离子注入微生物诱变育种研究进展

除去,A Hein fling 等人在研究中发现[28],MnP 可用于偶氮和酞菁转化,当反应体系中加入藜芦醇时,转化率可提高8～100倍。

另外,MnP 对偶氮类、蒽醌、杂环、三苯甲烷、高分子染料尚具有脱色和部分矿化能力。

712　造纸工业
MnP 在纸浆的生物漂白方面有很大的应用前景。

T oshiya
Sasaki 等人采用固定化MnP 法[29]
,构建了热稳定的两步反应体系,对纸浆处理完毕后,在7h 内,纸浆的漂白度增加88%。

713　褐煤的生物降解
微生物对低阶煤具有脱硫、液化等能力[30],Willmann 等人[31]研究发现,白腐真菌可对溶于水的褐煤大分子进行漂白,酶学研究表明其中起作用的是MnP ,无LiP 和漆酶活性。

体外研究发现,Nematoloma frowardii 和Clitocybula dusenii 分泌的MnP 可迅速对Rhenish 褐煤解聚,生成小分子量的黄腐酸[32]。

本课题组在内蒙褐煤的微生物降解研究中发现,降解过程中有MnP ΠLiP 活性,无漆酶活性;且降解后黄腐酸的含量明显升高,研究有待进一步深化。

8　展望
MnP 的底物专一性弱,可氧化各类芳香化合物及一些难生物降解的物质,但由于其底物的多样性及酶本身结构、基因编码、调控表达的复杂性,所以国内的研究尚处于初期阶段;国外的研究虽然取得一定进展,但对于MnP 的分子生物学、高效表达体系的构建等研究尚有待深入。

MnP 除在已知的生物制浆、纸浆的酶法漂白、有机污染物的降解和环境的生物修复领域有重要用途,而且研究发现MnP 在褐煤的生物转化过程中起重要作用。

褐煤是一种应用价值低的劣质煤,长期露天堆放,不仅造成能源浪费,而且造成环境污染。

我国有丰富的褐煤资源,占已发现煤炭资源的1217%,褐煤经微生物降解后,活性组分黄腐酸的含量显著提高,黄腐酸可用于工、农、医、牧、环境等各个领域。

加快对MnP 遗传学和生理学机理的研究,构建高效表达载体实现MnP 的工业化生产,不但可以加快木素生物降解的进程,对实现生物能的绿色转化具有重要意义;而且为高效利用我国的煤炭资源,实现能源的高效生物转化开辟了新途径。

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离子注入微生物诱变育种研究进展
宫春波
1,2
,刘鹭1,谢丽源1,贺稚非
1
(11西南农业大学食品科学学院,重庆400716;21莱阳农学院食品科学系,山东莱阳265200)
摘要:论述了离子注入微生物育种的三大特征,介绍了微生物接受注入离子的方法、离子注入机的简单结构和工作情况。

概述了近几年来离子注入微生物,改良、选育优良工业微生物菌株的应用研究情况,分析了今后离子注入微生物育种的发展趋势。

关键词:离子注入;微生物育种;诱变特征;工业微生物
中图分类号:Q345;Q69115 文献标识码:A 文章编号:1004-311X (2003)02-0047-03
收稿日期:2002-10-28;修回日期:2003-01-14
作者简介:宫春波(1972-),男,硕士生,讲师,研究方向:微生物酶及其酶制剂。

离子注入生物体诱变育种是人工诱变方法的一种新发
明[1]。

已经证实离子注入诱变,可以获得高突变率,扩大突变谱,为筛选优良的突变型菌株提供广阔的空间[2];同时,离子束也可以作为介质进行外源目的基因转移和转导。

目前,利用离子注入已经获得转基因植物;转含有耐辐射异常球菌基
第13卷第2期:472003年4月 生　物　技　术BI OTECH NO LOGY
V ol 113,N o 12:47
Apr 12003
因组DNA的E1coli菌株[3]。

