离子注入利福霉素产生菌诱变选育研究

第8卷第3期激　光　生　物　学　报V o l.8　N o.3 1999年9月A CTA　LA SER　B I OLO GY　S I N I CA Sep.1999离子注入利福霉素产生菌诱变选育研究Ξ姚建铭　朱皖宜33　王　纪　余增亮(中国科学院等离子体物理研究所,合肥　230031)摘　要　离子注入诱变利福霉素生产菌,首先利用利福霉素浓度梯度平板理性化筛选出高抗性菌株,再以此抗性菌株为出发菌进行离子注入诱变筛选。

初筛摇瓶效价达9000Λ m l,经复筛菌株2953#效价稳定提高18%。

7m3罐中试,放罐效价达6863Λ m l,较同期对照提高35%;30m3罐生产实验,最高罐批效价为6137Λ m l,平均提高10%。

关键词　离子注入;利福霉素;理性化筛选;诱变;效价中图分类号　O53;Q93文献标识码　A文章编号　1007-7146(1999)03-0214-03Study the Screen i ng on the R ifam yc i n-Produc i ng Stra i n s with the Ion I m plan ta tion YA O J ian m ing　ZH U W ang y i　W A N G J i　YU Z eng liang(Institute of P las m a Physics,A cadem ia Sinica,H efei230031)Abstract　U sing i on i m p lan tati on,the h igher resistan t strain s w ere in telligen tly selected on the rifam ycin-concen trati on grade p lates.T hen they w ere u sed as the starting strain and the h igh yield strain2953#w as screened ou t w ith i on i m p lan ting.2953#strain w as fer m en ted in7m3tank s and its po tency w as6863Λ m l that w as35%h igher than that of the o riginal strain s.T he h ighest po tency reached6137Λ m l in30m3p roducing tank.Key words　I on i m p lan tati on;R ifam ycin;In telligen tly selected;M u tati on;Po tency 在诱发突变育种研究中,寻找突变率高、突变谱广的诱变源是一项非常重要而有效的工作。

低能离子生物学是我国首创的研究领域[1],与传统的诱变源如x射线、Χ射线及化学诱变剂等相比,离子注入除有能量沉积外,还有动量传递、质量沉积及电荷交换等效应[2-4]。

将不同离子(H+、N+、A r+、Fe+等)注入细胞,通过电、能、质的共同作用,不仅可影响细胞的生理生化功能,更重要的是它还可使细胞中的染色体畸变、DNA链发生断裂,所以,离子束诱变是一种集物理和化学诱变特性于一身的综合诱变方法。

目前,通过离子束注入改良已筛选到几十株高产菌株[5-7]。

利福霉素是地中海链霉菌(S trep to m y ces m ed iterranei)产生的安莎类抗生素。

目前,国内利福霉素SV发酵水平为国外的1 3,其原因可能是SV对菌体生长和产物合成的强烈抑制所致[8]。

为打破产物自身抑制,采用低能离子注入这一新的诱变工具,先用利福霉素SV浓度梯度平板,筛选出自身抗性菌株,再以此抗性菌株为出发菌,经离子束反复诱变、筛选、分纯,筛选到高产菌株2953#,较出发菌效价提高18%。

7m3罐实验,效价可达6863Λ m l,比同期对照高了35%。

30m3生产罐实验,最高罐批效价为6137Λ m l,平均提高10%。

1　材料与方法111　菌种地中海拟无枝菌酸菌(A m y cola top sisM ed iterranei)78#、242#,由合肥制药厂提供。

112　培养基及培养条件同文献[8]。

113　诱变方式Ξ基金项目:“九・五”国家重点攻关项目资助33现浙江海正药业工作收稿日期:1999-01-22第3期姚建铭等:离子注入利福霉素产生菌诱变选育研究21511311　离子注入实验装置　由中科院等离子体物理研究所研制,离子能量为20～30KeV ,束流为20mA ,采用脉冲注入方式,注入剂量为1×1015i on s c m 2。

11312　样品制备　纯种斜面一环,用玻璃珠打碎,取012m l 于无菌平皿中,吹干,进行离子注入。

114　筛选工艺11411　利福霉素浓度梯度平板的制备　将不含利福霉素的培养基15m l 倒入9c m 培养皿,制成斜面,再倒入含有一定量利福霉素SV 的培养基平放,凝固后即为利福霉素浓度梯度平板。

11412　初筛采用一级发酵,复筛采用二级发酵。

115　分析方法11511　生物法　用杯碟法,以藤黄八叠球菌为鉴定菌。

11512　化学法　采用氧化-还原法。

(标样由合肥制药厂提供)2　结果与分析211　离子注入效应离子注入同其他物理化学诱变剂一样,不同的菌种对其敏感性不同;细胞处于不同的时期,对各诱变剂的敏感性也不同。

