离子注入技术

4.3 菌体存活曲线呈“马鞍型”
存活率是微生物育种中常测指标，存 活曲线是存活率的趋势直观表现。传统的 物理化学诱变方法均产生指数型或肩型存 活曲线，而离子注入诱变的存活曲线为先 降后升再降的“马鞍型”。这说明了离子 注入损伤小、突变率高的生物学效应。
4.3 菌体存活曲线呈“马鞍型”
N+注入辐照兽疫链球菌NN-7的存活率曲线
单细胞的获取

菌膜法（或干孢法）
取培养活化的菌体种子液或斜面活化的 菌苔进行稀释，一般是10-2—10-3 的稀释度， 菌体浓度为108—109个/ml为宜。 吸取适量的菌体稀释液涂布于无菌的玻 璃片或无菌培养皿上，显微镜检验保证无重 叠细胞，自然干燥或用无菌风吹干形成菌膜； 放入离子注入机的靶室（具有一定的真空度） 进行脉冲注入离子。要有无离子注入的真空 对照和空气对照。
1. 引言

微波诱变 原生质体诱变 离子注入诱变 原生质体融合育种 基因工程育种
2. 作用原理
离子注入法是利用离子注入设备产生高 能离子束（40—60kev）并注入生物体引起遗 传物质的永久改变，然后从变异菌株中选育 优良菌株的方法。 离子注入时，生物分子吸收能量，并引 起复杂的物理和化学变化，这些变化的中间 体是各类活性自由基，这些自由基可以引起 正常生物分子的损伤，可使细胞中的染色体 突变，DNA链断裂，也可使质粒DNA造成 断裂。
3. 装置与操作
3.1 离子注入装置——离子注入机
由离 子源、质 量分析器、 加速器、 四极透镜、 扫描系统 和靶室组 成。
3. 装置与操作
离子源：直接决定着注入离子的种类和束 流强度，它的作用是把需要注入的元素电 离成离子。离子源直流放电或高频放电产 生的电子作为轰击粒子，当外来电子的能 量高于原子的电离电位时，通过碰撞使元 素发生电离，碰撞后除原始电子外，还出 现正离子和二次电子。
5. 离子注入的应用

在发酵工业中的应用 在菌源性酶工程中的应用 在抗生素生产中的应用 离子束介导转基因技术在微生物中 的应用
5.1 在发酵工业中的应用

在发酵工业上，以高产菌株为出发菌株进 行诱变，提高发酵产物收率和品质，一直 是工业单位的常用手段。但传统诱变方法 的多次诱变往往导致负突变和抗性饱和。 而离子注入却能打破这一瓶颈，获得以目 标产物为目的的高产、优良菌株。
3. 装置与操作
正离子进 入质量分析器 选出需要的离 子，再经加速 器获得较高的 能量，由四极 透镜聚焦后进 入靶室，进行 离子注入。
3. 装置与操作
3.2 操作方法

材料选择：采用生理状态一致、处于对数生长期 菌体的单细胞；以菌丝生长的菌体利用孢子进行 诱变。
单 细 胞 获 取
菌膜法
涂孢法 培养法
单细胞的获取

Байду номын сангаас涂孢法
将稀释的菌体或孢子悬液涂布于合适的琼 脂平皿上，尽量减少细胞重叠，置于离子注入 机靶室，抽真空进行离子注入。

培养法
将菌悬液接种于培养基平皿上，待长出菌 落并产生大量孢子后，将平皿置于靶室，抽真 空后注入荷能离子诱变，常用于具有菌丝的微 生物，但不能保证菌体的高活性。
4. 离子注入法的特点
5.4 离子束介导转基因技术

宋道军等介导转基因提高 E.coli UV敏 感菌株的DNA损伤修复能力的实验证明 离子束介导转基因不仅适合于植物细胞， 而且对微生物细胞也是可行的，绝对转 化率为2.4%，比CaCl2 溶液诱导受体细 胞处于感受态进行转基因法高。
Summary
离子注入技术以较小的生理损伤得到 较高的突变率、较广的突变谱，而且具有 设备简单、使用方便，成本低廉、对人体 和环境无害等优点。加之离子束介导转基 因的可能性，使其在微生物育种中更具有 目的性和针对性。而离子注入不能仅局限 于几种离子（H+ 、N+ 、Ar+ ），应拓宽注入 离子的种类及应用范围。
微生物诱变育种 —离子注入技术
CONTENT
引言 离子注入法作用原理 装置与操作步骤 离子注入法特点 方法应用

