第五章工业微生物诱变育种诱变剂
第五章引变育种及其他育种途径
太阳能育种
▪ 近年来研究的新课题。用聚焦阳光间歇地照射植物的种子、 幼苗、花粉、芽、或块茎等，可以促进植物生长发育，提 高产量，同时可诱发变异。有的国家称太阳能育种为“植 物光能学”。目前，以获得小麦、玉米、大豆、番茄等新 类型。照射过的黄瓜种子总产量可提高14%，早期产量可 提高17-20%，照射番茄种子获得的新品种产量比亲本高 30-50%，而且果实的质量好。
生命的基础和核心
非生命的基础和核心
辐 射 育 种
辐射育种成就
辐射育种发展很快，我国在粮食、油料、棉花、园 艺等多种作物上和家蚕、微生物等上育成100多个新品 种，并大面积推广应用。国际上也育成很多一流的品 种。辐射育种成为近代育种的重要手段。
你相信一株西红柿一次能结13000粒果吗？ 你见过能同时长3000多条黄瓜的黄瓜树吗？
➢ 生物学作用阶段 正常生物体内的平衡状态被打破，引起异常物质产 生，代谢环节失调，引起链锁反应，特别是当这种反应影响到细胞核 中染色体及核酸分子结构时，便可诱发可遗传的突变。
大量已研究表明：辐射诱发突变，既有纯粹机械力量（直接作用）， 也有复杂的化学过程（间接作用），两者的共同作用引起突变的产生。
辐射育种材料的选择
诱发“定向突变”困难，故要认真选择材料，选材原则：
▪ 根据育种目标选择亲本材料 亲本材料必须综合性状优良 而仅1-2个需要改进的缺点的品种、高世代品系作为诱变 材料，也可用F1代或杂种后代。选择材料避免单一化，可 用不同类型和品种
▪ 适当选用单倍体原生质体等作诱变材料 便于识别、选择 突变和突变选出后的固定及纯化。但辐射剂量要降低，且 需要对诱变材料提供好的营养和环境条件。
➢ 其他独特用途 如促进孤雌生殖；诱发染色体结构变异创造 不育性或无籽果实；诱发体细胞突变，创造果树及无性繁殖 植物的新品种等。
第五章 工业微生物诱变育种
株时，应选择多种遗传类型的菌株作为出发菌株比较
稳妥，容易在较短时期内达到育种目的。
8. 菌种代谢特点
了解菌种代谢特点有助于选择有效的出发菌株。 有人曾研究过肌苷酸产生菌的代谢特性，发现肌苷 酸的生物合成过程与肌苷、肌苷酸及核苷酸、磷酸 化酶的活性有关，如果从产生肌苷酸野生型的枯草 杆菌中筛选到降解酶活性低而磷酸化酶活性强的作 为诱变出发菌株，一般都能得到良好的诱变效果。
6. 药品和原材料质量
药品规格和原材料来源不同，都会影响菌种的质量。
四、了解菌种有效产物中的 各种组分在代谢 合成过程中与培养条件的关系
由棘孢小单孢菌(Micromonospora echinopora) 产生的庆大霉素，其中C1是有效的组分； C2是无效
的。在发酵过程中加入适量的磷或蛋白胨以及加大 通 风量都有利于C1的合成；反之，C2的比例就上升。
菌悬液由出发菌株的孢子或菌体细胞与生理盐水或 缓冲液制备而成。对菌悬液的制备有如下的要求：
1、供试菌株的孢子或菌体要年轻、健壮。
细胞要新培养的，细胞生理活性方面既要同步， 又要处在最旺盛的对数期，这样突变率高，重现性也 好。 霉菌孢子浓度约为：106ml-1，放线菌孢子浓度约 为：106~107ml-1。菌悬液通常采用生理盐水制备。如 果用化学诱变剂处理时，应采用相应的缓冲液配制， 以防处理过程中pH变化而影响诱变效果。
1. 对一般出发菌株的要求
（1）从自然界样品中分离筛选出来的野生菌株，虽 然产量较低，但对诱变因素敏感，变异幅度大，
正突变率高；
（2）在生产中使用的，具有一定生产能力，并且在 生产过程经过自然选育的菌株； （3）采用具有有利性状的菌株，如生长速度快、营 养要求低以及产生孢子早而多的菌株；
工业微生物菌种的选育——诱变选育（1）
工业微生物菌种的选育——诱变选育（1）工业微生物菌种的选育——诱变选育（1）来源：青岛海博优良菌株的选育的目的是防止菌种退、解决生产实际问题、提高产品质量和开发新产品。
选育的方法主要有基于基因突变的自然选育和诱变育种以及基于基因重组的杂交、原生质体融合、基因工程等。
诱变选育诱变育种是指利用各种诱变剂的物理因素和化学因素处理微生物细胞，提高基因突变频率，再通过适当的筛选方法获得所需的高产优质菌种的育种方法。
诱变育种具有速度快、方法简便等优点，是当前菌种选育的一种主要方法，使用普遍。
诱变育种的理论基础是基因突变，所谓突变是指由于染色体和基因本身的变化而产生的遗传性状的变异。
诱变育种的步骤与方法（一）、工业育种的一般步骤（图）（二）、诱变育种方案设计诱变育种方案包括突变的诱发、突变株的筛选和突变高产基因的表现。
1、出发菌株的选择工业上用来进行诱变处理的菌株，称为出发菌株。
出发菌株选择目前主要依据实际经验，总结如下：①以单倍体纯种为出发菌株；②采用具有优良性状的菌株；③选择对诱变剂敏感的菌株；④许多高产突变往往要经过逐步累积的过程，才变得明显，所以有必要多挑选一些已经过诱变的菌株为出发菌株，进行多步育种，确保高产菌株的获得。
