酶工程2

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酶工程 (2)

第二章1.六大类酶基本概念和特点（1）氧化还原酶：催化氧化还原反应，需要电子供体或受体（2）转移酶：催化基团转移反应，即将一个底物分子的基团或原子转移到另一个底物的分子上（3）水解酶：催化底物的加水分解反应（4）裂合酶：脱去底物上某一基团留下双键，或可相反地在双键外加入某一基团。

（5）异构酶：催化生成异构体反应的酶，分别进行外消旋，差向异构，顺反异构，醛酮异构，分子内转移，分子内裂解等（6）连接酶：需要三磷酸腺苷等高能磷酸酯作为结合能源，有的还需要金属离子辅助因子。

应用最多的是氧化还原酶，利用率最高的是水解酶2.必需基团及其作用特点必需基团包括：（1）活性部位，包括结合基团和催化基团（2）维持酶空间结构的基团必需基团是酶分子氨基酸残基侧链的化学基团中，一些与酶活性密切相关的基团。

必需基团在空间结构上相互靠近，组成具有特定空间结构的区域，能与底物特异性结合并将其转化为产物3.两种酶与底物的结合模型（1）锁钥模型：底物结合部位由酶分子表面的凹槽或空穴组成，这是酶的活性中心，它的形状与底物分子形状互补。

底物分子或其一部分像钥匙一样，可专一地插入酶活性中心，通过多个结合位点的结合，形成酶—底物复合物，同时酶活性中心的催化基团正好对准底物的有关敏感键，进行催化反应。

三点结合学说指出，底物分子与酶活性中心的基团必须三点都互补匹配，酶才作用于这个底物。

（2）诱导锲合模型：酶分子与底物分子接近时，酶蛋白质受底物分子诱导，构象发生有利于与底物结合的变化，酶与底物在此基础上互补楔合，进行反应。

4.影响酶催化作用的五种模型（1）广义的酸碱催化能供给质子的物质即为酸，能接受质子的物质即为碱。

广义的酸碱催化就是指组成酶活性中心的极性基团，在底物的变化中起质子的供体或受体的作用，这就是广义的酸碱催化。

发生在细胞内的许多类型的有机反应都是广义的酸碱催化。

组氨酸的咪唑基值得特别注意，因为它既是一个很强的亲核基团，又是一个有效的广义酸碱功能基团。

酶学及酶工程课2章3节14

本次课结束下次课再见！
Thank you！
邻近效应和定向效应
底物之间及底物对活性部位的邻近和定向增加了有序性，减小了自由度，从而降低了系统的熵，而增加了系统的自由能。双分子反应两个底物在结合部位定向结合并彼此靠近，比溶液中发生反应的可能性高得多，相当于大大提高了反应物浓度。所有酶反应底物和酶之间都有反应所需的相互作用，定向和邻近使反应加快。底物结合时墒减少所需要的自由能由底物结合时放能提供。
2. 有机辅基
生物素可共价结合羧基。它通过酰胺键和蛋白质的赖氨酸侧链氨基结合，形成生物素羧基载体蛋白。（BCCP）
乙酰辅酶A羧化酶
因BCCP能和羧基键合，在羧化反应中起重要作用。如乙酰辅酶A羧化酶。
磷酸泛酰巯基乙胺
泛酰巯基乙胺可通过磷酸二酯键和蛋白质的丝氨酸羟基结合，形成酰基携带蛋白（ACP）。ACP在脂肪酸代谢反应中起着重要作用。这些辅基通过共价键和酶结合，实际上已成为酶的一个组成部分。
1. 金属辅因子
已知酶中大约有三分之一以上需要金属离子。含金属辅基的称为金属酶。有些酶和金属离子结合不紧密，纯化时失去金属离子，但需加入金属离子才有活性，称为金属激活酶。此时金属离子应是金属辅酶。金属离子参与酶的催化作用的方式有多种： 1）接受或提供电子，或做为亲电剂或亲核剂, 或激活亲电剂或亲核剂； 2）通过配位键结合底物，并引起底物形变； 3）保持反应基团的三维取向，稳定酶活性部位于活性构象。
——R.Pan et al. JBC,2010；
该酶活性部位含有荧光基团。测定表明该酶与Th或Ch底物结合后内源荧光有较大变化，但和U底物结合后变化不大。用低浓度胍扰动该酶活性部位也造成荧光变化，但结合过Th或Ch底物后再用胍扰动荧光变化不大了。用蚯蚓蛋白酶II、枯草杆菌蛋白酶、乳酸脱氢酶也能得到类似的结果。表明这些酶活性部位有较大构象变化后会维持该构象,再作用按锁钥模型,形成先诱导契合再锁钥的机制。有无普遍性还需证明。

第2章第五节酶工程制药技术基础

⒊化学合成法采用合成仪进行酶的化学合成和人工合成改造。化学合成成本高。只能合成化学结构清楚的酶。应用在酶的化学修饰和人工模拟方面。
三、药用酶的修饰
酶的分子修饰：通过各种方法使酶分子的结构发生改变，从而改变酶的某些特性和功能的技术过程。酶的变化：①提高生物学活性 ②增强稳定性 ③降低生物识别能力
第五节酶工程制药技术基础
一、概述
酶工程是酶学和工程学相互渗透结合、发展而成的生物技术，是通过人工操作获得人们所需的酶，并通过各种方法使酶发挥其催化功能的技术。酶工程制药包括药用酶的生产和酶法制药。药用酶是指具有治疗和预防疾病作用的酶。酶法制药是在一定条件下利用酶的催化作用，将底物转化为药物的技术过程。
酶修饰主要方法
⑴侧链集团的化学修饰巯基的化学修饰
烷基化试剂：碘乙酸和碘乙酰胺，在发生羧甲基化，防止半胱氨酸的降解。 N-乙基马来酰亚胺：专一性强并伴随光吸收的变化，可以通过光吸收的变化确定反应的程度 5，5-二硫-2-硝基苯甲酸（DTNB) DTNB可以与巯基反应形成二硫键同时释放一个TNB 阴离子，可以通过光吸收监测反应的程度
修饰后，可导致蛋白质活性丧失，需要去除。去除时用强
碱进行处理。
⑵交联修饰
利用双功能试剂可以将不同的蛋白质连接在一起。
常用的方法是将双功能的接头与两个蛋白质分子
中的赖氨酸残基侧链相连接。
⑶定点突变与化学修饰结合法基因突变技术是通过在基因水平上对其编码的蛋白质分子进行改造，在其表达后用来研究蛋白质结构功能的一种方法。根据其特点，基因突变分为两类：定点突变区域定向突变
⒉酶的固定化方法
⑴吸附法物理吸附和离子交换吸附。条件温和，酶的构象变化小，酶与载体之间结合力弱，易脱落。 ⑵包埋法载体与酶溶液混合后，借助引发剂进行聚合反应，通过物理作用将酶固定在载体的网格中。不涉及酶的构象以及酶分子的化学变化，反应条件温和，酶的回收率高。扩散限制，催化反应受影响。

酶与酶工程--碳酸酐酶及其研究进展 2

碳酸酐酶及其研究进展碳酸酐酶( carbonic anhydrase, CA)是一种锌酶。

在哺乳动物中, 几乎所有的组织都可检测到CA。

CA至少有14种同工酶[1] , 其结构、动力学性质、对抑制剂的敏感性、组织内的分布以及亚细胞的定位都有不同,它能参与机体气体运输、酸碱调节和组织的分泌等功能, 在维持内环境的稳定方面发挥着重要作用。

