雨生红球藻提取虾青素不同机械破壁方法的研究

毕业论文雨生红球藻的培养及其虾青素的提取、稳定性和应用研究

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厦门大学
硕士学位论文
雨生红球藻的培养及其虾青素的提取、稳定性和应用研究
姓名:***
申请学位级别:硕士
专业:海洋化学
指导教师***
20080901
雨生红球藻的培养及其虾青素的提取、稳定性和应用研究
作者:黄水英
学位授予单位:厦门大学
1.期刊论文庄惠如.陈必链.王明兹.卢海声.施巧琴.ZHUANG Hui-Ru.CHEN Bi-Lian.WANG Ming-Zi.LU Hai-Sheng.
SHI Qiao-Qin雨生红球藻混合营养与异养培养研究-微生物学通报2000,27(3)
研究雨生红球藻混合营养生长与异养生长对碳源及碳源浓度的需求,并对两种生长型进行比较.结果表明,乙酸钠较葡萄糖等其他碳源更能维持红球藻进行混合营养生长与异养生长.红球藻混合营养型生长与异养型生长的适宜乙酸钠浓度范围分别是0.5~1.0g/L和1~1.5g/L.混合营养型及异养型的平均生长速率分别是0.72d-1和0.53d-1,培养8d的细胞干重分别是0.65g/L和0.32g/L.与光养型(对照)相比,混养型的各种生长指标均明显提高,异养型则下降.

不同有机溶剂对雨生红球藻中虾青素提取成分的影响_李婷

34海洋科学/ 2012年/第36卷/第7期不同有机溶剂对雨生红球藻中虾青素提取成分的影响李婷1, 2, 韩丽君1, 袁毅1(1. 中国科学院海洋研究所, 山东青岛 266071; 2. 中国科学院研究生院, 北京 100049)摘要: 研究了有机溶剂提取雨生红球藻中虾青素过程中, 不同液料比对提取效率的影响, 并以分光光度法及高效液相色谱法(HPLC), 检测了不同有机溶剂对提取组分及主要组分(叶绿素和虾青素)含量的影响。

结果显示, 提取率随着液料比的增加而上升, 当液料比大于20:1时, 其升高变缓, 趋于平衡; 不同有机溶剂提取物的化学组分无明显差异, 但各组分含量的比例差异较大, 如二氯甲烷提取物在480 nm 下吸光度为30.64±0.54, 高于丙酮、乙酸乙酯及甲醇(分别为27.68±5.54、25.32±8.43及24.31±0.79), 而645和663 nm 下吸光度为2.54±0.46和5.33±0.19, 较丙酮、三氯甲烷、无水乙醇及甲醇(分别为5.70±0.71、12.87±0.14、7.60±0.23及6.44±0.28)低, 说明该种溶剂对于虾青素有较高的提取效率, 但其挥发性强且毒性大, 而无水乙醇的提取率略低于二氯甲烷, 具有安全、低毒的优势, 因此无水乙醇是较为合适的虾青素提取溶剂。

关键词: 虾青素; 雨生红球藻(Haematococcus pluvialis ); 溶剂类型; 分光光度法; HPLC 中图分类号: P745 文献标识码: A 文章编号: 1000-3096(2012)07-0034-05虾青素(astaxanthin, 3, 3' -二羟基-4, 4 -二酮基-β, β' -胡萝卜素), 是水产动物体内最主要的类胡萝卜素之一。

雨生红球藻中虾青素的提取和稳定性研究

雨生红球藻中虾青素的提取和稳定性研究目的以雨生红球藻为原料，研究有机溶剂提取虾青素的条件及其稳定性。

方法通过试验选取乙酸乙酯、丙酮、二氯甲烷、无水乙醇和二氯甲烷∶丙酮（2∶1）为提取溶剂，研究不同提取溶剂对虾青素提取效果的影响；应用试验得到的最佳溶剂分别于20、30、40、50、60、70、80℃下提取虾青素，确定最佳提取温度；在所得到的最适温度和溶剂下分别提取1、1.5、2、2.5、3 h确定最佳提取时间；设定提取次數分别为1、2、3次，提取后测定其OD480，研究提取次数对虾青素提取效果的影响；采用上述实验中优选出的提取溶剂、温度和时间，料液比分别取1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25，1∶30、1∶35、1∶40，提取完成后测定其OD480，考察不同料液比对总虾青素提取率的影响。