2、出发菌株的纯化为什么要对出发菌株进行纯化呢？这是因为微生物容易发生变异和染菌，同时一般丝状菌的野生菌株多为异核体。
生产菌在不断移代过程中，菌丝间接触、吻合后，易产生异核体、部分结合子、杂合二倍体及自然突变株等。
这些都会造成细胞内遗传物质的异质化，使遗传性状不稳定。
通过纯种分离，从中挑选所需的优良菌株。
常用划线分离和稀释分离法，并结合显微镜操纵器分离单孢子。
3、单孢子悬液的制备诱变育种要求所处理的细胞必须是处于对数生长期同步生长的细胞，并且是均匀状态的单细胞悬液。
首先是细胞的生理状态对诱变处理也会产生很大的影响，如细菌在对数期诱变处理效果较好；霉菌或放线菌的分生孢子一般都处于休眠状态，所以培养时间的长短对孢子影响不大，但稍加萌发后的孢子则可提高诱变效率。
第五章工业微生物育种诱变剂
亚硝酸诱发的突变
HNO2 A T H C G C G C HNO2 A U A T
A:T
G┆C
19
亚硝酸的处理方法
1. 试剂的配制
（1）1mol/LpH4.5醋酸缓冲液
（2）0.1mol/L亚硝酸钠溶液 （3）0.07mol/LpH8.6磷酸氢二钠溶液
2.处理方法（以处理浓度0.025mol/L为例）
第五章 工业微生物育种诱变剂 本章内容：
化学诱变剂
物理诱变剂
生物诱变剂
•诱变：通过人为的方法，利用物理、化学因素处理微 生物以引起突变，这一过程称为诱发突变。
诱发突变(induced mutation)的发现
1927年，Muller 用X射线诱发果蝇遗传性状变异。
在第二次世界大战中，又发现化学物质氮芥也能导致细菌性状变
5-BU掺入后的复制错误
A:T
G ≡ BUe G≡ C
G≡ C
A: BUk
A:T
A:T
G ≡ BUe
A=BUk
A=T
G ≡ C→A=T
G ≡ BUe
G ≡C A: T → G ≡ C
G ≡ BUe
10
•由于5-BU的诱变作用是在DNA复制过程中实现的，因
此，处在静止或休眠状态的细胞是不适合的。
•细菌采用对数期的细菌，霉菌、放线菌采用孢子，
处理浓度为25—40μg/ml,混合均匀——取0.1—0.2ml菌悬液
加入到琼脂平板上涂布培养——在适宜温度下，使之在生长 过程中诱变处理——培养后挑取单菌落，进行筛选。
真菌、放线菌孢子，则要提高5-BU的浓度（0.1—1mg/ml）， 加到孢子悬液后，进行振荡培养数小时(一般6—12h)——分离
诱变育种是用物理或化学的诱变剂使诱变对象内的遗传物质
以选育高产突变株为例，诱变育种的基本环节概括如下：
可见，设计和采用效率高的筛选方案和方法 极其重要。
第一轮：
一个出发菌株→→→选出200个菌株→→→选出50株
（每瓶一株） 复筛
诱变处理
初筛
→→→选出5株
（每瓶四株）
40株 第二轮： 5个出发菌株→→→
诱变处理
40株
→→ → 选出50株 →→ →选出5株 40株
最适剂量的选择：产量性状的育种中多倾向于低剂量（致 死率在70~80%）
选择诱变剂的种类：在选用理化因子作诱变剂时，在同样 效果下，应选用最方便 的因素；而在同样方便的情况下，
则应选择 最高效 的因素。在物理诱变剂中，尤以紫外线 为最方便，而在化学诱变剂中，一般可选用诱变效果最为 显著的“超诱变剂”，如NTG。
ห้องสมุดไป่ตู้
简便有效的诱变方法：紫外线的照射最为方便。
化学诱变剂的种类、浓度和处理方法尤其是中止 反映的方法很多，实际工作时可参看有关书籍。一种较有 效的简易处理方法的大致操作步骤是：先在平板上涂上出 发菌株细胞，然后在平板上均匀地放上几颗很小的诱变剂 颗粒（也可放吸有诱变剂溶液的滤纸片），经培养后，在 制菌圈的边缘挑取若干突变菌落，分别制成悬浮液，然后 将其涂在一般平板表面使长出许多单菌落，最后可用影印 培养法或逐个检出法选出突变种。
表型迟延现象:指某一突变在DNA复制和细胞分裂后，才 在表型上显示出来，造成不纯的菌落。 产生原因： ①分离性迟延现象
②生理性迟延现象
3.诱变处理：
诱变剂的作用： ①提高突变的频率 ②扩大产量变异的幅度 ③使产量变异朝着正突变或负突变移动
剂量的表示法：不同种类和不同生长阶段的微生物对诱变 剂的敏感程度不同，所以在诱变处理前，一般应预先 作诱变剂用量对菌体死亡数量的致死曲线，选择合适 的处理剂量。—致死率是最好的诱变剂相对剂量的表 示方法。
微生物的诱变育种
（五）突变株的筛选
1. 初筛（以量为主） 初筛（以量为主） 方法需简便、快速
2步 步
初筛 复筛