1933年，人们已从血液中提取出了碳酸酐酶，直到1940年才在动物红细胞研究中确定碳酸酐酶含有锌。

它是红细胞中仅次于血红蛋白的蛋白质组分。

人和动物血液中的碳酸酐酶相对分子量约30KDa，由单一肽链组成，每个分子含一个Zn(II)离子，酶蛋白约含260个氨基酸残基，其中脯氨酸含量最高，没有二硫键。

碳酸酐酶有多种同工酶，它们不仅选择性识别HCO2-和CO2作为催化底物和产物，也不规律地识别磷酸酯|羧酸酯|醛类等分子[2]。

.1、CA的分布根据碳酸酐酶氨基酸序列的不同, 人们主要将其分为α、β、γ、δ、ε五种不同类型的酶。

其中α-CAs存在于脊椎动物、细菌、藻类及绿色植物的胞浆中；β-CAs 存在于高等植物及藻类叶绿体中, 对植物光合作用过程中CO2 的获取及CO2 浓度的维持有着必不可少的作用; γ-CAs则主要存在于太古细菌及一些细菌中；δ-CAs主要存在于海洋硅藻中；ε-CAs是近年来才确定的类型, 主要存在于蓝细菌及一些化能自养型细菌中。

多年来人们对碳酸酐酶的研究主要集中在与人类关系密切的α-CAs和β-CAs上。

α-CAs 在氨基酸序列上存在20~60% 的同源性, 哺乳动物的几乎所有组织中都含有参与机体多种生命活动的α-CAs。

目前的研究表明，α-CAs 至少存在14 种不同的同工酶：CAI III，CA VII 及CA XIII为胞浆酶；CA IV，CA IX，CA XII和CA XIV为膜连接酶；CA V为线粒体酶；CA VI则存在于唾液中；另外还有3 种已知的非催化形式的碳酸酐酶相关蛋白( CA Related Protein，CARP)—CARP VIII，CARPX及CARPXI [3]。

酶学及酶工程课2章5节14

凝血过程
2.通过可逆改变共价结构的活性调节
控制糖原代谢途径的磷酸化酶的活性调节： b需依赖AMP才有活性，a不需依赖AMP即有活性。由激酶和磷酸酶催化相互转换。
生理意义特点
由于此类调节方式是酶催化的，活性酶数量能迅速发生变化，造成起始信号被迅速放大。可逆共价活性调节方式中酶的活性形式和非活性形式为连续互变状态，对生物代谢环境的变化可以随时应答，比不可逆共价活性调节更具灵活性。
第二章酶的结构与功能
第五节酶的活性调控及变构（别构）效应
一、酶活性调节的多样性
生命过程表现了它内部变化历程的有序性。这种有序性是受多方面因素调节和控制的，酶活性的调节控制又是各种生命现象调节控制的主要方式之一。任何不受控制的过程对生命都是灾难性的。通过反馈机制对过程进行有效的调节控制，对任何生命以及类似的事物都是必须的，这是不以人的意志为转移的客观规律。酶活性的调节控制有多种方式。
3. 共价修饰调节
这种调节方式是通过酶催化进行的。 1）在一种酶分子上，通过其它酶催化共价地引入一个基团，从而改变它的活性。引入的基团还可以被第三种酶催化除去，再改变活性。例如，磷酸化酶的磷酸化和去磷酸化；大肠杆菌谷氨酰胺合成酶的腺苷酸化和去腺苷酸化就是以这种方式调节它们的活性。
2）限制性蛋白酶水解是另一种高特异性的共价修饰调节系统。生物体内有些新生蛋白是以无活性的前体形式存在的，生理需要时通过限制性水解作用使前体转变为具有生物活性的蛋白质或酶，如消化蛋白酶酶原激活、血液凝固等。
二、通过酶催化的共价修饰调节
1.通过不可逆改变共价结构的活性调节。 1）消化蛋白酶的酶原激活酶原激活是非活化的酶原被特异的蛋白酶限制性水解，切去某段肽或断开某个肽键而转变为活性的酶。如消化蛋白酶无活性的酶原在小肠里被其他蛋白水解酶限制性地切去一个小肽，而活化成为有活性的消化蛋白酶。

酶工程-07-酶非水相催化2

（2）具有良好的化学稳定性，对设备没有腐蚀性。
（3）超临界温度不能太高或太低，最好在室温附近或在酶催化的最适温度附近。（4）超临界压力不能太高，可节约压缩动力费用。
（5）容易获得，价格要便宜。
4
第七章酶非水相催化
第一节酶非水相催化的主要内容和特点
二、
根据所用非水介质的不同，分为四种：
酶
非
水相催化的主要内容
中（的四酶）催离化子
液介质
概念：是指酶在离子液介质中进行的催化作用。
5
第七章酶非水相催化
第一节酶非水相催化的主要内容和特点
三
1、酶的热稳定性提高。
、
2、酶的催化活性有所降低。
酶
非
3、水解酶可以在非水介质中催化水解反应的逆反应。
水
相
4、非极性底物或者产物的溶解度增加。
酶催
催化化反反应应都的要体在系一主定要的有反
非
水有机介质反应体系
介质反
（研究最多，应用最广泛）
应
体超临界流体介质反
系应体系
与水溶性有机溶剂组成的均一体系
与水溶性有机溶剂组成的两相或多相体系
（正）胶束体系
：
应体
离子液介质反应体系
反胶束体系
7
第七章酶非水相催化
第二节有机介质中水和有机溶剂对酶催化反应的影响（一）微水介质体系
KLD L
D
Km Kcat
立体选择系数 L-型异构体 D-型异构体米氏常数酶的转换数
酶在有机介质与在水溶液中催化比较,
影
由于介质的特性发生改变,使酶的对映体选

酶工程2-2 常用的产酶微生物

3. 红曲霉(Monascus)
• 红曲霉: 菌落初期白色, 老熟后变为淡粉色、紫红色或灰黑色,通常形成红色色素。菌丝具有隔膜, 多核, 分支甚繁。分生孢子着生在菌丝及其分支的顶端, 单生或成链, 闭囊壳球形, 有柄, 其内散生10 多个子囊, 子囊球形, 内含8 个子囊孢子, 成熟后子囊壁解体, 孢子则留在闭囊壳内。
细菌
1. 大肠杆菌( Escherichia coli)
• 形态：呈杆状, 有的近似球状, 大小为0. 5μm ×1～3 μm , 一般无荚膜, 无芽孢, 运动或不运动, 运动者周生鞭毛。菌落从白色到黄白色, 光滑闪光, 扩展。
• 革兰氏染色阴性。 • 产生的酶一般都属于胞内酶, 需要经过细胞破碎才能分离得到。 • 采用大肠杆菌生产的限制性核酸内切酶、D N A 聚合酶、 D N A 连接酶、核酸外切酶等, 在基因工程等方面广泛应用。
• 枯草杆菌是应用最广泛的产酶微生物, 可以用于生产α-淀粉酶、蛋白酶、β-葡聚糖酶、5′-核苷酸酶和碱性磷酸酶等。例如,枯草杆菌BF7658 是国内用于生产α-淀粉酶的主要菌株;枯草杆菌AS1.398用于生产中性蛋白酶和碱性磷酸酶。 • 枯草杆菌生产的α-淀粉酶和蛋白酶等都是胞外酶, 而其产生的碱性磷酸酶存在于细胞间质之中。
霉菌
1. 黑曲霉( Aspergillus niger)
• 是曲霉属黑曲霉群霉菌。
• 菌丝体由具有横隔的分支菌丝构成, 菌丛黑褐色, 顶囊大球形, 小梗双层, 分生孢子球形, 平滑或粗糙。 • 黑曲酶可用于生产多种酶, 有胞外酶也有胞内酶。例如, 糖化酶、α-淀粉酶、酸性蛋白酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶、核糖核酸酶、脂肪酶、纤维素酶、橙皮苷酶和柚苷酶等。