我国离子束应用研究已有17项成果,其中7种高产、优质、抗病虫农作物新品种和6个微生物新菌株已经推广应用于农业和工业生产中,累计创效益17亿元以上。

因此离子注入法在作物和微生物诱变育种方面受到广泛关注。

近十年来,人们大量研究了离子注入微生物诱变育种情况,并已获得了酶、抗生素和菌体物质等代谢产物的高产、优良菌株。

探索了以离子束为介导的微生物基因组DNA的转基因研究,使微生物基因重组育种技术得以完善和补充,拓宽了微生物育种的方法。

1　离子注入微生物育种的特点
在离子注入生物效应研究中,发现了一些新现象。

致死突变剂量效应非指数规律,具体到微生物就是与其它的诱变方法相比较,存活曲线呈“马鞍型”变化(即存活率随着注入离子剂量的增大,表现为先降后升、再降的变化)。

而γ-射线诱变的存活曲线一般呈指数型或肩型[4];离子注入诱变频繁地出现当代突变,细胞形态、细胞电性和细胞通透性的变化。

这说明离子注入的原初机制相当复杂。

余曾亮等[5]总结为四方面:能量沉积、动量传递、离子注入和电荷交换。

这四种过程在生物体内发生的理化反应,形成的生物效应,使离子注入法育种具有许多独特的特点。

同样,其在微生物育种中独具特色。

111　正突变菌体的高效性
离子注入诱变育种的四大特点,表明了其是一种物理效应、化学效应,是集化学诱变、物理诱变为一体的综合诱变方法。

它能够引起染色体的畸变,导致DNA链碱基的损伤、断裂[2],从而使遗传物质在基因水平或分子水平上发生改变或缺失,大幅提高变异的频率。

特别是在工业微生物育种方面,为筛选高效的正突变菌株提供了更广阔的空间。

龚加顺等[6]在研究单宁酸酶生产菌(黑曲霉Aspergillus niger9701)诱变过程中,发现N+注入黑曲霉可获得较UV诱变更高的正突变率和更大的变异幅度。

UV诱变的菌株负突变率高,子代孢子生长缓慢,发酵单位普遍低于N+注入诱变结果。

这充分验证了,离子注入诱变谱广、变异幅度大的特点。

而离子注入VC 二步发酵混合菌育种,选育出了高产菌株,已经进入工业化生产[2]。

也充分说明了离子注入能克服传统诱变方法正突变率低的特点,减弱菌种多次诱变产生的饱和性、抗性,提高工业微生物的发酵水平。

许安等[2,7]采取分别诱变和筛选VC混合发酵体系,进行优-优组合,获得高产菌系,糖酸转化率较出发菌株提高15%～20%,4代传种平均转化率达95%。

摇瓶培养具有产酸能力高、发酵周期短的特点。

虞龙等[8]利用低能离子注入VC生产菌株,筛选到四株高产菌株,将出发菌株80%的糖酸转化率提高到94136%。

证明了离子注入诱变育种的高效性,表明了离子注入具有质量沉积和能量沉积的双重效应,二者正是正突变率高效性的理论基础。

另外,离子注入能使利福霉素生产菌株提高18%的效价,工业化的生产试验平均提高率为10%[9];使花生四烯酸生产菌株小试发酵达415gΠL,比国外专利(96Π920025)的2128gΠL高出近一倍[10],而白腐真菌F4经离子注入后选育的多酚氧化酶高产菌株POPD5,漆酶的活性提高16倍[11]。

近几年利用离子注入育种获得高产菌株,成果显著(表1),正突变率高、生产水平提高幅度大。

可见,离子注入微生物育种,正突变率高效性明显,是工业微生物进一步获得优良菌株的有效育种途径。

112　菌体细胞表面刻蚀性
离子注入生物体的动量传递,可以根据直观的表面现象进行观察、研究,注入的离子就像“手术刀”对细胞表面进行刻蚀,留下非常整齐的创面。

动量传递的结果引起生物组织或细胞的表面溅射,造成细胞形态的变异。

具体表现到植物细胞为细胞壁减薄、细胞膜损伤,甚至大剂量时细胞破裂、死亡[1,5]。

这实际上是注入的离子在进入细胞过程中,对细胞造成的物理损伤。

最近的研究也表明,离子注入微生物细胞的动量转移,同样导致细胞表面的刻蚀;且菌体刻蚀程度及修复能力随注入剂量的不同而有差别。

宋道军等[4]研究了N+和γ-射线对两种微生物膜损伤的比较,电镜扫描结果表明,离子束的溅射可以引起细胞表面形态的变化,随着剂量的增大细胞由表及里刻蚀损伤逐渐增大;刻蚀面积及深度逐渐增加。

