Neon电转染操作步骤
转染步骤及经验(精华)
转染步骤及经验（精华）
一、基础理论
转染是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。分类：物理介导方法：电穿孔法、显微注射和基因枪；化学介导方法：如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术；生物介导方法：有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。病毒介导的转染技术，是目前转染效率最高的方法，同时具有细胞毒性很低的优势。但是，病毒转染方法的准备程序复杂，常常对细胞类型有很强的选择性，在一般实验室中很难普及。其它物理和化学介导的转染方法，则各有其特点。需要指出的一点，无论采用哪种转染技术，要获得最优的转染结果，可能都需要对转染条件进行优化。影响转染效率的因素很多，从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态到转染方法的操作细节（见后文）。
二、转染操作流程（以常用的6孔板为例）
(1) 细胞培养：
取6孔培养板，以3x104/cm2密度铺板，37℃5%CO2培养箱中培养至70%～90%汇合。(不同细胞略有不同，根据实验室优化的条件进行，汇合过分，转染后不利筛选细胞)。
(2) 转染液制备：
在EP管中制备以下两液(为转染每一个孔细胞所用的量)
A液：用不含血清培养基稀释1-10μg DNA，终量100μL，
B液：用不含血清培养基稀释对应量的转染试剂，终量100μL；
轻轻混合A、B液（1:1混匀），室温中置15分钟，稍后会出现微浊现象，但并不妨碍转染。
(3) 转染准备：用2mL不含血清培养液漂洗两次，再加入2mL不含血清及PS的培养液。
电转细胞实验转染细胞方法
电转细胞实验转染细胞方法
1) 细胞铺板，使细胞在电转当天有70~90% 汇合率；
2) 配置RNP 反应体系
3) 20 分钟之内，用胰酶消化细胞，并洗去迹量的胰酶（胰酶残留
会造成其对Cas9 蛋白的降解），重悬细胞到10 mL 培养基中，
并计数；
4) 取5 倍于0.2~1×10 6 细胞量到新的EP 管中，500×g 离心5 分钟收集细胞，并用PBS 清洗一次细胞，重新离心；
5) 使用5 倍于30 μL 电转液重悬细胞；
6) 准备预先在24 孔（0.5 mL）或6 孔（2 mL）板中加入适量培养基，用于后期电转细胞培养；
7) 将30 μL 电转液重悬细胞加入到各RNP 反应EP 管中，并轻轻混合；
8) 取60 μL RNP 和细胞混合液到吉玛电转仪（96 孔电转），使用300V，电击6 次；
9) 立即将电转后细胞转移到培养板中，在细胞培养箱中培养48~72小时。
lonza和伯乐电转方法
lonza和伯乐电转方法
Lonza和伯乐电转方法是两种与细胞工程和基因编辑相关的技术。本文将分别介绍这两种方法的原理和应用。
我们来了解一下Lonza电转法。Lonza电转法是一种常用的细胞转染技术，用于将外源DNA导入到目标细胞中。其原理是利用高压电脉冲破坏细胞膜，从而使DNA能够穿透细胞膜进入细胞质，并在细胞内表达。这种方法通常适用于多种细胞类型，包括哺乳动物细胞和真核生物细胞。
Lonza电转法的操作相对简单，一般分为三个步骤：细胞培养、DNA转染和筛选。首先，需要将目标细胞培养至适当的密度和状态。然后，将外源DNA与转染试剂混合，形成复合物。接下来，将复合物加入目标细胞中，并施加高压电脉冲。这些电脉冲会破坏细胞膜，使得DNA能够进入细胞质。最后，通过选择性培养基或标记基因等方式筛选出成功转染的细胞。
Lonza电转法在生物医学研究和生物制药领域有广泛应用。例如，科学家们可以利用这种方法将外源基因导入到细胞中，从而研究该基因在细胞功能和疾病发生机制中的作用。此外，这种方法还可以用于生产重组蛋白、病毒载体等生物制品。
接下来，我们来了解一下伯乐电转方法。伯乐电转方法是一种基因编辑技术，用于改变细胞中的基因组。其原理是利用CRISPR-Cas9
系统，通过设计特定的引导RNA和Cas9核酸酶，精确地切割目标DNA，从而导致基因组的改变。
伯乐电转方法的操作相对复杂，主要包括设计引导RNA、合成引导RNA和Cas9核酸酶、转染和筛选等步骤。首先，需要设计合适的引导RNA，使其能够与目标DNA序列特异性结合，并指导Cas9核酸酶切割该DNA序列。然后，将合成的引导RNA和Cas9核酸酶转染到目标细胞中。在细胞内，Cas9核酸酶会与引导RNA结合，形成CRISPR-Cas9复合物，进而识别和切割目标DNA。最后，通过PCR、测序等方法筛选出成功编辑的细胞。