（1）利用形态变异：需预先测定形态与产量的相关性 利用形态变异： （2）根据平板颜色反应直接挑选 透明圈法（蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶）； 透明圈法（蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶）； 抑菌圈法（抗生素）； 抑菌圈法（抗生素）； 变色圈法（柠檬酸）、显色圈（氨基酸）； ）、显色圈 变色圈法（柠檬酸）、显色圈（氨基酸）； 沉淀圈法（外毒素） 沉淀圈法（外毒素） 透明圈直径（ 透明圈直径（H）/菌落直径（C）：产量高低（初筛指标） 菌落直径（ ）：产量高低（初筛指标） 产量高低 2. 复筛（以质为主，定量测定） 摇瓶培养，直接检测所需产物 复筛（以质为主，定量测定） 摇瓶培养，
诱变育种的基本原则： 诱变育种的基本原则：
选择简便有效的诱变剂； 选择简便有效的诱变剂； 挑选优良的出发菌株； 挑选优良的出发菌株； 处理单细胞或单孢子悬液； 处理单细胞或单孢子悬液； 选用最适的诱变剂量； 选用最适的诱变剂量； 充分利用复合处理的协同效应； 充分利用复合处理的协同效应； 利用和创造形态、生理与产量间的相关指标； 利用和创造形态、生理与产量间的相关指标； 设计高效筛选方案； 设计高效筛选方案； 创造新型筛选方法。 创造新型筛选方法。
（2）筛选步骤（5步） ）筛选步骤（ 步
诱变处理 中间培养 淘汰野生型 检出缺陷型 鉴定缺陷型
①中间培养 ②淘汰野生型
CM或SM培养基，培养过夜 克服表型延迟 克服表型延迟。 CM或SM培养基，培养过夜。克服表型延迟。 培养基 即浓缩缺陷型， 即浓缩缺陷型，以提高检出率
抗生素法（ 细菌：青霉素；酵母菌和霉菌：制霉菌素） 方法 抗生素法（G+细菌：青霉素；酵母菌和霉菌：制霉菌素） 菌丝过滤法（丝状真菌、放线菌） 菌丝过滤法（丝状真菌、放线菌） 饥饿培养（ 饥饿培养（无N）MM 6~12 h 12 2N培养(2N)MM 2N培养(2N)MM 培养(2 1~2 h 2 加抗生素(或菌丝过滤) 加抗生素(或菌丝过滤)，培养过夜
第四章 工业微生物育种诱变剂
（三）紫外线诱变的步骤与方法： （1）出发菌株 细菌斜面培养到对数期，霉菌或放线菌则培养到孢子 刚成熟。 （2）前培养 对细菌类以肉汤为主，适量加人核酸类物质或酵母膏 等制成营养丰富的培养基，还可加人抑制修复的物质， 如咖啡碱或异烟肼等。 （3）制备菌悬液 单细胞：细菌约108 ml-1；放线菌约107～108ml-1， 霉菌约106 ml-1。 （4）紫外线照射 3-5ml，搅拌；避光，提前20min预热紫外灯。结 束时冰浴1-2h。
2．甲基磺酸乙酯（简称EMS） 甲基磺酸乙酯是磺酸酯类中诱变效果较好的一 种烷基化合物，外观呈粉末状或无色液体，难溶于 水，不稳定，易水解成无活性物质。 EMS的诱变处理方法： ①EMS母液的配制：为了安全和防上失效，配制前将 需用的器皿，置冰箱内预冷，然后在冰浴中进行配 制。取0.5ml EMS原液，加人到10 ml pH7.2磷酸缓 冲液中，加盖，并轻轻转动试管。由于在水溶液中 易失效，故尽可能低温保藏，并要现用现配。
2、辐射引起的生物效应，根据辐射种类和微生物种 类不同有所差异。 3、同一种辐射线对不同微生物的效应不一样，这与 每种微生物修复系统的强弱有关。
二、辐射引起生物效应的影响因素
1．微生物的遗传背景 ：G+C% 2．微生物的生理状态 3．可见光 4．细胞水分 5．温度 尤其对于电离辐射，较高温度能促进氧与自由基之间的相互作 用、加速与DNA发生的化学反应。在氧气充足的条件下要比在缺 氧条件下的电离辐射的生物学效应显著。
烷化剂主要是通过烷化基团使DNA分子上的碱基及 磷酸部分烷化，DNA复制时导致碱基配对错误而引起 突变，碱基中容易发生烷化作用的是嘌呤类。其中鸟 嘌呤N7是最易起反应的位点，几乎可以和所有烷化剂 起烷化作用；此外，DNA分子中比较多的烷化位点是 鸟嘌呤O6和胸腺嘧啶O4，这些可能都是引起突变的主 要位点。其次引起烷化的位点是鸟嘌呤N3、腺嘌呤N2， 腺嘌呤N7和胞嘧啶N3。这些位点引起碱基置换的仅占 烷化作用的10％左右。因此，由这些位点改变所引起 的突变仅是少数。 烷化剂也能造成磷酸和核糖之间的共价键断裂， 而造成突变。
第五章工业微生物育种诱变剂
突变的次要位点：鸟嘌呤的N3，腺嘌呤的N2、 腺嘌呤的N7、胞嘧啶N3
（二）烷化剂的性质
① 溶液烷化剂的性质比较活泼，不太稳定，在水溶 液中容易发生分解。
② 大部分半衰期很短，其长短与温度、溶液pH关系 很大。因此，化学诱变剂要现用现配还要避光。 配制烷化剂时，要采用合适的出缓冲液。
（6）稀释涂皿，后培养结束后，从中取一定量培养物，作不同稀释度，涂皿，并
且以未经紫外线照射过的菌悬液作对照，培养后，挑取菌落，以待筛选。
四、电离辐射
伦 琴 和
射 线
X
四川成都放60CO运输
河南杞县“杞人忧钴”
2. 电离辐射剂量
快中子：拉德（rad）；伦琴（R）