酶工程各章试题

酶工程第一章测试试题卷一填空每空1分,共20分1.1878年,____首次将酵母中酒精发酵的物质称为酶.2.1913年,Michaelis 和Menten根据中间产物学说,推导出酶催化反应的基本动力学方程----米氏方程,可用公式表示为_______.3.1982年Thomas Cech等人发现四膜虫的rRNA可以在没有蛋白质存在的情况下自身催化切除内含子,完成加工过程.这一具有催化活性的RNA的发现改变了传统的酶的化学本质是____________的概念;4.对同一种酶可同时采用系统命名和_____命名两种方法.5.乳酸脱氢酶可标识为1.1.1,其中EC代表_________.6.催化L-谷氨酸 D—谷氨酸的酶属于________酶.7.核酸类酶的基本组成单位是_________.8.酶的有机辅助因子在催化过程中起_______________的作用.9.在酶的二级结构β—片状折叠中,________式结构更稳定.10.酶的绝对专一性又称为___________专一性.11.PH对酶的影响主要是影响到了氨基酸的________状态.12.在测酶活力时,为了使酶反应速度不受底物浓度底限制,反应系统应使用足够高的底物浓度,一般要求:__________.13.酶分离纯化整个工作包括三个基本环节:抽取纯化和________.14.工业应用的三大酶制剂是蛋白酶 ________和脂肪酶.15 核酸类酶催化反应的类型,可以将R-酶分为三类:剪切酶,剪接酶和________酶.16、具有不同分子形式但却催化相同反应的酶称为__________.17、每毫克蛋白或RNA中所具有的酶活力数称为酶的_______.用u/mg表示.18、酶制剂可分为液体酶制剂,固体酶制剂,纯酶制剂和_______酶制剂.二. 选择题每题2分,共10分1.谷氨酸脱氢酶可有以下四种底物,由Km推断它的最适底物是 .A. 谷氨酸Km=B. α-酮戊二酸Km=C. NAD氧化形 Km=D. NAD 还原形 Km=2. D EA B CF G图示抑制模式属于:A累积反馈抑制Ｂ无分支途径中酶活性反馈抑制C 顺序反馈抑制D 协调反馈抑制3．有两种蛋白酶样品,A样品32mg,酶活力单位数为样品52mg ,酶活力单位数为190U,则两样品纯度为:A A >B B. A < B C. A = B D. 不能断定.4．某酶四种底物的Km 如下,与酶亲和力最大的底物是:A ×10-2B × 10-1C ×10-2D ×10-65．从世界范围看,酶制剂在哪一行业中的应用占比例最高A 淀粉业B 乳制品C 洗涤剂业D 制酒业三. 名词解释每题3分,共12分1.调节酶2.别构效应3.固定化酶四. 判断题每题1分,共7分2.1/Km越大,酶与底物亲和力越大.3.酶的最适温度是一个固定不变的常数,其数值不受底物的种类.作用时间而改变.4.盐析法分离蛋白质时,应将溶液PH调至蛋白质等电点附近.5.酶浓度越高,酶结晶越大.6.调节酶就是别构酶.7.大肠杆菌丙酮酸脱氢酶是多酶复合体.五. 说明题共6分1.图示并说明竞争性抑制和非竞争性抑制的区别.6分六. 简答题共21分1.简介酶分子中氨基酸残基种类及作用.8分2请比较说明吸附层析、离子交换层析、凝胶层析、亲和层析的原理.8分3、固定化酶的制备原则是什么5分酶工程第一章测试参考答案一填空每空1分,共18分1.库尼 =vmaxS/Km+S 3.酶是具有生物催化功能的蛋白质.4.习惯5.国际酶学委员会6.异构酶7.核糖核苷酸8.传递电子原子和基团的作用.9.反平行10.立体异构11.解离 12.S>5Km 13.制剂. 14淀粉酶 15多功能酶16同工酶 17酶的比活力.18固定化酶制剂二. 选择题每题3分,共15分. 4D三. 名词解释每题5分,共15分1.调节酶: 在代谢途径和物质转化体系中起调节作用的关键酶.2.别构效应:一种化合物与酶的活性中心以外的部位结合,引起酶的构象发生变化的现象.3.固定化酶:在一定空间内呈闭锁状态存在的酶,能连续地进行反应,反应后酶可以回收重复使用.四. 判断题每题2分,共14分1.正确2.错误3. 正确4. 错误5. 错误6. 正确7. 正确五、图示说明题共12分2.图示并说明竞争性抑制和非竞争性抑制的区别.6分竞争性抑制剂结构往往与正常底物非常相似,从而与底物竞争酶分子上同一个结合部位活性中心,阻止底物和酶的结合.因而酶不能与抑制剂和底物同时结合.ESI复合物缺乏反应活性基团不能继续分解成产物,形成死端复合物.图4分,解释2分不论底物分子是否与酶结合, 非竞争性抑制剂都能与酶分子结合产生死端复合物. 非竞争性抑制剂与活性中心以外的基团结合,其结构肯与底物分子毫无相关之处,两者没有竞争作用,但ESI不能进一步分解成产物. 图4分,解释2分七. 简答题共26分1.请比较说明吸附层析、离子交换层析、凝胶层析、亲和层析分离酶的原理.16分1维持酶的催化活性和专一性.2应有利于生产自动化.连续化.3与载体牢固结合4载体不与底物.产物和反应物发生化学反应.5成本要低,利于工业使用.第二、三章酶的生物合成法生产测试题填空题1、SOD是_________酶,具有____________________的功效;2、依据在体外培养时对生长基质依赖性差异,动物细胞可分为两类：__________、______________;3、动物细胞培养的PH应控制在______________；温度控制在_______,允许波动_______;判断题谷草芽孢杆菌是应用最广泛的产酶微生物;√大多数产酶微生物采用淀粉或其水解产物为碳源,植物细胞一般以蔗糖为碳源;√植物细胞培养要求的氮源一般为有机氮源;×动物细胞培养主要用于各种功能蛋白质的生产;√动物细胞传代培养时可以用胃蛋白酶分散细胞;×简答题：1、固定化原生质体产酶有何特点2、植物细胞培养产酶的工艺流程3、酶的生物合成有哪几种模式各有何特点P36-384、影响酶生物合成的主要因素有哪些结合酶的生物合成模式,分析说明怎样提高产酶效率;P39答案：填空题1、抗辐射、抗氧化、抗衰老2、贴壁依赖型细胞,非贴壁依赖型细胞3、－微碱性,℃ ,允许波动范围在＋－℃简答题1、1、变胞内产物为胞外产物固定化黑曲霉原生质体生产葡萄糖氧化酶,使细胞内葡萄糖氧化酶的90％以上分泌到细胞外;2、提高产酶率固定化枯草芽孢杆菌原生质体生产碱性磷酸酶,使原来存在于细胞间质中的碱性磷酸酶全部分泌到发酵液中,产酶率提高36％;3、稳定性好4、易于分离纯化2、外植体诱导愈伤组织细胞培养分离纯化酶第四章酶的提取与分离纯化测试题填空题1、酶在结晶之前,酶液必须经过纯化达到一定的纯度;通常酶的纯度应当在_______以上,方能进行结晶;2、酶结晶的主要方法有：________、________、________、________;3、酶的剂型有：_____、______、________和固定化酶制剂；通常用作分析试剂或用作医疗药物的酶制剂要求是___________ ;4、注射用的医用酶应设法除去____________;判断题1、一般采用稀盐溶液进行酶的提取,盐的浓度一般控制在～ mol／L ;√2、常用硫酸铵盐析沉淀酶蛋白;√3、盐析沉淀酶蛋白时,溶液的pH值应调节到远离酶的等电点;×4、等电点结晶是通过缓慢改变浓酶液的pH值,使之逐渐远离酶的等电点,而使酶析出结晶的过程;×名词解释：1、选择性变性沉淀法2、酶的提取3、亲和层析简答题：1、酶的分离纯化工作的基本原则2、举例说明细胞破碎的几种方法及原理;3、稳定酶的方法有哪些答案：填空题1、50％;2、盐析结晶法、有机溶剂结晶法、透析平衡结晶法、等电点结晶法;3、固体酶制剂、液体酶制剂、纯酶制剂、固定化酶制剂；纯酶制剂;4、热源物质名词解释1、选择性变性沉淀法：选择一定的条件使酶液中存在的某些杂蛋白等杂质变性沉淀,而不影响所需的酶,这种分离方法称为选择性变性沉淀法2、酶的提取是指在一定的条件下,用适当的溶剂处理含酶原料,使酶充分溶解到溶剂中的过程,也称为酶的抽提;3、亲和层析是利用生物分子与配基之间所具有的专一而又可逆的亲和力,使酶等生物分子分离纯化的技术;简答题1、1、防止酶变性失效凡用于预防蛋白质变性失效的方法与措施都应考虑用于酶的分离纯化;A、除少数例外外,所有操作都必须在低温条件下进行,特别是在有机溶剂存在的情况下更应小心;B、大多数酶在PH<4或PH>10的情况下稳定,应控制整个系统不要过酸、过碱,同时要避免在调整PH时局部过酸或过碱;C、重金属能使酶失效,有机溶剂能使酶变性,微生物污染以及蛋白酶的存在都能使酶分解破坏,所有这些都应周全考虑;可以加入蛋白酶抑止剂,杀菌剂,稳定蛋白质构象和酶活性的还原剂;2、酶活性测定贯串纯化过程的始终也就是说,从原理开始,整个过程的每一步都要进行比活力与总活力的检测与比较,以便知道每一步骤中可采用什么方法与什么条件,分别使酶的纯度提高了多少,回收了多少酶,从而决定其取舍;3、选择有效的纯化方法凡用于蛋白质纯化的一切方法同样适用于酶;应根据目的酶的物理、化学性质选取;4、原料来源要方便,成本要低1、添加底物、抑止剂和辅酶2、添加－SH保护剂如谷胱甘肽、二巯基乙醇3、低温0－4℃4、添加某些低分子无机离子 