测定虾青素提取液在不同光照（自然光、日光、避光）、温度（30、40、50、60、70、80℃）、酸碱度（pH 8～14）等条件下的吸光度，以研究虾青素的稳定性。

结果虾青素的提取中二次提取可获得90%虾青素，当料液比为1∶25时所测吸光值最大；二氯甲烷∶丙酮（2∶1）为最佳提取液。

随光照强度增加以及碱浓度增加，虾青素的降解增加。

60℃以下，温度对虾青素的影响较小，60℃以上，虾青素开始受热破坏。

结论二氯甲烷∶丙酮（2∶1）是最适的提取溶剂，1∶25为最佳料液比；二次提取后已经提取出大部分虾青素，光照可导致虾青素的降解，虾青素对碱不稳定；虾青素在60℃以下比较稳定。

[Abstract] Objective To study the conditions and stability of astaxanthin extracted by organic solvent，taking Haematococcus pluvialis as raw materials. Methods The ethyl acetate，acetone，methylene chloride，absolute ethyl alcohol and methylene chloride ∶acetone （2∶1）were selected as extraction solvent by experiments，the effect of different extraction solvents for extraction of astaxanthin was studied；the optimum solvent gained from the experiment was used to extract astaxanthin at 20，30，40，50，60，70，80℃，so as to determine the optimum extraction temperature；under the gained optimum temperature and solvent，the astaxanthin was extracted for 1，1.5，2，2.5，3 h respectively，so as to determine the optimum extraction time；the extraction times were set as 1，2，3 times，OD480 was measured after extraction，so as to study the effect of extraction times for extraction of astaxanthin；under the gained optimum solvent，temperature and time in the above experiments，the ratios of material to solvent were taken as 1∶5，1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，1∶35，1∶40，OD480 was measured after extraction，so as to investigate the effect of different ratios of material to solvent for extraction of astaxanthin. The stability of astaxanthin was researched，and the absorbance of astaxanthin extracting solution was determined at different conditions of light （natural light，sunlight，lucifuge），temperature （30，40，50，60，70，80℃），acid-base （pH 8 - 14），and so on. Results In the extraction of astaxanthin，the secondary extraction can obtain 90% of astaxanthin. When the ratio of material to solvent was 1∶25，the measured absorbance was maximum. Methylene chloride∶acetone （2∶1）was the best extracting solution. The degradation of astaxanthin increased with the increase of light intensity and theincrease of alkali concentration. Below 60℃，the effect of temperature on astaxanthin was small. Above 60℃，astaxanthin began to be heated and damaged. Conclusion Methylene chloride ∶acetone （2∶1）is best extracting solution，and 1∶25 is the best ratio of material to solvent. the secondary extraction can extract most of astaxanthin，light can lead to degradation of astaxanthin，astaxanthin is unstable to alkali，astaxanthin is relatively stable below 60℃.[Key words] Haematococcus pluvialis；Astaxanthin；Acetone；Extraction；Stability虾青素（图1）是一种具有很高经济价值和广泛生物活性的类胡萝卜素，虾青素的抗氧化能力是β-胡萝卜素的10倍，是维生素E的500倍，被称为“超级维生素E”[1-2]，在食品、飼料、保健品、医药及化妆品等行业均有广泛的应用价值。

超声波联合研磨破壁法提取雨生红球藻中虾青素的工艺研究

DOI: 10.16210/ki.1007-7561.2020.03.014超声波联合研磨破壁法提取雨生红球藻中虾青素的工艺研究孟昂1，王萌1，赵晓燕1，朱运平2，张晓伟1，刘红开1，朱海涛1（1. 济南大学食品科学与营养系，山东济南250022；2. 北京工商大学食品与健康学院，北京市食品添加剂工程技术研究中心，北京100048）摘要：在比较研究并确定破壁方法与溶解试剂的基础上，利用超声辅助提取方法探索不同条件下从雨生红球藻中提取虾青素的效果，并通过响应面法进一步优化提取工艺参数。

结果表明，采用液氮研磨破壁处理，以乙酸乙酯-乙醇（v/v：1∶2）作为提取溶剂在超声时间18 mins、超声温度39 ℃、液料比9∶50（mL/mg）、超声功率200 W条件下进行震荡超声处理，最后于40 ℃水浴振荡20 mins，虾青素提取率可达85.1%。