致死率达到50％～85％比较合适，诱变剂量大约在15～
1. UPF值是紫外线对未防护的皮肤的平均辐射量的比 值，UPF值越大，表明防紫外线性能越好。
2. 只有当UPF＞30时，并且UVA的透过率小于5％时，才 能称为防紫外线产品，防护等级标识为UPF30＋；
3. 而当UPF＞50时，则表明该产品的紫外线防护性能极 佳，防护等级标识为UPF50＋。
UPF范围 15－24 25－39
处理完毕后继续冰浴可降低或抑制修复酶的活性。
宇宙射线
五、近年来发展的新型诱变剂
1. 微波 微波对微生物的诱变效应有2个方面的因素，即
热效应和非热效应。 ① 热效应是指物料吸收微波能量，使温度升高从而 达到灭菌的效果； ② 非热效应则是在电磁波的作用下，生物体内不产 生明显的升温，却可以产生强烈的生物效应。
2-氨基嘌呤（AP）可以和胸腺嘧啶互配，但出 现亚氨基状态时，和胞嘧啶配对。
常用化学诱变剂的种类及作用机制
常用化学诱变剂的种类及作用机制(1)碱基类似物原理：通过异构体互变代替碱基进行复制，造成复制的错误。
(2)烷化剂原理：主要通过烷化基团使DNA分子上的碱基或磷酸部分被烷化，引起碱基结构的改变，导致碱基配对错误而引起突变。
(3)脱氨剂原理：亚硝酸的诱变机制主要是使碱基氧化脱去氨基。
(4)移码诱变剂原理：叩嚏类化合物是一种平面型的三环分子，与喋吟』密嚏碱基对的结构十分相似，因而能够插入DNA双链上两个相邻的碱基对之间，使DNA链拉长，两碱基间距离拉宽，使碱基插入或缺失，在DNA复制时造成点突变，以后的所有碱基都往后或往前移动，导致全体三联体密码转录、翻译错误而引起突变。
(5)羟化剂原理：羟胺只与C发生反应，可将C的氨基变为羟基，并与A 配对，能专一地诱发G：C碱基对到A：T碱基的转换第五章工业微生物代谢调控育种。
1.什么是代谢调控育种？它建立在什么基础上？答：微生物代谢控制育种是指以生物化学和遗传学为基础，研究代谢产物的生物合成途径和代谢调节的机制，选择巧妙的技术路线，通过遗传育种技术获得解除或绕过了微生物正常代谢途径的突变株，从而人为地使用有用产物选择性地大量合成积累。
建立在诱变育种的基础之上。
2.次级代谢受哪些遗传物质的控制？次级代谢产物有哪些？答：次级代谢除受核内DNA控制，还受核外DNA(质粒)的控制。
产物有抗生素、毒素、激素、色素、生物碱等。
3.反馈阻遏与反馈抑制的含义。
答：反馈抑制：是指最终产物抑制作用，即在合成过程中有生物合成途径的终点产物对该途径的酶的活性调节，所引起的抑制作用。
是一种负反馈机制，其中酶促反应的末端产物可抑制在此产物合成过程中起作用的酶。
这种抑制具有协同性、积累性和序贯性。
反馈阻遏：即在合成过程中有生物合成途径的终点产物对该途径的一系列酶的量调节,所引起的阻遏作用。
反馈阻遏是转录水平的调节，产生效应慢。
4.乳糖操纵子的组成成分有哪些？答：组成成分：启动基因、操纵基因、结构基因5.乳糖操纵子与色氨酸操纵子的区别？（有乳糖时，乳糖操纵子如何？有色氨酸时，色氨酸操纵子如何？）答：没有乳糖存在时，I基因编码的阻遏蛋白结合于操纵序列o 处，______处于阻遏状态，不能合成分解乳糖的三种酶；有乳糖存在时，乳糖作为诱导物诱导阻遏蛋白变构，不能结合于操纵序列，______被诱导开放合成分解乳糖的三种酶。
第五章 微生物基因工程育种
1960年，F.Jacob和J.Monmd提出了操纵元 （操纵子）的概念，揭示了原核生物基因表达 调控的重要规律。
基因的现代概念
移动基因（movable gene） 断裂基因（split gene） 假基因（pseudogene） 重复基因（repeated genes） 重叠基因（overlapping genes） 或嵌套基因（nested genes）
基 因 工 程 流 程 示 意 图
基因工程的应用
基因工程技术已经在医学、工业、 农业等各个领域得到了广泛的应用。
在医学上的应用
基因工程被用于大量生产过
去难以得到或几乎不可能得到的
蛋白质－肽类药物。
转基因动物和植物
转基因动物首先在小鼠获得成功。现在
转基因动物技术已用于牛、羊，使得从 牛/
第五章 工业微生物基因育种
王陶 2012年2月
目的与要求
了解和掌握基因工程育种的原理与方法； 了解基因工程的主要载体与基因定位诱变的 原理与方法。
教学重点：质粒的特性与基因工程操作原理 教学难点：基因定位诱变的原理
教学内容
1、概述 基因工程在微生物育种中的地位和作用，原理 2、基因工程载体 几种常见的载体 3、基因工程所用的酶 限制性内切酶，核酸酶，连接酶，聚合酶等 4、基因工程的主要步骤 5、基因定位诱变
孟 德 尔 研 究 的 七 对 性 状
豌豆杂交操作
孟 德 尔 分 离 律
孟 德 尔 自 由 组 合 律
黄圆 绿圆 黄皱 绿皱
1909年，丹麦的遗传学家W.