小剂量的刻蚀却看不到,归于细胞表面产生许多可修复的微孔或小洞,并深入细胞内部。

这为离子束转移外源基因创造了条件,而离子束转导基因的成功也证明了这一点。

γ-射线辐射却未见这种直观的刻蚀现象。

龚加顺等[6]利用离子束辐照黑曲霉孢子进行诱变,也验证了离子注入后,离子剂量与孢子细胞表面刻蚀程度呈正相关增加。

注入离子后的孢子有明显破壁现象,孢子上有明显的凹陷区。

他们都认为离子先破细胞壁、膜,后到达细胞表面或内部,进行动量交换,影响胞内物质的运动,导致染色体结构的重排和其它的变化,从而产生了稳定的遗传变化。

笔者认为,离子注入的刻蚀损伤菌体细胞表面,也是离子注入微生物育种正突变高效性的一个基础。

细胞膜或壁的损伤,无论程度大小,对细胞壁、膜的通透性及结构都有影响;而壁、膜通透性的大小、结构组分的变化又是微生物酶,特别是胞外酶等次级代谢物分泌相关的条件。

当然,这方面的推测还需要进一步研究。

另外,离子注入的刻蚀损伤也充分说明,离子注入法育种对注入的离子种类、剂量的选择非常重要。

表1　离子注入育种获得优良菌株情况
菌株目标物质提高率(%)注入离子类型文献地衣芽孢杆菌α-乙酰乳酸脱羧酶40N[12]
枯草芽孢杆菌抗真菌菌素27N+[13]地中海拟无枝菌酸菌利福霉素10～35N+[9] VC生产混合菌糖酸转化率10～20H+,N+,Ar+[2,7]
VC生产菌糖酸转化率35148N+[14]
Mortierella alpina花生四烯酸97N+[10]
黑曲霉9701单宁酸酶268N+[6]玫瑰黄链霉菌杭
州亚种93-15-32
之江菌素300N+[15]黑曲霉β-葡萄糖苷酶20N+[16]白腐真菌F4漆酶1600N+[11] 113　菌体存活曲线呈“马鞍型”
存活率是微生物育种中常测指标,存活曲线是存活率的趋势直观表现。

传统的物理、化学诱变方法(UV、γ-ray、E MS、DMS)均产生指数型或肩型的存活曲线,而离子注入诱变的存活曲线为先降后升再降的“马鞍型”。

这说明了离子注入损伤小、突变率高的生物学效应[4,17,18]。

宋道军等[19]就“马鞍型”存活曲线的可能机制进行了研究。

认为低剂量的N+注入时,能量沉积效应和动量转移效应的综合作用,导致了DNA损伤和生物膜等大分子的损伤,造成了存活率的下降。

中高剂量注入时存活率上升,可能N+注入后电荷积累发挥了作用,激活了细胞的修复机制和修复酶。

高剂量N+时,细胞损伤程度大于其修复能力;电荷效应也由于达到了临界值,而产生库仑爆炸,保护屏障消失。

虽然,理论上能解释其原因,但具体的修复机制情况需要进一步的研究证明。

“马鞍型”存活曲线充分的说明了离子注入诱变具有独特的作用机制。

2　离子注入微生物的方法
211　离子注入装置—离子注入机
离子注入机由离子源、质量分析器、加速器、四极透镜、扫描系统和靶室组成,可以根据实际需要省去次要部位。

离子源是离子注入机的主要部件,作用是把需要注入的元素电离成离子,决定着注入离子的种类和束流强度[18]。

中科院等离子体物理研究的一台小型的ECR(E lectron cyclotron res onance)离子源装置由离子源、分子泵、进气口、真空室、感应圈、靶室和束流积分仪七部分构成。

