Neon电转染操作步骤

Protocol for Neon transfection system (100 μl Tips) 电穿孔技术的原理

电穿孔技术是利用脉冲电场改变细胞膜的状态和通透性,达到将DNA导入细胞以及促使细胞发生融合的目的。该技术目前一方面应用于细菌、真菌、植物、昆虫和哺乳动物细胞的基因转移,另一方面应用于细胞融合,制备杂交细胞和动物克隆等

影响电穿孔效率的因素

电场强度:电压太低时,细胞膜的改变不足以允许DNA分子通过,而电压过高时又会造成细胞的不可逆损害。对于大多数哺乳动物细胞而言,250~2500V/cm的电压可获得有效转染[2,3]。电脉冲形状和长度:电脉冲形状主要有指数衰减式和方波两种,一般需20~100毫秒。缓冲液:通常使用甘露醇和蔗糖等非离子缓冲液,但有报道认为HEPES缓冲液的转染效率更高,血清也可以提高转染效率[4]。其它诸如转染温度、DNA浓度和构象等均会对转染效果产生影响。

1.Cultivate the required number of cells (5×105-2×106 adhere cell per each 100ul Neon Tip),

the cells should be 70-90% confluent on the day of experiment. 实验前培养足够量的细胞（对于100ul的tip，每个tip需要5×105-2×106 贴壁细胞，可以根据实际情况调整），并使其在实验当天达到70%-90%的汇合度。

2.Pre-warm an aliquot of culture medium containing serum, DPBS and so on.预热实验所需的

culture medium，DPBS等。

3.Prepare 6-well plate by filling the wells with 2.0 ml of culture medium containing serum and

supplements without antibiotics and pre-incubate plate in a humidified 37℃/5% CO2 incubator. 准备6孔板，在每孔中加入2.0 mL 不含抗生素的正常培养基，放到倒培养箱中预热。

4.Aspirate the media from cells and rinse the cells using DPBS, trypsinize the cells using

Trypsin/EDTA, after neutralization, harvest the cells in growth medium with serum. 用DPBS漂洗细胞两次，加入Trypsin/EDTA消化细胞，再加入生长培养基终止消化，收集细胞。

5.Count cells to determine the cell density, transfer enough cells for Neon transfection into a

1.5 ml microcentrifuge tube or a 15 ml cornial tube and centrifuge the cells at 100-400 × g

for 5 minutes at room temperature. 对消化的细胞进行计数，确定细胞的密度，取出足够转染用的细胞，转移到新的1.5 mL 或者15 mL的离心管中，100-400 × g，室温离心5min。

6.Wash the cells with DPBS by centrifugation at 100-400 ×g for 5 minutes at room

temperature. 用DPBS漂洗一次，同上条件离心。

7.Aspirate the DPBS and resuspend the cell pellet in Resuspension Buffer R in a final density

of 1.0 × 107 cells/mL. Gently pipette the cells to obtain a single cell suspension. 弃DPBS,用适量的Buffer R重悬细胞，使细胞密度达到1.0 ×107 cells/mL.（该密度仅适用于每个

tip转染1×106个细胞的情况，其他情况可根据每个tip转染的细胞量进行调整）

8.Add appropriate amount of plasmid DNA/siRNA into the cells. Set up a Neon Tube with 3

mL Electrolytic Buffer into the Pipette Station. 按需加入质粒或siRNA，在电击座中加3 mL buffer E，放到电击台上。

9.Perform the Neon transfection. 按操作说明进行电击。

10.Transfer the electroporated cells into the prewarmed culture plates.将电击过的细胞转移到

预热的6孔板中。

11.Gently rock the plate back and forth, incubate it at 37℃in a humidified CO2 incubator. 轻

柔的前后摇晃孔板几次，放入培养箱培养。

12.收拾、整理实验所用的仪器，材料等，做到“三还原”