Johanssen 根据希腊语“给予生命”之义，创造了 “gene‖一词。但它只是一个抽象的单 位，并不代表物质实体。
现代工业微生物育种
现代工业微生物育种一、诱变育种诱变育种是通过使用物理或化学方法，如紫外线、X射线、化学诱变剂等，诱导微生物发生基因突变，从而产生具有新性状的菌株。
这种方法可以大幅度提高微生物的变异频率，为育种工作提供了丰富的材料。
二、基因工程育种基因工程育种是通过人工构建基因表达载体，将其导入到微生物中，从而实现基因的转移和表达。
这种方法可以定向地改造微生物的遗传物质，使其表达出所需的性状。
基因工程育种具有高度定向性和可预测性，是现代工业微生物育种的重要手段之一。
三、代谢工程育种代谢工程育种是通过改变微生物的代谢途径，提高其代谢产物的产量或改变代谢产物的性质，从而获得所需的菌株。
这种方法需要对微生物的代谢过程有深入的了解，并能够精确地调控其代谢网络。
代谢工程育种在现代工业微生物育种中具有重要的应用价值。
四、组合生物合成育种组合生物合成育种是通过构建多个基因的组合文库，并筛选出具有所需性状的菌株。
这种方法类似于基因工程育种，但具有更高的遗传复杂性，可以创造出更丰富的变异类型。
组合生物合成育种在现代工业微生物育种中已经成为一种重要的策略。
五、定向进化育种定向进化育种是一种模拟自然进化过程的育种方法。
它通过对大量随机突变体进行筛选和选择，以实现所需性状的定向进化和优化。
定向进化育种可以在短时间内获得高度适应特定条件的优良菌株，具有很高的应用价值。
六、菌种保藏与复壮菌种保藏与复壮是工业微生物育种的重要环节。
通过科学的保藏方法，可以保持菌种的活力和遗传稳定性；而复壮则是通过一定的手段使保藏的菌种恢复活力，以保证其用于生产的性能。
七、基因组编辑育种基因组编辑育种是利用基因编辑技术对微生物基因组进行精确的编辑和改造，以实现定向改良和创造新品种的目的。
目前常用的基因组编辑技术包括CRISPR-Cas9系统、ZFNs和TALENs等。
基因组编辑育种具有高度精确性和可控性，为现代工业微生物育种提供了强有力的工具。
工业微生物诱变育种PPT课件共37页
1、战鼓一响，法律无声。——英国 2、任何法律的根本；不，不成文法本 身就是 讲道理 ……法 律，也 ----即 明示道 理。— —爱·科 克
3、法律是最保险的头盔。——爱·科 克 4、一个国家如果纲纪不正，其国风一 定颓败 。—— 塞内加 5、法律不能使人人平等，但是在法律 面前人 人是平 等的。 ——波 洛克
5.2 营养缺陷型突变株的应用
工业微生物育种中，用于积累代谢中间产物 作为杂交、重组育种的遗传标记 用于微生物代谢途径研究 在转化、转导、原生质体融合、质粒和转座子研
究中用作标记菌株
6 温度敏感突变株的筛选P184
温度敏感突变株（temperature-sensitive mutant, TS突变体）： 突变株在一定温度范围内（许可温度）正常生长，其表型 和野生型没有区别，但超出这一温度范围（非许可温度）， 则不能生长或生长微弱甚至死亡（条件致死）或某些代谢 停止或减弱。
5. 1.2 淘汰野生型菌株 方法1：抗生素法
细菌：
用加有青霉素的基本培养基分离培养诱变处理后的 菌体，野生型菌株因为繁殖产生的子细胞不能合成正 常细胞壁而死亡，而对不能繁殖的营养缺陷型细胞因 为在基本培养基中不能繁殖而得以保留
具体方法和步骤见P176
5. 1.2 淘汰野生型菌株 方法1：抗生素法
TS突变主要是由必需基因发生突变，致使该基因在一定温 度条件下无法正常表达，或其编码的酶失活，造成细胞不 能正常生长。
6.1 TS突变株的选育方法
6.1.1 TS突变株的诱发 TS突变主要由基因错义突变所致，要选择易于引 起碱基置换的亚硝基类、磺酸酯类化合物，或亚 硝酸、UV等诱变剂。
6.1.2 淘汰野生型菌株/TS菌株富集培养 1 抗生素法：加入抗生素，在非许可温度下培养 一定时间，杀灭在该温度下生长的野生型菌株， 再离心除去抗生素，分离 2 其它方法 (P185) H3放射性同位素前体法
微生物诱变育种ppt课件
理想的工业生产菌种必须具备： 1. 遗传性状稳定 2. 纯净无污染 3. 繁殖力强、生长速度快、短时间内能产生所需产物 4. 能诱变产生遗传性变异 5. 具有产量高、收得率高
第一节 诱变育种的步骤
• 出发菌株的选择
• 单孢子（单细胞）悬液的制备
• 诱变剂及诱变剂量的选择 • 诱变处理方法 • 高产菌株的分离
2. 最佳剂量的选择： 经长期诱变后的高产菌株、遗传性状不太稳定的菌株， 宜用较温和的诱变剂和较低剂量处理。
要筛选具有特殊性状的菌株、较大幅度提高产量的菌株， 则用强诱变剂和高剂量处理。
对野生低产菌株，开始用高剂量，然后逐步用低剂量处 理。对多核细胞菌株，用高剂量处理。
四、诱变处理方式
诱变处理方式： 单因子处理：是采用单一诱变剂处理（一般突变率低） 复合因子处理：是指采用两种以上诱变因素处理（突变率高） 分下列几种情况：
连续诱变育种过程中如何选择出发菌株? 突变株的产量是数量遗传，只能逐步累加，一次性大幅度提 高发酵水平不太容易。 在选择出发菌株时，应挑选每代诱变处理后均有一些表型上 改变的菌株，如发酵单位有一定程度的提高、形态上发生过 一次变异或产生过回复突变的菌株等，以利于突变率的增加
灰黄霉素高产菌D-756诱变系谱菌株表型变异与产量递增的关系
一、出发菌株
对出发菌株的要求： 1. 对诱变因素敏感，变异幅度大，正突变率高 2. 具有一定生产能力 3. 具有有利性状，如生长速度快、营养要求低以及产孢子 早而多的菌株