Ca2＋保护淀粉酶,Mn2+能稳定溶菌酶,CL－能稳定透明质酸酶等5、固体酶制剂稳定性高可保存数月或几年以上；热敏性酶多用冷冻干燥法,例如注射用酶等;6、固定化酶也是提高酶的稳定性的好方法;第四章酶的提取与分离纯化测试题填空题1、酶在结晶之前,酶液必须经过纯化达到一定的纯度;通常酶的纯度应当在_______以上,方能进行结晶;2、酶结晶的主要方法有：________、________、________、________;3、酶的剂型有：_____、______、________和固定化酶制剂；通常用作分析试剂或用作医疗药物的酶制剂要求是___________ ;4、注射用的医用酶应设法除去____________;判断题1、一般采用稀盐溶液进行酶的提取,盐的浓度一般控制在～ mol／L ;√2、常用硫酸铵盐析沉淀酶蛋白;√3、盐析沉淀酶蛋白时,溶液的pH值应调节到远离酶的等电点;×4、等电点结晶是通过缓慢改变浓酶液的pH值,使之逐渐远离酶的等电点,而使酶析出结晶的过程;×名词解释：1、选择性变性沉淀法2、酶的提取3、亲和层析简答题：1、酶的分离纯化工作的基本原则2、举例说明细胞破碎的几种方法及原理;3、稳定酶的方法有哪些答案：填空题1、50％;2、盐析结晶法、有机溶剂结晶法、透析平衡结晶法、等电点结晶法;3、固体酶制剂、液体酶制剂、纯酶制剂、固定化酶制剂；纯酶制剂;4、热源物质名词解释1、选择性变性沉淀法：选择一定的条件使酶液中存在的某些杂蛋白等杂质变性沉淀,而不影响所需的酶,这种分离方法称为选择性变性沉淀法2、酶的提取是指在一定的条件下,用适当的溶剂处理含酶原料,使酶充分溶解到溶剂中的过程,也称为酶的抽提;3、亲和层析是利用生物分子与配基之间所具有的专一而又可逆的亲和力,使酶等生物分子分离纯化的技术;简答题1、1、防止酶变性失效凡用于预防蛋白质变性失效的方法与措施都应考虑用于酶的分离纯化;A、除少数例外外,所有操作都必须在低温条件下进行,特别是在有机溶剂存在的情况下更应小心;B、大多数酶在PH<4或PH>10的情况下稳定,应控制整个系统不要过酸、过碱,同时要避免在调整PH时局部过酸或过碱;C、重金属能使酶失效,有机溶剂能使酶变性,微生物污染以及蛋白酶的存在都能使酶分解破坏,所有这些都应周全考虑;可以加入蛋白酶抑止剂,杀菌剂,稳定蛋白质构象和酶活性的还原剂;2、酶活性测定贯串纯化过程的始终也就是说,从原理开始,整个过程的每一步都要进行比活力与总活力的检测与比较,以便知道每一步骤中可采用什么方法与什么条件,分别使酶的纯度提高了多少,回收了多少酶,从而决定其取舍;3、选择有效的纯化方法凡用于蛋白质纯化的一切方法同样适用于酶;应根据目的酶的物理、化学性质选取;4、原料来源要方便,成本要低1、添加底物、抑止剂和辅酶2、添加－SH保护剂如谷胱甘肽、二巯基乙醇3、低温0－4℃4、添加某些低分子无机离子 Ca2＋保护淀粉酶,Mn2+能稳定溶菌酶,CL－能稳定透明质酸酶等5、固体酶制剂稳定性高可保存数月或几年以上；热敏性酶多用冷冻干燥法,例如注射用酶等;6、固定化酶也是提高酶的稳定性的好方法;第五章酶分子的修饰与应用测试题填空题1、酶分子修饰的意义是：_____________,______________,_________;名词解释1、酶分子修饰通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变,从而改变酶的某些特性和功能的过程称为酶分子修饰;2、金属离子置换修饰3、酶分子的物理修饰简答题：1、什么是酶分子的侧链修饰酶分子侧链修饰有何意义2、请举例说明酶分子修饰的应用答案填空题：1、提高酶的活力；增强酶的稳定性；降低或消除酶的抗原性;名词解释1、酶分子修饰：通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变,从而改变酶的某些特性和功能的过程称为酶分子修饰;2、把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子,使酶的功能和特性发生改变的修饰方法称为金属离子置换修饰;3、通过各种物理方法使酶分子的空间构象发生某些改变,从而改变酶的某些特性和功能的方法称为酶分子的物理修饰;简答题1、采用一定的方法一般为化学法使酶的侧链基团发生改变,从而酶分子的特性和功能的修饰方法称为侧链基团修饰;意义：1、通过酶分子侧链基团修饰,可以研究各种基团在酶分子中的作用及其对酶的结构、特性和功能的影响,并可以用于研究酶的活性中心的必须基团;如果某基团修饰后不引起酶活力的显着变化,则可以认为此基团属于非必须基团;2、通过酶分子侧链基团修饰,可以测定某一种基团在酶分子中的数量,例如,采用三硝基苯磺酸测定氨基的数量；用对汞苯甲酸测定巯基的数量；用碳二亚胺测定羧基的数量；用四唑重氮盐测定咪唑基的数量等;3、酶分子侧链基团修饰,在酶工程方面可以提高酶的活力、增加酶的稳定性、降低酶的抗原性,并且可以引起酶催化特性和催化功能的改变,以提高酶的使用价值;4、酶分子侧链基团修饰,还可以获得自然界原来不存在的新酶种,例如,某些抗体酶和人工改造的核酸类酶;第六章酶、细胞、原生质体固定化与应用测试题填空题1、固定化酶的制备方法主要有：______、_______、________、_________;2、交联法常用的双功能试剂是：_____________;判断题1、酶经固定化后,其作用的最适pH值往往会发生一些变化;√2、固定化酶的最适作用温度与游离酶相比没有变化;×3、一般来说,用带负电荷的载体制备的固定化酶,其最适pH值比游离酶的最适pH值为高即向碱性一侧移动；用带正电荷载体制备的固定化酶的最适pH值比游离酶的最适PH为低即向酸性一侧移动√4、一般说来,催化反应的产物为酸性时,固定化酶的最适pH值要比游高酶的最适PH低一些；产物为碱性时,固定化酶的最适pH值要比游离酶的最适pH值高一些;×5、固定化酶的底物特异性变化与底物分子量的大小有一定关系;√名词解释1、交联法2、载体活化3、固定化细胞;简答题1、什么是固定化酶有何显着优点2、请举例说明固定化酶、细胞、原生质体技术的应用答案填空题1、吸附法、包埋法、结合法、交联法和热处理法等;名词解释1、交联法：借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用,制成网状结构的固定化酶的方法称为交联法;2、载体活化：要使载体与酶形成共价键对酶进行固定化,必须首先使载体活化,即借助于某种方法,在载体上引进一活泼基团;然后此活泼基团再与酶分子上的某一基团反应,形成共价键;3、固定在载体上并在一定的空间范围内进行生命活动的细胞称为固定化细胞;简答题1、什么是固定化酶有何显着优点固定化酶是指固定在一定载体上并在一定的空间范围内进行催化反应的酶;固定化酶既保持了酶的催化特性,又克服了游离酶的不足之处,具有增加稳定性、可反复或连续使用以及易于和反应产物分开等显着优点;2、略第七章酶非水相催化测试题判断题1、有机溶剂往往会使酶变性失活,因此只有在水溶液中酶才有催化活性;2、在有机介质中,由于酶分子活性中心的结合部位与底物之间的结合状态发生某些变化,致使酶的底物特异性发生改变;3、许多酶在有机介质中的热稳定性比在水溶液中的热稳定性更好;4、目前世界上化学合成药物中的40％左右属于手性药物;在这些手性药物中,大多数仍然以外消旋体形式使用;5、常用的消炎解热镇痛药萘普生Neproxen的两种对映体中,S +-萘普生的疗效是R-－-萘普生疗效的28倍;6、镇静剂反应停的S-构型有镇静作用,R-构型也有镇静作用,但疗效甚微;7、一些消旋体药物可以在有机介质体系中用酶法进行拆分,获得单一对映体;名词解释1、酶的对映体选择性2、手性化合物第八章酶定向进化复习题一、填空题：酶基因随机突变的方法有：________、____________、_________;二、名词解释：酶定向进化易错PCR技术三、简答题：1．