1. 引言
菌种改良传统的诱变处理方法主要 包括以紫外线(UV)、X射线、γ射线、激 光等作为诱变介质的物理诱变方法；以 碱基类似物(5-BU)、烷化剂甲基磺酸乙 酯(EMS)和吖啶类移码突变剂等为诱变介 质的化学诱变方法；及以噬菌体、转座 子为诱变介质的生物诱变方法。
4.3 菌体存活曲线呈“马鞍型”
低剂量N+注入时，能量沉积效应和动量 转移效应的综合作用，导致了DNA损伤和 生物膜等大分子的损伤，造成了存活率下降。 中高剂量注入时存活率上升，可能N+注入后 电荷积累发挥了作用，激活了细胞的修复机 制和修复酶。高剂量N+时，细胞损伤程度大 于其修复能力；电荷效应也由于达到了临界 值，而产生库仑爆炸，保护屏障消失。
4.1
正突变菌体的高效性
4.2 菌体细胞表面刻蚀性
离子注入生物体的动量传递，可以根据直 观的表面现象进行观察研究，注入的离子就像 “手术刀”对细胞表面进行刻蚀，留下非常整 齐的创面。动量传递的结果引起生物组织或细 胞的表面溅射，造成细胞形态的变异，这实际 上是注入的离子在进入细胞过程中对细胞造成 的物理损伤。有研究表明，离子注入微生物细 胞的动量转移，同样导致细胞表面的刻蚀，且 菌体刻蚀程度及修复能力随注入剂量的不同而 有差别。
5.3 在抗生素生产中的应用


抗生素（利福平霉素、之江霉素、抗真菌 素等）选育高产菌株方面的应用也非常成 功，为工业生产高活性抗生素、生物防治 菌提供依据。 赵洪英等用N+注入庆大霉素产生菌成熟孢子， 经筛选得到了高产突变菌种，其生产抗生 素能力提高27.39%，成果显著。
5.4 离子束介导转基因技术
5.2 在菌源性酶工程中的应用



惠友权等以5×1016N+/cm2 的剂量处理地衣 芽孢杆菌，选育了一株胞内α—乙酰乳酸脱 羧酶菌株，酶活提高了40%，且性状稳定 李平等以注入离子结合传统方法协同诱变 黑 曲 霉 ， 选 育 出 β— 葡 萄 糖 苷 酶 活 达 17U/mL的高产菌株 龚家顺等在研究单宁酸酶转溶红茶“冷后 浑”效果时，也用N+注入黑曲霉9701的孢 子进行菌株改良，获得一株酶活高达 34.5mol/s的菌株，提高了268%。
5.1 在发酵工业中的应用


许安等以生产VC的2—酮基—L—古龙酸高 产菌系为出发菌株进行离子注入育种，选 育出了高产菌系：糖酸转化率提高15%一 20%、4代传种平均转化率达95％，并进行 了培养基优化和摇瓶发酵检测，为所选的 IPPM-1028菌系的扩大生产提供了依据 虞龙等利用H+ 、N+ 、Ar+ 三种离子注入VC 发酵菌—巨大芽孢杆菌，确定了最佳的离 子注入剂量，选出了4株改良菌株进行工业 化生产。
Summary
目的基因的定位转移是一种高效的育 种方法，应该充分借助离子注入，进行微 生物的DNA重组定位诱变育种，以期获得 高附加值、高科技含量的发酵代谢产物。 离子注入育种技术作为一种新兴的交叉学 科，已开拓的课题尚处于初级阶段，许多 新课题尚有待进一步研究。

正突变菌体的高效性 菌体细胞表面刻蚀性 菌体存活曲线呈“马鞍型”


4.1
正突变菌体的高效性
离子注入诱变育种的特点，表明了其是 一种物理效应、化学效应，是集化学诱变、 物理诱变为一体的综合诱变方法。它能够引 起染色体的畸变，导致DNA链碱基的损伤、 断裂，从而使遗传物质在基因水平或分子水 平上发生改变或缺失，大幅提高变异的频率。 特别是在工业微生物育种方面，为筛选高效 的正突变菌株提供了更 广阔的空间。


离子束作为一种新的诱变源，以高突变率 和诱变效率进行微生物菌种改良已在生产 实践中得到广泛的应用，并取得了显著的 经济效益和社会效益。 离子束介导转基因是利用低能离子束对细 胞的刻蚀作用原理设计出的一种新的转基 因方法，注入离子对细胞的刻蚀可使细胞 由表及里形成微孔或洞。供体DNA片段可 顺利地通过这些微孔或洞进入受体细胞。
2. 作用原理
离子注入对生物体的作用集动量传递、 能量、质量沉积和电荷的中和与交换于一 体。 能量沉积：注入的离子与生物体大分子发 生一系列碰撞并逐步失去能量，而生物大 分子逐步获得能量进而发生键断裂、原子 被击出位、生物大分子留下断键或缺陷。
2. 作用原理
质量沉积：注入的离子与生物大分子形 成新的分子 动量传递：会在分子中产生级联损伤 电荷交换：引起生物分子电子转移造成 损伤，从而使生物体产生死亡、自由基 间接损伤、染色体重复、易位、倒位或 使DNA分子断裂、碱基缺失等生物学效 应。
4.1

正突变菌体的高效性

龚家顺等在研究单宁酸酶生产菌（黑曲霉） 诱变过程中，发现N+注入黑曲霉可获得较UV 诱变更高的正突变率和更大的变异幅度。 UV诱变的菌株负突变率高，子代孢子生长 缓慢，发酵单位普遍低于N+注入诱变结果。 离子注入VC二步发酵混合菌育种，选育出 了高产菌株已经进入工业化生产。离子注 入能够克服传统诱变方法正突变率低的特 点，减弱菌种多次诱变产生的饱和性、抗 性，提高工业微生物的发酵水平。