电转染标准步骤
电转染标准步骤
1.清洗电转杯，将电转杯置于75%酒精中浸泡2小时，然后在紫外灯下照射后即可使用。
2.电穿孔前一天，以合适密度传代细胞，使细胞在转染前出于对数生长期。对于原代培养细胞，一般培养2-3天后，细胞单层融合度可以达到70-80%，即可开始试验。
3.PBS洗细胞2次后，胰酶消化细胞2min，待细胞变圆后，用完全培养基终止消化。
4.轻轻吹下细胞成单细胞悬液后，1200rpm室温离心5min。
5.完全弃去上清，根据细胞数量，加入适量的电转缓冲液重悬细胞（一般为0.5-0.6ml左右），并上下吹打均匀。
6.加入适量相应浓度的待转染核酸至相应的终浓度（质粒为20ug/ml，SiRNA的终浓度为100nM），上下吹打均匀。若以0.5ml计算，所需质粒为0.5×20=10ug。
7.将含有相应浓度核酸的细胞悬液转移入相应规格的电转杯中，按照预定条件设置参数，进行电击操作。（不同细胞电转前，需要进行预试验摸索电转的最佳条件，既要保证较高的转染效率，又要保证较高的细胞存活率。经过实践摸索后得出，相应的最佳参数为：质粒：250V，10ms，1（最多2），0，4mm cuvette；SiRNA: 250V，5ms，1（最多2），0，4mm cuvette。
8.电击完成后，将电转杯置于恒温培养箱中8-12min，以使核酸充分进入细胞。
9.将电击杯从恒温培养箱中取出，接种细胞悬液于预热的培养基中，上下吹打均匀后，置于培养箱中正常培养。
10.正常培养4h，待细胞贴壁后，给细胞换新鲜的完全培养基，以去除上层的死细胞。
转染步骤及经验（精华）
转染步骤及经验（精华）
转染步骤及经验（精华）
一、基础理论
转染是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。分类：物理介导方法：电穿孔法、显微注射和基因枪；化学介导方法：如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术；生物介导方法：有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。病毒介导的转染技术，是目前转染效率最高的方法，同时具有细胞毒性很低的优势。但是，病毒转染方法的准备程序复杂，常常对细胞类型有很强的选择性，在一般实验室中很难普及。其它物理和化学介导的转染方法，则各有其特点。需要指出的一点，无论采用哪种转染技术，要获得最优的转染结果，可能都需要对转染条件进行优化。影响转染效率的因素很多，从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态到转染方法的操作细节（见后文）。
二、转染操作流程（以常用的6孔板为例）
（1）细胞培养：
取6孔培养板，以3x104/cm2密度铺板，37C 5%CO2培养箱中培养至70%?90%汇合。（不同细胞略有不同，根据实验室优化的条件进行，汇合过分，转染后不利筛选细胞）。
（2）转染液制备：
在EP管中制备以下两液（为转染每一个孔细胞所用的量） A液：用不含血清培养基稀释1-10卩g DNA终量100 yL, B液：用不含血清培养基稀释对应量的转染试剂，终量100 uL
轻轻混合A、B液（1:1混匀），室温中置15分钟，稍后会出现微浊现象，但并不妨碍转染。
（3）转染准备：用2mL不含血清培养液漂洗两次，再加入2mL 不含血清及PS的培养液。
转染步骤及经验(精华)
转染步骤及经验（精华）
一、基础理论
转染是将外源性基因导入细胞内地一种专门技术.分类：物理介导方法：电穿孔法、显微注射和基因枪；化学介导方法：如经典地磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导地技术；生物介导方法：有较为原始地原生质体转染，和现在比较多见地各种病毒介导地转染技术.理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点.病毒介导地转染技术，是目前转染效率最高地方法，同时具有细胞毒性很低地优势.但是，病毒转染方法地准备程序复杂，常常对细胞类型有很强地选择性，在一般实验室中很难普及.其它物理和化学介导地转染方法，则各有其特点.需要指出地一点，无论采用哪种转染技术，要获得最优地转染结果，可能都需要对转染条件进行优化.影响转染效率地因素很多，从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态到转染方法地操作细节（见后文）.