酶定向进化的特点2.酶随机突变的三种方法是什么请解释并比较分析;3.举例说明酶定向进化技术的应用;第九章酶反应器复习题P240复习题1、2、5第十章 1 酶在医药方面的应用测试题一、填空题1、指示肝功能异常的常用酶有：____、______、_______;2、_________酶可以检测癌细胞;3、治疗消化不良、食欲不振的酶有：______、______、________;4、具有抗癌作用的酶有：______、______、_______、__________;5、_________酶可以治疗各种出血;6、_____________酶可以治疗龋齿;7、___________酶可以溶血栓;8、____________酶可以治疗白血病;9、____________酶用于制造抗肿瘤人参皂苷;10、___________酶可用于制造人胰岛素;二、判断题1、乳酸脱氢酶广泛存在于各种组织以及红细胞中,在正常情况下,血清中乳酸脱氢酶的含量很低,但是在肝癌、急性肝炎、心肌梗塞等疾病的患者血清中,该酶活力显着升高;√2、蛋白酶可用于治疗多种疾病,是在临床上使用最早、用途最广的药用酶之一,它可作为消化剂、消炎剂并可用于治疗高血压;√三、请写出以下药品的酶法生产反应式6－氨基青霉烷酸6-APA多巴四、分析说明题1、请分析说明尿糖试纸检测尿糖的原理2、绘图并说明血液透析装置及装置中酶法除去尿素的原理;3、举两例分析说明酶在药物制造方面的应用价值;4、请分析说明溶菌酶的应用价值5、请分析说明SOD的应用价值答案填空题1、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、胆碱酯酶2、端粒酶3、淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶4、L-精氨酸酶、L-组氨酸酶、L－蛋氨酸酶、谷氨酰胺酶5、凝血酶6、右旋糖酐酶7、溶纤酶8、L- 天冬酰胺酶9、β－D－葡萄糖苷酶 10、无色杆菌蛋白酶请写出以下药品的酶法生产反应式1、6－氨基青霉烷酸6-APA青霉素青霉素酰化酶 6－氨基青霉烷酸6-APA2、多巴酪氨酸β－酪氨酸酶多巴邻苯二酚＋丙酮酸＋氨β－酪氨酸酶多巴分析说明题4、溶菌酶主要从蛋清、植物和微生物中分离得到;作用机理：溶菌酶作用于细菌的细胞壁,可使病原菌、腐败性细菌等溶解消灭,对抗生素有耐药性的细菌同样起溶菌作用,具有显着疗效而对人体的副作用很小,是一种较为理想的药用酶;应用价值：临床上主要用于治疗各种炎症,溶菌酶与抗生素联合使用,可显着提高抗生素的疗效,常用于难治的感染病症的治疗；还可用于食品保鲜；在护肤品中添加可以消除皮肤表面黏附的细菌,起到杀菌消炎的作用;5、SOD即超氧化物歧化酶,具有抗氧化、抗衰老、抗辐射的功效,添加到护肤品中可以有效防治紫外线对人体的伤害,消除自由基的影响,减少色素沉着;在医疗领域,用于预防辐射损伤,治疗红斑狼疮,皮肌炎,结肠炎,氧中毒;第十章2 酶在食品方面的应用测试题填空题1、_______酶和__________酶可用于食品保鲜;2、______________酶可将蔗糖原料中的棉子糖分解成蔗糖与半乳糖,提高蔗糖的收得率;3、果胶酶pectinase是催化果胶质分解的一类酶的总称,主要包括______和___________;4、_________酶可用于呈味核苷酸的酶法生产;判断题1、糊精是淀粉低程度水解的产物,广泛应用于食品增稠剂、填充剂和吸收剂;√2、写出以下产品酶法生产的反应式1、L－氨基酸的生产2、低乳糖奶的生产3、L-苹果酸的生产4、天苯肽的酶法生产写出以下工艺过程酶法处理的反应式1、柑橘制品脱苦处理2、果蔬制品的脱色简答题1、请分析说明果葡糖浆生产的工艺流程及条件控制2、请分析说明右旋糖酐酶的应用价值3、请分析说明酶在啤酒发酵生产中的应用答案填空题1、葡萄糖氧化酶,溶菌酶2、蜜二糖酶α－半乳糖苷酶3、果胶酯酶PE,聚半乳糖醛酸酶PG4、5,磷酸二酯酶写出以下产品酶法生产的反应式1、L－氨基酸的生产N－酰基DL－氨基酸氨基酰化酶 L－氨基酸蛋白质蛋白酶 L－氨基酸延胡索酸＋氨天冬氨酸酶 L－天冬氨酸α－酮戊二酸＋NH3＋NADPH谷氨酸脱氢酶 L－谷氨酸+H2O＋NADP+a-酮戊二酸+L-氨基酸转氨酶 L-谷氨酸+α-酮酸2、低乳糖奶的生产乳糖乳糖酶β半乳糖苷酶半乳糖＋葡萄糖3、L-苹果酸的生产延胡索酸＋水延胡索酸酶 L－苹果酸4、天苯肽的酶法生产L-Asp +L-Phe-Ome嗜热菌蛋白酶L-Asp-L-Phe-OmeL-天冬氨酸 L-苯丙氨酸甲酯天苯肽写出以下工艺过程酶法处理的反应式1、柑橘制品脱苦处理柚苷柚配质－7－芸香糖苷柚苷酶β－鼠李糖苷酶鼠李糖＋无苦味的普鲁宁柚配质一7一葡萄糖苷2、果蔬制品的脱色花青素花青素酶β－葡萄糖和它的配基简答题1、请分析说明果葡糖浆生产的工艺流程及条件控制工艺流程：淀粉浆a-淀粉酶,Ca2＋,80～90℃液化液糖化酶葡萄糖DE>96％层析去Ca2＋,pH值为6．5～7．0,加入0．01 mol／L的硫酸镁,在60～70℃的温度条件下,葡萄糖异构酶果葡糖浆;控制条件：1、钙离子对a-淀粉酶有保护作用,在淀粉液化时需要添加,但它对葡萄糖异构酶却有抑制作用,所以葡萄糖溶液需用层析等方法精制;2、控制PH3、控制温度葡萄糖转化为果糖的异构化反应是吸热反应;随着反应温度的升高,反应平衡向有利于生成糖的方向变化,异构化反应的温度越高,平衡时混合糖液中果糖的含量也越高;但当温度超过70℃时,葡萄糖异构酶容易变性失活,所以异构化反应的温度以60～70℃为宜;2、请分析说明右旋糖酐酶的应用价值制糖设备中存在大分子黏性葡聚糖,堵塞管道,妨碍设备清洗及蔗糖的结晶;用右旋糖酐酶内切α－1,6－葡聚糖酶处理,可使右旋糖酐分解为异麦芽糖与异麦芽三糖,黏度迅速下降;右旋糖酐酶还可用于防龋;3、请分析说明酶在啤酒发酵生产中的应用在啤酒酿造过程中,制浆和调理两个阶段是要使用酶制剂的1、浸泡麦芽浆时,温度约65℃,有利于蛋白酶,β－葡聚糖酶,α－淀粉酶,发挥作用,使麦芽中的多糖及蛋百类物质降解为酵母可利用的合适的营养物质;2、加啤酒花前,煮沸麦芽汁使上述酶失活;在发酵完毕后,啤酒需要加一些酶处理,以使其口味和外观更易于为消费者接受;蛋白酶降解使啤酒混浊的蛋白质成分,防止啤酒的冷混浊,延长啤酒的储存期;糖化酶能够降解啤酒中的残留糊精,一方面保证了啤酒中最高的乙醇含量,另一方面不必添加浓糖液来增加啤酒的糖度;这种低糖度的啤酒糖尿病患者也可以饮用;第十章 3 酶在其他领域的应用测试题填空题1、造纸业的主要用酶有：___________和___________;2、________酶可以水解RNA,生产四种5,核苷酸;3、生丝脱胶和羊毛除垢可以用____________酶;4、利用__________酶检测有机磷农药污染5、利用_________酶的同工酶监测重金属污染6、通过___________监测大肠杆菌污染名词解释：酶标记免疫反应检测请分析说明蛋白酶在轻工、化工业中的应用;加酶洗涤剂应该满足什么条件加酶洗涤剂有何优势酶法检测必须具备什么条件答案填空题1、木质素酶,木聚糖酶2、5,-磷酸二酯酶3、蛋白酶4、胆碱酯酶5、乳酸脱氢酶6、β-葡聚糖苷酸酶名词解释：酶标记免疫反应检测是将酶的检测技术与免疫检测技术相结合,用于测定样品液中抗体。