关键词：雨生红球藻；虾青素；液氮研磨破壁；溶解试剂；超声辅助提取中图分类号：TS202 文献标识码：A 文章编号：1007-7561(2020)03-0091-07Extraction of astaxanthin from Haematococcus pluvialis by ultrasoniccombined grinding and wall breakingMENG Ang1, WANG Meng1, ZHAO Xiao-yan1, ZHU Yun-ping2,ZHANG Xiao-wei1, LIU Hong-kai1, ZHU Hai-tao1(1. Department of Food Science and Nutrition, Culinary School, University of Jinan, Jinan, Shandong250022, China; 2. School of Food and Health Engineering, Beijing Engineering and Technology Research Center of Food Additives, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China)Abstract:Based on the determination of wall breaking method and dissolving reagent, ultrasonic-assisted extraction was used in this study to explore the effect of extracting astaxanthin from Haematococcus pluvialis under different conditions, and further optimize the test results by response surface methodology. The results showed that under the conditions of ultrasonic time of 18 mins, ultrasonic temperature of 39 ℃, liquid-material ratio of 9∶50 (mL/mg), and ultrasonic power of 200 W, ultrasonic treatment was carried out under the condition of oscillating ultrasound. Finally, the treatment was carried out under the condition of water bath oscillation at 40 ℃for 20 mins, the astaxanthin extraction rate can be 85.1% using Liquid nitrogen grinding broken wall treatment with ethyl acetate-ethanol (v/v: 1∶2) as the extraction solvent.Key words: Haematococcus pluvialis; astaxanthin; liquid nitrogen grinding broken wall; solubilizing reagent;ultrasonic-assisted extraction虾青素（Astaxanthin，AXT）是一种橙红色收稿日期：2019-11-28基金项目：国家自然科学基金（21406133），北京食品营养与人类健康高精尖创新中心开放基金（20181018）作者简介：孟昂，1993年出生，男，在读硕士生，研究方向为天然产物与功能食品开发.通讯作者：赵晓燕，1975年出生，女，副教授，硕士生导师，研究方向为食品理论与加工应用及生物粉体技术研究.色素，主要存在于藻类（如雨生红球藻）和海洋生物（如撒蒙鱼）中。

从雨生红球藻藻泥中高效萃取虾青素的方法与相关技术

本技术公开了一种从雨生红球藻藻泥中高效萃取虾青素的方法，包括以下步骤：步骤一、将雨生红球藻藻泥置于低温机械粉碎设备中进行机械破壁，得到藻浆；步骤二、向藻浆中加入乙醇混合并离心，得到沉淀物；步骤三、向沉淀物中加入有机溶剂并加热搅拌进行浸提提取，反复浸提提取多次至浸提液为无色，合并浸提液并浓缩，得到虾青素。

步骤一中，雨生红球藻藻泥的制备方法为：收集结束培养的雨生红球藻依次进行水洗、离心，即得到雨生红球藻藻泥。

本技术采用低温机械破壁、有机溶剂提取相结合的方式提取虾青素可避免高温对雨生红球藻有效成份的破坏，提高虾青素的提取率。

权利要求书1.从雨生红球藻藻泥中高效萃取虾青素的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一、将雨生红球藻藻泥置于低温机械粉碎设备中进行机械破壁，得到藻浆；步骤二、向藻浆中加入乙醇混合并离心，得到沉淀物；步骤三、向沉淀物中加入有机溶剂并加热搅拌进行浸提提取，反复浸提提取多次至浸提液为无色，合并浸提液并浓缩，得到虾青素。

2.如权利要求1所述的从雨生红球藻藻泥中高效萃取虾青素的方法，其特征在于，步骤一中，雨生红球藻藻泥的制备方法为：收集培养结束的雨生红球藻依次进行水洗、离心，即得到雨生红球藻藻泥。

3.如权利要求1所述的从雨生红球藻藻泥中高效萃取虾青素的方法，其特征在于，步骤一中，机械破壁的条件为：频率为50～70HZ，温度-20～-10℃，时间5～20min。

4.如权利要求1所述的从雨生红球藻藻泥中高效萃取虾青素的方法，其特征在于，步骤二中，藻浆与乙醇的质量比为1:1～10。

5.如权利要求1所述的从雨生红球藻藻泥中高效萃取虾青素的方法，其特征在于，步骤三中，有机溶剂为乙醇、乙酸乙酯、丙酮中的一种或多种。

6.如权利要求1所述的从雨生红球藻藻泥中高效萃取虾青素的方法，其特征在于，步骤三中，浸提提取的条件为：沉淀物与有机溶剂的质量比为1:1～10，加热温度20～60℃，搅拌时间为10～60min。