4. 有时可考虑选择已发生其他变异的菌株作为出发菌株。 5. 采用一类被称为“增变菌株”的变异菌株，它们对诱变 剂的敏感性比原始菌株大为提高，更适宜作为出发菌株。 6. 在选择产核苷酸或氨基酸的出发菌株时，应考虑能累积 少量所需产物或其前体的菌株; 而在选择产抗生素的出发 菌株时，最好选择已通过几次诱变并发现每次的效价都 有一定程度提高的菌株作为出发菌株。
工业微生物育种学5
介绍几种烷化剂 及其诱变处理方法
Ⅰ亚硝基胍
亚硝基胍的结构式
亚硝基胍的性质
亚硝基胍是1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍的简称， 简写成NTG、NG或MNNG。
亚硝基胍为黄色结晶状物质，性质稳定，遇光易 分解，放出NO，颜色由黄变绿，诱变效应降低。 NTG不溶于水，须加助溶剂（甲酰胺或丙酮）
碱基类似物诱变的具体机制
正常的碱基存在着同分异构体，碱基类似物也 一样有同分异构现象，它是由电子结构改变引 起的。在嘧啶分子中异构现象以酮式和烯醇式 两种形式存在，在嘌呤分子中异构现象以氨基 和亚氨基两种形式存在。 一般互变异构现象在碱基类似物中比正常DNA 四种碱基中出现的频率高。而不同的异构体对 应的互补碱基是不同，由此造成基因的突变。
①取新鲜、年轻的斜面，用pH值一定的磷酸 缓冲液或tris缓冲液洗下细菌做成菌悬液。如 果细菌细胞或丝状菌孢子需进行前培养的，可 用有关培养基代替缓冲液，培养结束后离心洗 净，用同一种缓冲液做成菌悬液，浓度约控制 在106~107个/mL。 这一步的主要目的是使材料处于生长代谢的旺 盛期，有利于诱变。
脱氨基作用
脱氨基作用主要有三种变化： 腺嘌呤（A）变为次黄嘌呤（H）； 胞嘧啶（C）变为尿嘧啶（U）； 鸟嘌呤（G）变为黄嘌呤（X）。
腺嘌呤→次黄嘌呤
A→H时，第一次DNA 复制后次黄嘌呤不与 胸腺嘧啶（T）配对， 而与胞嘧啶配对，第 二次复制后，A：T就 变成了G：C。 脱氨基后碱基转换。
本节主要内容
介绍几种主要的化学诱变剂
二、化学诱变剂的种类
化学诱变剂种类
碱基类似物 烷化剂 脱氨剂 移码诱变剂 羟化剂 金属盐类 其他诱变剂
（一）碱基类似物
工业微生物育种复习题解析
工业微生物育种复习题解析第一章绪论1.什么是工业微生物？作为工业微生物应具备哪些特征？答：工业微生物：对自然环境中的微生物经过改造，用于发酵工业生产的微生物。
具备特征：(1)菌种要纯(2)遗传稳定且对诱变剂敏感(3)成长快，易繁殖(4)抗杂菌和噬菌体的能力强(5)生产目的产物的时间短且产量高(6)目的产物易分离提纯2.工业微生物育种的基础是什么？答：工业微生物育种的基础是遗传和变异。
3.常用的工业微生物育种技术有哪些？答：常用技术：(1)自然选育【选择育种】(2)诱变育种(3)代谢控制育种(4)杂交育种(5)基因工程育种第二章微生物育种的遗传基础1.基因突变的类型有哪些？答：有碱基突变，染色体畸变2.叙述紫外线诱变的原理？答：原理：紫外线对微生物诱变作用，主要引起DNA的分子结构发生改变（同链DNA的相邻嘧啶间形成共价结合的胸腺嘧啶二聚体），从而引起菌体遗传性变异。
3.基因修复的种类有哪些？答：种类：(1)光复活修复(2)切除修复(3)重组修复(4)SOS修复4.真核微生物基因重组的方式有哪些？答：方式：(1)有性杂交(2)准性生殖(3)原生质体融合第三章出发菌株的分离与筛选1.什么是富集培养？答：富集培养：指在目的微生物含量较少时，根据微生物的生理特点，设计一种选择性培养基，创造有利的生长条件，使目的微生物在最适的环境下迅速地生长繁殖，数量增加，由原来自然条件下的劣势种变成人工环境中的优势种，以利于分离到所需要的菌株。
2.哪些分离方法能达到“菌落纯”？哪些分离方法能达到“细胞纯（菌株纯）”？答：菌落纯：稀释分离法、划线法、组织法细胞纯：单细胞或单孢子的分离法3.分离好氧微生物常用的方法有哪些？答：(1)稀释涂布法(2)划线分离法(3)平皿生化反应分离法4.平皿生化反应分离法有哪些？分别用来筛选哪些菌？各自原理如何？答：(1)透明圈法原理：在平板培养基中加入溶解性较差的底物，使培养基混浊，能分解底物的微生物便会在菌落周围产生透明圈，圈的大小可以放映该菌株利用底物的能力。
[给学生]《微生物遗传育种学》复习思考题(1)
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[给学生]《微生物遗传育种学》复习思考题(1)2021级生物技术专业微生物技术方向《微生物遗传育种》复习思考题《微生物遗传育种》复习思考题01 绪论1、工业微生物菌种应具有哪些基本特征？非致病性；适合大规模培养工艺要求；利于规模化产品加工工艺；具有相对稳定的遗传性能和生产性状；形成具有商业价值的产品或具有商业应用价值。
2、简述工业微生物遗传育种的分类。
天然菌种（native strain）：通过自然筛选和分离获得的工业菌种；诱变菌种（mutagenized strain）：通过物理、化学等诱变剂在实验室人工诱变自然筛选与分离的菌株所获得产量或/和性状改善的工业菌种；重组菌种（recombinant strain）是通过遗传重组技术对菌种进行定向遗传改良获得的工业菌种；遗传修饰生物体（genetic modification organisms, GMOs）：经外源基因导入并因此发生遗传整合和性状改变的生物体。