酶工程2-1 微生物发酵产酶

IF1
30S起始复合物
fMet-tRNA正好位于mRNA的起始密码子上（AUG）。
3.大小亚基结合
原核生物

原核生物肽链合成的起始阶段是在GTP 和起始因子(initiation factor) 的参与下, 核糖体30S 亚基、f M et-tR N AF 、m R N A 和50S 亚基结合, 组成起始复合物的过程,主要包括5 个步骤:
Met + tRNAF + ATP 氨酰-tRNA 合成酶 Met-tRNAF + AMP + PPi
Met-tRNAF
甲酰转移酶
f Met-tRNAF
2. 肽链合成的起始阶段
1.mRNA与小亚基结合：形成30S-mRNA-IF3复合物
2.AUG与蛋氨酰-tRNA结合：
30S-mRNA-IF3
fMet-tRNA-IF2-GTP
氨酰-tRNA合成酶
氨酰-tRNA+AMP+PPi
活化反应实际上分两步完成

第一步, 氨基酸活化生成氨酰腺苷酸酶复合物。 AA + ATP + E → E-AA-AMP + PPi 第二步, 氨酰基转移到tR N A 3′端的羟基上, 生成氨酰tR N A , 同时使酶游离出来。 E-AA-AMP + tRNA → AA-tRNA + E + AMP 氨酰-tRNA合成酶还具有催化氨酰-tRNA水解脱酰基作用: 氨酰-tRNA合成酶 AA-tRNA AA + tRNA 校正功能：保证蛋白质合成的真实性

固定化微生物细胞发酵(20 世纪70 年代后期)