本实验所用的菌种为不长孢子的原放线菌,只能以菌丝体形式进行辐照,但菌丝体的长短对诱变后的筛选,特别是选出菌株的稳定性有很大的影响。

实验中首先测定了离子注入剂量与菌种致死率的关系,表1为N +离子注入剂量与致死率的关系。

T ab le 1.D eath rate of strain s i m p lan ted w ith differen t do ses of N +i on sStrains (N 0)Do se5×10131×10145×10141×10155×10151×1016V acant effect CK 78#35101481007014888125921009910571050100242#431235211469123841369011998140151300100 从表1可以看出,菌株随注入剂量的增加,致死率也随之增加。

另外,靶室的真空也有一定的致死作用。

212　自身耐受性菌株的筛选菌株经30keV 、5×1015N +注入后,涂布于利福霉素浓度梯度平板上,在高浓度区筛选到二株抗性菌株24285#、242153#,有专家认为自身抗性菌株大都是高产菌株。

在本实验中,抗性菌株与原始菌,摇瓶效价相差不明显,而以此抗性菌株作为出发菌,经离子注入诱变,正变率及正变幅度要比原始菌高。

这可能是因为某些抗性菌株对自身产物有较强的耐受性,即有了高产潜质的缘故。

213　高产菌株的筛选24285#菌株抗性较为稳定,经反复离子注入和纯化分离,最终筛选到高产菌2953#。

诱变系谱如下:初筛结果见表2。

T ab le 2.M u tati on effect of i on i m p lan tati on on 24285#Strains (N o .)chem icalpo tency CK R aise rate (%)17956494669201991010923249868511610248307498666161249995475110861832953643654051913029776415540518169从表2可以看出,先后二次筛选到效价8500Λ m l 以上的突变株,但复筛时,效价大幅度下降,原因可能是菌体处于异质杂合状态,虽然加强了突变株的分离,最终获得的高产菌2953#,仅较原始株效价提高19130%。

214　高产菌株2953#的复筛及传代实验按企业提供的复筛及传代工艺,对1010#、1024#、2499#、2953#、2977#菌株进行复筛实验,结果见T ab le 3。

从表3可以看出,菌株2953#较为稳定,三代平均较对照242#提高18%。

215　2953#菌株的7m 3罐中试和30m 3生产罐实验中试在合肥制药厂五车间7m 3罐上进行,其中1#07、2#07罐批放罐化学效价达6700Λ m l216激　光　生　物　学　报第8卷 T ab le 3.Effect of the u lteri o r screen ingStrain (N o )F 1Po tency P re cent F 2Po tency P re cent F 3Po tency P re cent 24251531005084100510510010105823113584711554111061024561710953891065462107249957711125287104561611029536132119594811760241182977556510851861025360105和6863Λ m l ,较同期对照提高35%。

见F ig .1。

30m 3罐生产实验,603303罐批,化学效价为6137Λ m l ,当月效价平均提高10%。

结果见F ig .2。

F ig .1　Cou rse of po tency du ring fer m en tati onp rocedu re in 7m 3tankF ig .2　Cou rse of po tency du ring fer m en tati onp rocedu re in 30m 3tank上述研究表明,通过N +离子注入利福霉素产生菌,采用利福霉素浓度梯度平板理性化筛选出抗性菌株,再以此抗性菌株为出发菌,进行高产菌筛选,效果良好,此方法高效可行。

对超高产的突变株,进行了更加深入细致的工作,如工艺条件、接种量、种龄及L i C l 复合处理等实验,这些工作以后将做进一步报导。

致谢:合肥制药厂章元浩总工程师及五车间、十车间的工作人员给予了大量的支持和帮助,特此致谢。

References[1]YU Zengliang et al.P rogress in studies of bi o logical effect and crop breeding induced by i on i m p lantati on .Journal of A nhui A gricultural C illege .1991;18(4):251～257(in Ch inese )[2]YU Zeng liang et al .L ow energy i on bi o logy .Science 1993;4;36～39(in Ch inese )[3]YU Zeng liang et al .R eview in low energy i on bi o logy .Journal of A nhui A gricultural U niversity .1994;21(3):221～225(in Ch inese )[4]YU Zeng liang et al .M utati on breeding by i on i m p lantati on ,N uclear Instrum ents and M ethods in Physics R esearch ,B 59 60(1990)705～708[5]J I AN G Zehuei et al.T he advances in the research on i m p roved variety by i on i m p lantati on .Journal of A nhuiA gricultural U niversity .1994;21(3):295～298(in Ch inese )[6]CH EN Yu et al .A study of h igh yield m utants ofStrep tom yces eryth reus and m utati on m echanis m induced byi on i m p lantati on .Ch inese Journal of A ntibi o tics.1997;22(6):410～414(in Ch inese )[7]X IE L i qing et al .ESR study of free radicals induced by i on i m p lantati on in antibi o tic -p roducers .N uclear T echniques 1995;18(9):527～529(in Ch inese )[8]J I N Yu kun et al.R ati onal selecti on of R ifam ycin -p riducing strains .Ch inese Journal of A ntibi o tics.1991:16(4):241～245(in Ch inese)作者简介姚建铭:男。