3、试从微生物遗传学的不同角度阐述你对微生物多样性的认识。
一、微生物物种的多样性; 二、微生物遗传的多样性;三、微生物代谢的多样性 ;四、微生物的生态多样性;五、微生物利用的广泛性02 第四章工业微生物育种诱变剂1、什么是诱变剂？可分为哪几种类型？诱变剂：凡能诱发生物基因突变，并且突变频率远远超过自发突变率的物理因子或化学物质.可以分为三类：物理诱变剂；化学诱变剂：一类能对DNA起作用，改变DNA结构，并引起遗传变异的化学物质；生物诱变剂：采用某些噬菌体来筛选抗噬菌体突变菌株时，常常发现伴随着出现抗生素产量明显提高的抗性突变株。
因此，可以认为这些溶源性噬菌体是一种生物诱变剂。
2、什么是突变？突变的表现型有哪些？基因突变的特点有哪些？突变，从广义上讲，除了转化、转导、接合等遗传物质的传递和重组引起生物变异以外，任何表型上可遗传的突变都属突变范围，如染色体整倍性和非整倍性的变化及染色体结构上的畸变等都包括在内。
微生物育种[整理]
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工业微生物育种第一章绪论1.工业微生物菌种具备特征：1）菌种要纯2）目的产物的产量较高且稳定3）生长快，易繁殖4）抗杂菌和噬菌体的能力强5）微生物的发酵培养基来源广，价格低6）生产目的产物的时间短7）目的产物易分离纯化。
2.工业微生物育种的基础及作用：遗传与变异改良微生物并培育出各种有娘的工业微生物菌种。
3.工业微生物育种在发酵工业中的作用：不仅可以为发酵工业提供合适的菌种，还可不断提高发酵产品的产量和质量，甚至可培育出全新的菌种以生产新的发酵产品。
4.工业微生物育种的方法：1）自然选育（选择育种，通过改变群体的遗传结构，去掉不良细胞，使优良基因不断增加）2）右边育种（通过人工诱变剂）3）代谢控制育种（先诱变破坏微生物正常代谢）4）杂交育种（通过基因重组）5）基因工程育种第二章微生物育种的遗传基础1.原核微生物产生变异的方式：转化，转导，结合，原生质体融合。
2.真核微生物产生变异的方式：有性杂交，准性生殖，原生质体融合。
3.核基因：细胞核内的DNA即染色体上的DNA，是微生物生长繁殖的必需基因，直接控制初级代谢产物的合成，间接控制次级代谢产物的合成。
4.核外基因：是细胞质中的DNA，是微生物的非必需基因，与次级代谢产物的合成有关。
5.表型延迟：有些基因发生突变后，要经两代以上的繁殖复制，表型才能相应的改变。
6.基因突变的类型：1）碱基的变化（碱基置换，移码突变）2）染色体畸变（缺失，重复，倒位，易位等结构变化）3）染色体数目变异（包括染色体单条的变化和整倍的改变）4）遗传信息的变化（同义突变，中性突变，错义突变，无义突变）7.基因突变的修复机制：光复活修复，切除修复，重组修复，SOS修复。
8.基因突变与表型的关系：基因突变指生物体的遗传物质发生改变，从而引起表型的变异。
同义突变与中性突变表型不变，错义突变与无义突变表型改变。
9.原核生物基因重组的特点：通常只有部分遗传物质的转移和重组，形成部分二倍体再进行重组。
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本章内容
微生物育种诱变剂 微生物的诱变育种
第一节 微生物育种诱变剂
诱变剂是指那些能诱发基因突变、并使 突变率提高到超过自发突变水平的物理或 化学因子。
物理诱变剂
种类
化学诱变剂
生物诱变剂
诱变育种的特点
（1）提高突变率、扩大突变谱。 （2）改良单一性状比较有效，同时改良多
4、生物学阶段
持续时间长（甚至几个世代）,并可通过繁殖传递。 烷化自由基(R.)与生物大分子发生一系列反应，引 起生理和遗传损伤。 4.1 形态方面的表现 损伤：造成死亡，死亡率与辐射剂量成正比 生长：抑制生长等，与辐射剂量成正比 形态变异：菌落（体）、色泽大小变化。 生理变异：不能遗传，逐渐消失。 遗传变异：能遗传
细胞死亡
1、物理阶段 持续时间极短（10-5~10-8秒）。电离辐射产生能 量转移，在体内形成电离效应。
2、化学阶段 持续时间极短（10-5~10-8秒） 。形成大量的自 由基。
3、生物化学阶段 持续时间短（10~10-2秒） 。 大量的自由基与生物大分子发生化学反应，形成大 量的烷化自由基(R.)，将辐射效应转移到生物大分 子中。 烷化自由基持续时间长，并可通过繁殖传递。
非电离辐射：电子级能提高，但不产生离子。 电离辐射:能击中电子并产生正离子
（一）物理诱变剂的生物学效应
直接作用
间接作用
击中DNA或其它生物结构引起的能量吸收
物 激发和电离分子 理 物理-化学 重排
原初损伤
化学
分子的变化
环境中其它分子 激发和电离分子
重排 扩散自由基
生 物 突变 学
代谢 突变体
代谢 生物变化
（二）影响辐射效应的因子
①菌种的遗传背景和生理状态； ②可见光； ③水分； ④电离辐射诱变剂在氧气或空气中使用时，其辐
射效应一般要比在真空中或在惰性气体中时要 高； ⑤温度对电离辐射效应也有影响，主要是能改变 氧与自由基，或自由基相互间的作用程度。
（三）非电离辐射——紫外线
1、性质和来源 波长在40一390nm之间。由于DNA分子的紫外 光吸收值为260nm，因而波长在200-300nm的 紫外光才有诱变作用。紫外光源一般要求为发 射光谱集中在260nm附近的紫外光灯，灯管内 装有氖气的低压放电灯是较理想的光源，国内 一般采用30瓦的紫外光灯，光谱分布范围广， 诱变效率差。 特点：能量较低；对组织穿透力强.