雨生红球藻生产虾青素的研究进展

别为３．１２和１．６１ｍｇ／ｇ（干重）¨“。３雨生红球藻的规模化培养３．１两步式两阶段法所谓两步式两阶段法就是根据雨生
条件下胁迫培养雨生红球藻５ｄ，虾青素含量达到了１２．３７ｍｇ／Ｌ，是自养条件下的１６倍多‘１“。Ｖｉｄｈｙａｖａｔｈ等人同样利用乙酸钠作为碳源，同时利用氮缺乏、１７．１ｍｍｏｌ／Ｌ的ＮａＣｌ
和６０ｉ．Ｌｍｏｌ／ｍ２・ｓ的光照作为胁迫条件培养雨生红球藻，９
ｄ
后每克干藻粉的虾青素含量达到２４．５
慢，大多还停留在使用基因枪这种低效率的转入方法上。
Ｓｔｅｉｎｂｒｅｎｎｅｒ等使用基因枪的方法将定点诱变后的八氢番茄红素脱饱和酶基因打入雨生红球藻细胞内进行同源表达，得到稳定的转化子，其中有转化子表现出虾青素高含量性瞄Ｊ。虽然Ｋａｔｈｉｒｅｓａｎ等利用含穿梭载体ｐＣＡＭＢＩＡｌ３０１的农杆菌侵染雨生红球藻，成功地构建了转基因表达所需的抗性标记，但并未实现相关基因的同源表达脚ｏ。
虾青素（３，３’．二羟基．１３，Ｂ’．胡萝卜素４，４’一二酮）是一种红色的类胡萝卜素衍生物，分子两端各有一个紫罗酮环，环上各有一个羟基，根据羟基与整个分子平面的位置关系虾青素分为４种光学异构体…：２个羟基位于平面下方构成ｓ构象（３ｓ，３’ｓ－虾青素）；２个羟基位于平面上方构成Ｒ构象（３Ｒ，３’Ｒ．虾青素）；１个羟基位于乎面上方，１个位于平面下方的构成ｓ，Ｒ构象（３Ｓ，３’Ｒ－虾青素和３Ｒ，３’ｓ．虾青素）。研究表明，虾青素有极强的染色、抗氧化和增强机体免疫的能力，这些特性使得虾青素在水产养殖业中作为饲料添加剂不仅可以增加水生动物的着色还可以增强鱼类卵子的质量口司１，在化妆品中还能够有效地延迟皮肤老化。４１；在临床医药上能够有效地促进癌细胞凋亡忙ｏ，抑制心血管疾病引发的炎症旧ｏ。如此广泛的用途使得虾青素的需求量越来越大，２０１０年全球的水产养殖业的市场需求量就达到了２亿美元…。现阶段虾青素的生产主要有以下３种方法：化学合

几种胁迫方式对雨生红球藻积累虾青素

第４９集海洋科学集刊No.49 2008年８月STUDIA MARINA SINICA Aug,2008几种胁迫方式对雨生红球藻积累虾青素影响的初步研究黄水英，齐安翔，李哲，李晓梦，王蕴，蔡明刚*（厦门大学海洋与环境学院，厦门361005）虾青素（astaxanthin）是一种近年来进入国际研发领域的红色类胡萝卜素，广泛存在于自然界，尤其是海洋生物体内，其抗氧化能力比其他类胡萝卜素强10倍，比维生素E强550倍，被誉为“超级维生素E”。

虾青素的着色能力显著，并具有抗癌症、抗衰老、增强免疫力等一系列重要的生理功能，鉴于此，它被广泛应用于保健品、医药、水产养殖等领域，具有广阔的发展前景。

在虾青素的生物来源中，雨生红球藻（Haematococcus pluvialis）中虾青素可占其干重的1%~3%，且体内虾青素及其酯类的结构配比与养殖对象所需一致，因此被公认为自然界中虾青素的最佳来源（蔡明刚等，2003）。

雨生红球藻是一种淡水单细胞绿藻，生活史呈现多样性：在适宜环境下，以游动的绿色营养细胞形态存在；在不利环境下，以不动的厚壁孢子形态存在，并因大量积累虾青素而呈现红色。

相应地，当前国内外利用雨生红球藻培养法生产虾青素通常分两阶段进行：即首先实现微藻营养细胞的高密度生长，随后多通过设置高光照等人为胁迫手段，促使营养细胞转变为厚壁孢子，并积累虾青素（Harker et al.，1996；Sarada et al.，2002）。

因此，胁迫条件是雨生红球藻积累虾青素的关键环节，并在很大程度上决定了虾青素的产量和质量。

目前，尽管对光强、温度等传统胁迫因子的条件参数已基本确定（Boussiba et al.，1992；Hagen et al.，2001），但高光等胁迫方式不仅导致细胞大量死亡，同时由于形成厚壁孢子，降低了生物的直接利用效率，并使虾青素的提取成本和难度大为增加。