具有壁溅射低、离化率高、工作寿命长、能获得高密度氧化性离子流和注入剂量测定精确等特点[19]。

离子源的直流放电或高频放电产生的电子作为轰击粒子,当外来电子的能量高于原子的电离电位时,通过碰撞使元素发生电离,碰撞后除原始电子外,还出现正离子和二次电子。

正离子进入质量分析器选出需要的离子,再经加速器获得较高的能量(或先加速后分选),由四极透镜聚焦后进入靶室,进行离子注入[18]。

另外,离子束能量、金属束流、气体束流和束斑等的工作量范围因注入机的不同而有差异。

212　离子注入微生物的方法
微生物诱变育种,一般采用生理状态一致,处于对数生长期菌体的单细胞进行理化处理。

这样才能使菌体均匀接触诱变剂,减少了分离现象的发生,获得较理想的效果。

对于以菌丝生长的菌体,则利用孢子来诱变。

同样,离子注入微生物育种也符合该规律。

对于离子注入机来说装置固定、操作程序规范,因此菌体的前处理,获得高活性的单细胞是离子注入微生物育种的关键点。

许多研究证明,利用菌膜法或干孢法进行离子注入效果较好。

首先,取培养活化的菌体种子液或斜面活化的菌苔进行稀释,一般是10-2～10-3的稀释度,菌体浓度为108～109个Πm L为宜;然后,吸取适量的菌体稀释液涂布于无菌的玻璃片(233cm)或无菌培养皿上,显微镜检验保证无重叠细胞,自然干燥(约10min)或用无菌风吹干形成菌膜;放入离子注入机的靶室(具有一定的真空度)进行脉冲注入离子。

要有无离子注入的真空对照和空气对照[2,9,15]。

还有涂孢(胞)法和培养法,前者是将稀释的菌体或孢子悬液涂布于合
84
生　物　技　术 第13卷第2期
适的琼脂平皿上,尽量减少细胞重叠,置于离子注入机靶室,抽
真空进行离子注入;培养法是将菌悬液接种培养基平皿上,待
长出菌落并产生大量孢子后,将平皿置于离子器靶室,抽真空后荷能离子注入诱变,常使用于具有菌丝的微生物[15],但是不能保证菌体的高活性。

一般常用干孢法或菌膜法处理进行离
子注入,且效果最佳。

离子注入过程中,菌体活性的研究鲜有报道。

甄卫军等[14]初步研究了无菌水、无菌水生理盐水、无菌脱脂奶保护剂对菌膜菌株活性的影响,发现保护剂保护作用强,但是影响离子注入,起到能量反射和屏蔽作用;无菌生理盐水对菌株的活性保留最大。

这方面研究需要进一步确定保护剂,力求离子注入时活菌细胞最多。

另外,H+、N+、Ar+离子是常用的诱变剂,其中N+最常用。

注入能量为20kev～30kev,注入剂量0(对照)～1016ionΠcm2之间。

脉冲式注入,每次连续注入的时间和间隔时间因处理的种类不同而各异。

温度应控制50℃以下,真空度为10-3Pa[2,8,13]。

这只是常用量,针对不同菌种要进行适当的调节。

3　离子注入在工业微生物育种中的应用
离子注入微生物育种的研究近几年发展非常迅速,主要集
中于工业微生物优良菌株的选育或改良,以获得高收率的目标
产物为目的。

对于注入微生物中离子的作用机理,外源目的DNA的转移的研究相对较少。

发酵工业上,以高产菌株为出发菌株进行诱变,提高发酵
产物收率和品质,一直是工业单位的常用手段。

但传统诱变方
法的多次诱变往往导致负突变和抗性饱和。

而离子注入却能
打破此瓶颈,获得以目标产物为目的的高产、优良菌株。

许安等[2,7]以生产VC的2-酮基-L-古龙酸高产菌系为出发菌株,进行离子注入育种,选育出了高产菌系,糖酸转化率提高15%～20%,4代传种平均转化率达95%。

并进行了培养基优化和摇瓶发酵检测,为所选的IPP M-1028菌系的扩大生产提供了依据。

虞龙等[8]则利用H+、N+、Ar+三种离子注入VC发酵大菌—巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium),确定了最佳的离子注入剂量,选出了4株改良菌株进行工业化生产。