4.2 生理方面的表现
生理方面的表现 ✓酶活性的变化 ✓POD（过氧化物酶）、 SOD 、CAT （过氧 化氢酶）、核酸酶 相关物质含量的变化 蛋白质、氨基酸、核苷酸 生长素、ABA（天然脱落酸）
4.3 遗传方面的表现
细胞核方面的表现: 细胞核扩大、松散（膨松 puffing） 微核细胞，微核细胞率与辐射剂量成正比 微核细胞率是评价遗传损伤的指标
结合的复合诱变效应
二、化学诱变剂
化学诱变剂是一些能和DNA起作用，改变 其结构，并引起遗传变异的化学物质。
碱基类似物 烷化剂 种类 移码突变剂 其他类
（一）碱基类似物
1、种类
胸
常
腺
用
嘧
啶
的
结
构
类
似
物
腺嘌呤的结构类似物
常 用
鸟嘌呤的结构类似物
2、碱基类似物作用机制
5-溴尿嘧啶（5-BU）是胸腺嘧啶的结构类似物也 是一种强诱变剂。它渗入到DNA中，会发生酮 式和烯醇式互变，不仅和原来的碱基配对而且和 其它碱基配对。
照射 ❖ 设备：紫外灯、磁力搅拌器、暗室、培养皿等; ❖ 紫外灯：波长为253.7nm,功率是15W; ❖处理时的照射距离：20cm — 30cm; ❖ 样品：要直接暴露在紫外灯下，厚度不能超过
3mm,照射时，要用磁力搅拌器搅拌。 注意：操作和培养时必需避免可见光直射液面， 最好在黄色或红色灯光下操作。
例5-BБайду номын сангаас诱发A-T变为G-C过程
染色体方面的表现: 断裂，形成染色体断片、环、桥等。 染色体畸变率与辐射剂量成正比 染色体畸变率是评价遗传损伤的指标
DNA方面的表现: DNA断裂、分解，形成单链结构 DNA非按时合成 存在自我损伤修复机制，提前进行DNA合成， 进行DNA损伤修复 生长素类物质促进DNA损伤修复 咖啡因、EDTA等拟制DNA损伤修复
后培养：1.5-2小时；
稀释涂皿
（四）、电离辐射
（五）新型诱变剂
❖ 微波:电磁波 ❖ 红外线：0.75～1000μm ❖ 激光：光量子流 ❖ 高能电子流：强电离辐射 ❖ 航天育种：利用返回式卫星进行农作
物新品种的选育的一种方法。
航椒1号
航茄2号
航 天 葫 芦
6、低能离子注入
过程：能量沉积、动量传递、离子注入和电荷 交换
2、紫外光的剂量
单位:尔格能量/mm2 (灯具发射强度随使用时间延长而下降。) 实际应用-相对剂量：照射时间、杀菌率来表示 杀菌率：90.0%-99.9% 时间：芽孢菌10min；
小芽孢杆菌营养缺陷型1-3min； 一般营养体3-5min； 无芽孢菌和革兰氏阳性菌0.5-2min。
3、诱变机理
时间：10－19－10－13s中间时发生。 特征：具有Y射线能量沉积引起机体损伤的；
动能交换产生的级联损伤，表现为遗传物质 原子转移、重排或基因的缺失；慢化离子、 移位原子和本底元素复合反应造成的化学损 伤以及电荷交换引起的生物分子电子转移造 成的损伤。
常用离子：通常采用N+、H+、Ar＋。 生物学效应：相当于物理和化学诱变两者相
嘧啶二聚体 DNA链的断裂 胞嘧啶与尿嘧啶的水和作用 DNA与蛋白质交联
4、操作方法
出发菌株 前培养；培养基丰富营养、细菌培养到
对数期、真菌孢子刚成熟； 制备菌悬液：处理液均用生理盐水制
备。细菌调节菌液浓度到108个/ml，真 菌约为106—107 /ml，放线菌则为l07— 108/ml.
个性状较困难. （3）性状稳定快，育种年限短。 （4）诱发突变的方向和性质尚难掌握。
一、物理诱变剂
物理诱变主要是由于高能辐射导致生物系统损伤， 继而发生遗传变异的一系列复杂的连锁反应过程。 常可以分为物理、物理-化学、化学、生物学阶段 (p35)。
包括紫外光、x射线、γ射线、快中子、α射线、 β射线和超声波等。其中紫外光沿用最广，诱变 抗生素高产突变株有很优异的效果。