固定化细胞: 指固定在水不溶性的载体上, 在一定的空间范围内进行生命活动(生长、繁殖和新陈代谢等) 的细胞。

2015酶工程第2章酶的生产和纯化

Chapter 2 The production & Purification of Enzyme
酶的生产和纯化
2016/5/19
1
合适的酶源？一级生物？
筛选新酶源有机体中转入新基因
足够酶产量？细胞是否稳定？
传统/基因技术提高产量改进发酵条件
易于后处理？成本高低？纯化能否成功？
改进后处理：减少费用和浪费；提高纯度
2016/5/19
更具竞争力、更廉价的目标酶 2
Contents of chapter 2
2.1 酶源 2.2 酶的生产及提高酶产量的措施 2.3 酶的下游处理
Go
Go
Go
2016/5/19
3
2.1 酶源
2016/5/19
4
Enzyme source
88%
动植物组织
动植物细胞
野生微生物
重组微生物
2016/5/19
14
青霉属（Penicillium）

腐生真菌，存在于空气中及腐烂的物质表面主要菌种和酶的种类产黄青霉（Penicillium chrysogenum）葡萄糖氧化酶、纤维素酶、果胶酶、青霉素酰化酶等橘青霉（Penicillium citrinum）脂肪酶、葡萄糖氧化酶、5’-磷酸二酯酶、核酸酶等
2016/5/19 葡萄糖耗尽后才利用乳糖，两个对数生长期
80
60
细胞浓度(OD)
40
20
0
0
2
4
6
时间(h)
42
8
a. 酶的诱导：乳糖操纵子启
调节基因 R 动操纵子基因 P O LacZ
乳糖结构基因

食品专业_酶工程复习资料 (2)

酶工程复习资料名词解释酶(enzyme)：酶是由活细胞产生的，在细胞内、外一定条件下都能起催化作用的具有高效率和高度专一性的一类特殊蛋白质。

酶工程(enzyme engineering)：酶工程是酶学与工程学相互渗透、结合并发展而形成的一门新的技术科学，是一门从应用的目的出发研究酶、应用酶的特异性催化功能，并通过工程化将相应的原料转化为有用物质的技术。

固定化酶(immobilized enzyme)：通过物理或化学的手段，将酶固载在某种基体上。

酶活力（又称酶活性） (enzyme activity)（IU/g 或IU/mL)指酶催化一定化学反应的能力；用在一定条件下，所催化的反应初速度来表示；是研究酶的特性，酶制剂生产应用以及分离纯化时的一项必不可少的指标。

酶活力单位：表示酶活力大小的尺度；一个国际单位（IU ）是指在特定条件下（25 0C ），每分钟内转化1μmol 底物或催化形成1μmol 产物所需的酶量一个Kat(卡塔尔，酶活性国际单位)是指每秒钟内转化1mol 底物所需的酶量，1 Kat = 6⨯107 IU 。

酶的比活力：酶的比活力是酶纯度的量度，是指单位重量酶蛋白所具有的酶活力，单位为IU/mg 。

比活力越大，酶纯度越高。

）酶蛋白质量（）酶活力单位数（比活力mg U =酶的抽提：指在一定的条件下，用适当的溶剂处理含酶原料，使酶充分融入溶剂的过程。

膜分离技术：借助于一定孔径的高分子薄膜，将不同大小、不同形状和不同特性的物质颗粒或分子进行分离的技术称为膜分离技术。

离子交换层析：利用离子交换剂上的可解离基团（活性基团）对各种离子的亲和力不同而达到分离目的。

凝胶层析：以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中所含各种组分的相对分子质量不同而达到物质分离。

凝胶电泳——以聚丙烯酰胺为支持物，兼有分子筛效应。

用于分离不同物理性质（如大小、形状、等电点等）的分子。

酶的结晶：是使溶质呈晶态从溶液中析出的过程，是酶和蛋白质等生物大分子分离纯化的方法之一酶的回收率和提纯倍数:纯化倍数是纯化后的比活除以纯化前的比活。

酶工程重点 (2)

酶的改性：通过各种方法改进酶的催化特性的技术过程，主要包括酶分子修饰、酶固定化、酶非水相催化和酶定向进化等。

非竞争性抑制（noncompetitive inhhibition）：指抑制剂与底物分别与酶分子上的不同位点结合而引起酶活性降低的抑制作用反竞争性抑制（uncompetitiv inhibition）：在底物与酶分子结合生成中间复合物后，抑制剂再与中间复合物结合而引起的抑制作用裂合酶（iyases）：催化一个化合物裂解成两个较小的化合物及其逆反应的酶摩尔催化活性（molar catalytic activity）：指每个酶分子每分钟催化底物转化的分子数分子印记（molecular imprinting）：是制备对某一特定分子（印记分子）具有选择性的聚合物的过程基因扩增（gene amplification）：通过增加基因的数量来调节基因的表达的一种方式。

大分子结合修饰（macro molecules combine modifiaction）：采用水溶性大分子与酶的侧链基团共价结合，使美分子的空间构象发生改变，从而改变酶的催化特性的方法侧链基团修饰（side residuse modification）：采用一定的方法使酶的侧链基团发生改变，从而改变酶的催化特性的修饰方法肽链有限水修饰（peptide chain limit hydrolysis modification）：在肽链的限定位点进行水解，使酶的空间结构发生某些精细的改变，从而改变酶的催化特性的方法酶的非水相催化（enzyme non-aqueous catalysis）：酶在非水介质中的催化作用无性进化（asexual evolution）：易错PCR技术所引起的基因突变和遗传进化仅在单一分子内发生DNA重排技术：又称为DNA改组技术，是从正突变基因文库中分离的到的同源DNA，用酶切割成随机片段，经过不加引物的多次PCR循环，使DNA的碱基序列重新排布而引起基因突变的技术过程随机引物体外重组技术（random-priming in vitro recombination RPR）:采用单链DNA 为模版，配合若干条随即序列的引物进行PCR反应，产生若干个与模板不同部分的序列互补的DNA小片段，然后除去模板，这些DNA小片段互为模板和引物进行扩增，通过碱基序列的重新排布而获得全长突变基因基因家族重排（geng family shuffing）又称为基因家族改组技术，是从基因家族的若干同源出发，用酶切割成随机片段，经过不加引物的多次PCR循环，使DNA的碱基序列发生重新排布而引起基因突变的技术过程氧化还原酶（oxidoreductases）：催化氧化还原反应的酶转移酶（transferases）：催化某基团从供体化合物转移到受体化合物上的酶自我剪切酶（self-cleavage ribozyme）:催化本身RNA进行剪切反应的R酶自我剪接酶（self-splicing ribozyme）:在一定条件下催化本身RNA分子同时进行剪切和连接的R酶组成型酶（constitutive enzyme）:在细胞中的含量比较恒定，环境因素对其合成速率影响不大的酶，如DNA聚合酶，RNA聚合酶，糖酵解途径的各种酶等适应型酶（adaptive enzyme）或称调节型酶(regulated enzyme)：在细胞中含量变化很大，合成速率明显受环境因素影响的酶阻遏物（repressor）：引起反馈阻遏作用的物质端粒（telomere）:真核生物染色体的末端结构，是由富含G和T的DNA简单重复序列不断重复而成端粒酶（telomerase）:催化端粒合成和延长的酶增强子（modulator）：又称为调变子，是一段能高效增强或促进基因转录的DNA序列P66抗体酶（abzyme）:又称为催化性抗体，是一类具有生物催化功能的抗体分子原生质体（protoplast）:除去细胞壁后得到的微球体刺激剂（elector）:可以促使植物细胞中的物质代谢朝着生成某些次级代谢物的方向进行，从而强化次级代谢物的生物合成，提高某些次级代谢物的主率的一种刺激物质层析聚集（chromatofocusing）:将酶等两性物质的等电点特性与离子交换层析的特性结合在一起，实现组分分离的层析技术定点突变（site directed mutagenesis）:在DNA序列中的某一特定位点上进行碱基的改变从而获得突变基因的操作技术PCR技术(polymer rase chain reaction),即聚合酶链反应技术，是在DNA聚合酶的作用下进行体外DNA扩增的一种分子生物学技术，该技术的基本过程包括双链DNA的热变性（解链），引物与单链DNA的退火结合，引物的延伸3个步骤酶的固定化（enzyme immobilization）:采用各种方法，将酶固定在水不溶性的载体上，制备成固定化酶的过程固定化酶（immobilized enzyme）:固定在载体上并在一定的空间范围内进行催化反应的酶必需水（essential water）:维持酶分子完整的空间构象所必需的最低水量水活度（water activity）:是指体系中水的逸度与纯水逸度之比。