180M2、300M2发酵罐300批次的实际生产,平均糖酸转化率(克分子)为91%,高出出发菌株11个百分点。

从而提高了生产效率,降低了成本,增强了我国VC产品在国际上的竞争力。

最近,甄卫军[14]等则利用离子注入选育了2株VC高产菌株,产酸量较出发菌株提高了35148%、25%。

为再一次提高VC的产量提供了菌株。

菌源性酶工程方面,离子注入诱变成功的选育了多种酶的高产菌株。

惠友权等[12]以5×1016N+Πcm2的剂量处理地衣芽孢杆菌,选育了一株胞内α-乙酰乳酸脱羧酶菌株,酶活提高了40%,且性状稳定。

李平等[16]以注入离子结合传统方法协同诱变黑曲霉,选育出β-葡萄糖苷酶活达17UΠm L的高产菌株。

龚加顺等[6]在研究单宁酸酶转溶红茶“冷后浑”效果时,也用N+注入黑曲霉9701的孢子进行菌株改良,获得1株酶活高达3415m olΠs的菌株,提高了268%。

但是利用离子注入获得酶活高产菌株的研究相对较少,应用于工业化生产的并不多见,而酶制剂越来越显出了其优越性。

因此,有必要拓宽育种的范围,加大中试及工业生产方面的研究,以获得更多菌源性酶制剂。

另外,宋道军等[17]则研究了N+离子注入后,微生物自身固定酶或保护酶活性变化和诱导情况。

他以E1coli和耐辐射微球菌为试验材料,研究了N+离子注入或对其C AT、S OD、POD的活性影响及自由基清除情况;离子对耐辐射微球菌Mn-S OD的诱导。

为研究离子注入后对菌体结构酶影响机制,以及结构酶组分的变化提供了实验依据。

当然,这方面的研究要更深入探索N+的作用原理。

生物工程研究领域,离子束作为介导转导外源目的DNA,
在植物转基因方面已获得了表达。

近几年先后得到转G US基
因的水稻、转绿色荧光蛋白基因的小麦和转水稻几丁质酶的小
麦植株。

但离子注入介导转基因在微生物方面的研究甚少,宋道军等[3]首次报道了以离子注入为介质将耐辐射异球菌的基因组DNA片段成功转到对UV敏感的E1coli菌株中,耐辐射异球菌菌株的外源耐辐射基因在其体内得以表达。

开创了离子束转基因在微生物中的应用,使基因重组技术在微生物育种中更加完善。

此法相对于载体而言,优点非常明显,不需要制备感受态细胞、操作简单,对外源DNA分子的种类和数目的大小要求不高,定位诱变性强。

再者,抗生素方面选育高产菌株也非常成功,利福平霉素[9]、之江菌素[15]、抗真菌素[13]等菌株选育,为工业化生产高活性抗生素、生物防治菌提供了依据。

4　结语
离子注入法诱变育种研究起步晚(始于1986),作用机理、离子种类和诱变规律需要进一步论证。

但无可置否,离子注入微生物育种具有更多的优点和发展潜力。

当然,离子注入的种类需要拓宽应用的范围,而不能只局限于几种离子(H+、N+、Ar+)。

菌体细胞的前期处理,以菌膜法或干孢法为主进入真空的靶室诱变,此环境对孢子活性影响不大,但对细菌的菌体细胞活性就难以评价,何况无菌体保护剂,温度小于50℃,脉冲注入次数多少不一,注入时间长短因种而异。

故很难保证菌体的高活性,所以注入方法需进一步探索。

目的基因的定位转移是一种高效的育种方法,我们应该充分的借助离子注入,进行微生物的DNA重组定位诱变育种,以期获得高附加值、高科技含量的发酵代谢产物。

离子注入育种技术作为一种新兴的交叉学科,显现了巨大的优势。

离子注入集化学诱变和物理诱变于一身,突变率高、操作简单。

加之离子束介导转基因的可能性,使其在微生物育种中更具有目的性和针对性。

随着研究程度的深入,研究范围的拓宽,相信离子注入法在微生物育种中能发挥巨大的作用。

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