超声波清洗器、纯水制备等。 地面应耐湿并 机
机
电
热
纯
干
水
燥
仪
箱
1.2 制备室
主要用于有关培养用液体、培养基母液和培养基的配制等。 面积60 m2左右，配备的主要仪器设备有：冰箱、实验台、药品柜、 器械柜、天平、微波炉、pH计、玻璃棒、烧杯、磁力搅拌器、培养基 分装器、抽气泵、电炉、各种规格的培养瓶、培养皿、移液管（器）、 烧杯、量筒、容量瓶、储藏瓶等。冰箱以体积180~200 L为宜，用于储 存培养基母液、激素、维生素等贵重药品、彩色胶卷及保存植物材料。 天平应有不同感量。
外界气流流动的影响而引起不洁空气混入。
用于细胞培养中的有些器械、器皿烘干使用、玻璃器皿干燥消毒
温度范围：50~300℃
实验室常用：鼓风式电热干燥箱
电 优点：温度均匀、效果较好；
缺点：升温过程较慢
无菌操作设备： 超净工作台 光温控制设备： 时间程序控制器、空调及温度感应器。
细胞培养设备： 培养设备根据需要而定，包括培养架、培养箱、 摇床、生物反应器等。
细胞学鉴定设备： 光学显微镜、实体显微镜、倒置显微镜等。 除上述基本设备外，如果有条件和需要还可配制摄影设备、生
化分析设备等。 培养器皿及实验用具：玻璃器皿、新型材料器皿及金属材质用
具
基本原理：将室内空气经粗过滤器初滤，由离心风机压入静压箱， 再经高效空气过滤器精滤，由此送出的洁净气流以一定的、均匀 的断面风速通过无菌区，形成无尘无菌的高洁净度工作环境。
超 侧流式（或垂直式）超净工作台：净化后的空气气流由左侧（或
净
右侧）通过工作台面流向对侧，也有从上向下（或从下向上）流
工
为了最大限度的创造既适合于细胞生长又可防治污染的环 境，在培养过程中对细胞培养的设施、操作规程和检测方 法等制定了严格的规范要求。
细胞工程实验室与其他一般实验室的主要区别在 于，要求保持严格无菌环境，避免微生物及其他 有害因子的影响。
一般来讲，它应能进行六方面的工作：无菌操作、 培养、制备、清洗、消毒灭菌处理和储藏。
细胞培养的设施与 基本条件
预防培养细胞受到污染是细胞培养成功 与否的关键
为什么？生物体内的细胞可以通过机体的代谢、调节和保 护等机制而使其营养、环境、生长条件、抵抗有害因子能 力等方面处于最佳状况。而体外培养的细胞由于失去了对 整体的依赖性，对实验室细胞培养的设施条件和人员素质 提出了较高的要求。
1.1 细胞工程实验室的设置
动物细胞工程实验室的设置
一般来讲，它应能进行六方面的工作：无菌操作、 培养、制备、清洗、消毒灭菌处理和储藏。各区最好 分别设置于相连的各个房间，特别是无菌操作室最好 能单独设置。如安排在一大实验室内，则无菌操作区 与清洗、消毒灭菌区应分别位于两端，而培养、制备 和储藏区位于此两区之间。
培养室应配有若干培养架，上面固定日光灯、转床、摇床、光照 培养箱、生化培养箱、自动控时器等。
2、辅助实验室
细胞学鉴定室
2.1 鉴定室
其功能是对培养材料进行细胞学鉴定和研究。要求清洁、明亮、 干燥，使各种光学仪器不受潮湿和灰尘污染。
应配置各种显微镜、照相系统等
生化分析室
在以培养细胞产物为主要目的实验室中，应建立相应的生化分 析实验室，以便于对培养物的有效成分随时进行取样检查。
植物细胞工程实验室的设置
有其特殊的设置，如具有光照条件的培 养室，试管苗培育所需的温室和移植驯化室 等。
基本实验室
1.1 清洗间
根据工作量的大小决定其大小，一般面积控制在30~50 m2。在实 验室的一侧设置专用的洗涤水槽，用来清洗玻璃器皿、用具和培养材 料等。中央实验台还应配置2个水槽，用于清洗小型玻璃器皿。如果工 作量大，可以购置一台洗瓶机。准备1~2个洗液缸，专门用于洗涤对洁 净度要求很高的玻璃器皿。