近年来，营养盐（N、P等）缺乏、盐胁迫以及不同波段光照等一些新的胁迫手段逐渐被人们所重视，并为解决目前研究和生产中存在的关键问题提供了一些有益的思路（Fabregas et al.，1998；Tan et al.，1995），但上述胁迫方式对雨生红球藻的生长和虾青素积累的影响研究仍不够深入细致，且缺乏系统性。

雨生红球藻中虾青素的提取及稳定性研究

（ＣｈｅｎｇｕａｎｇＢｉｏｔｅｃｈＧｒｏｕｐＣｏ．，Ｌｔｄ．，Ｈａｎｄａｎ０５７２５０）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＴｈｅｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇｏｆｔｈｅｃｅｌｌｗａｌｌｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎａｎｄａｓｔａｘａｎｔｈｉｎｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｆｒｏｍＨ．ｐｌｕｖｉａｌｉｓｗａｓｓｔｕｄｉｅｄ．
ｍｅｔｈｏｄｗｅｒｅｕｓｅｄａｎｄｔｈｅｐｒｏｃｅｓｓｗａｓｏｐｔｉｍｉｚｅｄｏｎｔｈｅｂａｓｉｓｏｆｓｉｎｇｌｅｆａｃｔｏｒｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ，ｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｗａｓ
ｃａｐａｃｉｔｙａｎｄｔｉｍｅｆｏｒｍａｎｕａｌｈｏｍｏｇｅｎｉｚａｔｉｏｎｔｒｅａｔｍｅｎｔｗｅｒｅ０．０５ｇａｎｄ１０ｍｉｎ，ｔｈｅｃｅｌｌｗａｌｌｄｉｓｕｐｔｒｉｏｎｒａｔｅ
ＥｘｔｒａｃｔｉｏｎａｎｄｓｔａｂｉｌｉｔｙｒｅｓｅａｒｃｈｏｆａｓｔａｘａｎｔｈｉｎｆｒＯｍＨ．ｐｌｕｖｉａｌｉｓ
ＷＡＮＧＨｏｎｇ — ｘｉａ，ＹＡＮＧＷｅｎ，ＴＩＡＮＨｏｎｇ，ＬＩＡＮＹｕｎ — ｈｅ，ＨＵＸｉａｏ — ｍｅｉ，ＷＵＹａ — ｍｉｎｇ

一种从雨生红球藻中提取虾青素的方法[发明专利]

专利名称：一种从雨生红球藻中提取虾青素的方法专利类型：发明专利
发明人：李本明
申请号：CN201410748498.X
申请日：20141210
公开号：CN104529852A
公开日：
20150422
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种从雨生红球藻中提取虾青素的方法，包括藻种培养及预处理，冰醋酸冰浴、匀浆机匀浆和液氮低温处理相结合的细胞破壁方法，以及CO超临界萃取虾青素等步骤。

本方法冰浴条件下冰醋酸可以更快的渗透到雨生红球藻细胞的表层；匀浆过程中的搅拌离心力、挤压力、剪切力对海藻细胞进行破碎，并且物料之间的摩擦力加速细胞表面冰醋酸对细胞壁结构中糖蛋白的破坏；同时，冰浴醋酸的介入避免了匀浆过程中海藻细胞温度升高，最大程度的保护虾青素的理化活性。

本发明所述的破壁方法，细胞的破壁率高达97.7%，虾青素提取物的提取率达到37%，虾青素的提取率达到35.05%，产物中虾青素纯度极高达到95.25%。

申请人：青岛无为保温材料有限公司
地址：266061 山东省青岛市崂山区海尔路158号2号楼1622
国籍：CN
代理机构：北京一格知识产权代理事务所(普通合伙)
代理人：钟廷良
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雨生红球藻中虾青素提取方法的比较研究

雨生红球藻中虾青素提取方法的比较研究
王灵昭
【期刊名称】《食品研究与开发》
【年(卷),期】2008(029)007
【摘要】比较了微波法、低温研磨萃取法和碱提法提取雨生红球藻中虾青素的效果,又进一步比较了这3种方法提取的虾青素在总抗氧化能力(T-AOC)和清除羟自由基(·OH)能力等方面的差别.为从雨生红球藻中提取虾青素的商业化生产提供了一些参考和指导.
【总页数】4页(P16-19)
【作者】王灵昭
【作者单位】淮海工学院,海洋学院,江苏,连云港,222005
【正文语种】中文
【中图分类】TS2
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