酶工程2-4 酶发酵动力学

生长偶联型
dE X dt
部分生长偶联型非生长偶联型
dE X X dt
dE X dt
第五节固定化微生物细胞发酵产酶

固定化细胞又称为固定化活细胞或固定化增殖细胞, 是指采用各种方法固定在载体上, 在一定的空间范围进行生长、繁殖和新陈代谢的细胞。
固定化细胞是在20 世纪70 年代后期才发展起来的技术。

固定化微生物细胞发酵产酶自1978 年开始研究以来, 取得可喜进展。
一、固定化细胞发酵产酶的特点

1. 提高产酶率
细胞经过固定化后, 在一定的空间范围内生长繁殖, 细胞密度增大, 因而使生化反应加速, 从而提高酶产率。
2. 可以反复使用或连续使用较长时间

固定化细胞固定在载体上, 不容易脱落流失, 所以固定化细胞可以进行半连续发酵, 反复使用多次;
在连续全混流反应器的发酵过程中，不断流加培养液并不断地排出同体积发酵液。在稳态时，游离细胞连续发酵的生长动力学方程可表达为：
D —— 稀释率,是指单位时间内,流加的培养液与发酵容器中发酵液体积之比,一般以h-1为单位。
稀释率可以在0 与μm 之间变动

当D = 0 的时候, 为分批发酵; 当D <μ时, d X/ d t 为正值, 表明发酵液中细胞浓度不断增加, 随着细胞浓度增加, 限制性基质的浓度相对降低, 使比生长速率减小, 在比生长速率降低到与稀释速率相等的时候, 重新达到稳态; 当D =μ时, d X/ d t 为0, 发酵液中细胞浓度保持恒定不变; 当D >μ时, d X/ d t 为负值, 发酵液中的细胞浓度不断降低, 随着细胞浓度降低, 限制性基质的浓度相对升高, 使比生长速率增大, 在比生长速率提升到与稀释率相同时, 建立新的平衡, 重新达到稳态; 而当D >μm 时, 细胞浓度趋向于零, 无法达到新的稳态。

酶工程第二章酶动力学第一节酶促反应动力学

1913年前后，米彻利斯（Michaelis）和曼吞（Menten）在前人工作的基础上，通过大量的定量研究，提出了酶促动力学基本原理，并推导出了著名的米-曼氏方程，推导过程如下：
根据上述反应式，中间产物ES的生成速度(底物S的消失速度)
v1＝k1[S][E]－k2[ES]
（2-1）
而ES的消失速度(产物P的生成速度) v2＝k3 [ES]，当反应达到平衡时，即v1＝v2时
第一节酶促反应动力学
对许多酶的性质的观察和研究得知，在低的底物浓度[S]下，反应速度（v）直接与底物浓度[S]成正比；在高底物浓度[S]下，速度趋向于最大值（Vmax），此时反应速度与底物浓度[S]无关（如图2-1）。
图2-1 单底物酶促反应的反应速度与底物浓度的关系
第一节酶促反应动力学
图2-5 乒乓反应机理实际上，多底物酶促反应动力学是非常复杂的，以上只是作以简要介绍，有关详细内容，可查阅相关专著。
将米氏方程改写成以下形式
以对作图，绘出曲线，横轴截距即为－值，纵轴截距则是（图2-2）。
第一节酶促反应动力学
图2-2 双倒数作图
第一节酶促反应动力学
二、多底物动力学通常情况下，酶催化反应涉及两个(少数情况下三个)底物。现在我们考虑一个涉及两种底物和两种产物的酶促反应物反应。现在已知的生化反应中有六成以上属于这一种反应。双底物反应的机理有下面三种可能：
第一节酶促反应动力学
1.有序反应机理(ordered reaction) 这种情况下，A和B分别可被说成是先导底物和后随底物，Q 是A的产物，最后被释放。A和Q竞争同游离酶E结合，但A和B则不会（或者Q和B也不会）发生竞争（如图2-3）。依赖烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD＋或NADP＋）的脱氢酶的反应就属于这种类型。

酶工程名词解释（2）

酶工程名词解释（2）酶工程名词解释化学破碎：各种化学试剂对细胞膜的作用使细胞破碎酶促破碎：通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏在一定的温度和pH值条件下（β为常数），通过改变离子强度使不同的酶或蛋白质分离的方法称为Ks分段盐析；在一定的盐和离子强度的条件下（KsI为常数），通过改变温度和pH值，使不同的酶或蛋白质分离的方法，称为β分段盐析。

离心分离：借助于离心机旋转所产生的离心力，使不同大小、不同密度的`物质分离的技术。

过滤：在压力(或真空)的情况下将悬浮液通过过滤介质使达到固—液分离的目的。

（1）滤浆（料浆）—悬浮液（2）过滤介质—多孔物质（3 ）滤饼（滤渣）—被截留的固体物质（4）滤液（母液）—通过过滤介质的液体层析分离：固定相：一个相为固定的；流动相：流过此固定相，并使各组分以不同速度移动。

利用混合物中各组分的物理化学性质的差别，使各组分以不同程度分布在两个相中，电泳：带电粒子在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移动的过程称为电泳萃取：利用物质在两相中的溶解度不同而使其分离。

超临界萃取：利用欲分离物质与杂质在超临界流体中的溶解度不同而分离。

反胶束萃取：利用反胶束将酶从混合液中萃取出来。

真空干燥：可密闭的干燥器与真空装置相连，一边抽真空一边加热，使酶在较低的温度下蒸发干燥。

冷冻干燥：先将浓酶液降温到冰点以下，使之冻结成固态，然后在低温下抽真空，使冰直接升华为气体，使酶干燥。

喷雾干燥：将酶液通过喷雾装置喷成直径为几十微米的雾滴，分散于热气流之中，水分迅速蒸发而使酶成为粉末状。

气流干燥：常压下利用热空气流直接与固体或半固体状态的制品接触，水分蒸发而得到干燥制品。

吸附干燥：在密闭的容器中用干燥剂吸收溶剂，使制品干燥。

结晶：溶质以晶体形式从溶液中析出的过程。

第四章固定化酶与固定化细胞固定化酶：通过物理的或化学的手段，将酶束缚于水不溶的载体上（或在一定的空间内），但能使酶充分发挥催化作用，并能反复、连续使用的酶。