二、转染操作流程（以常用地孔板为例）
()细胞培养：
取孔培养板，以密度铺板，℃培养箱中培养至～汇合.(不同细胞略有不同，根据实验室优化地条件进行，汇合过分，转染后不利筛选细胞).
()转染液制备：
在管中制备以下两液(为转染每一个孔细胞所用地量)
液：用不含血清培养基稀释μ ，终量μ，
液：用不含血清培养基稀释对应量地转染试剂，终量μ；
轻轻混合、液（混匀），室温中置分钟，稍后会出现微浊现象，但并不妨碍转染.
()转染准备：用不含血清培养液漂洗两次，再加入不含血清及地培养液.
()转染：把复合物缓缓加入培养液中（缓慢滴加），轻轻摇匀，℃温箱置～小时，吸除无血清转染液，换入正常培养液继续培养.
Neon细胞电转仪中文使用说明(MPK5000)
一，简单的3步骤程序。
1.将收集到的细胞和待转染的分子（例如DNA，RNA，siRNA）的混合物加入到提取物中。
2.将带专用枪头的移液器插入带有电极杯的移液器座中; 在设备上选择程序，然后按开始。
3.拔下移液器，将转染的细胞转移到含有适当培养基的培养容器中。
注：1.为了避免污染，强烈建议只使用电极杯10次。建议在切换到不同质粒DNA / siRNA或细胞类型时更换电极杯和缓冲液2.为了确保重复性和排除转染条件的变化，建议不要使用枪头超过2次
二，软件操作程序
1.按下电源开关（位于设备背面，第vii页）打开Neon®设备。本机检查确保Neon®移液器站已连接到设备，然后显示启动屏幕。
2.按Voltage启动数字键盘输入电压值。按所需的电压值，然后按Done保存该值。注意：如果任何输入值超出限制，则会显示错误信息，并自动设置最小的限制值。
3.按Width激活数字键盘输入宽度值。按所需的宽度值，然后按Done保存该值。
4.按Pulses激活数字键盘以输入脉冲值。按所需的脉冲值，然后按Done保存该值。
5.如果要保存这些电穿孔参数，请按主屏幕上的“Save”将程序保存在数据库中。
6.按所需的程序号码编辑程序。选定的程序会突出显示。
7.显示“Edit”屏幕后，按键盘按钮输入用户名。光标自动移动到下一个字段协议，并突出显示为红色。继续输入Voltage，Width和Pulses信息。
8。按Enter键将信息保存在数据库中。
9.继续准备细胞和DNA，并设置用于电穿孔的移液器座
三，细胞与DNA混合物准备
Lonza核转染技术与操作
Lonza核转染技术的优势与操作
Nucleofector技术是Lonza公司的专利创新技术，它综合应用传统的电穿孔技术及细胞特异性细胞核转染液，通过调整优化的电转参数（内存转染程序），直接把外源基因导入原代细胞及细胞系的细胞浆和细胞核中。它不同于传统的电穿孔仪，因为它可以把外源基因直接导入核中，而且细胞存活率远远高于电穿孔仪。
Nucleofector技术是独一无二的，因为它可以直接将DNA转染到细胞核内，因此实现了因受到细胞分裂限制而一直困扰人们的原代细胞的高效率转染。在Nucleofector核酸转染仪的帮助下，您可以在肿瘤研究、免疫学、组织工程学及心血管疾病研究领域中轻而易举地获得大于90％的高效率基因转染率。Nucleofector核酸转染技术特别适用于转染原代细胞和难以转染的细胞系，如T细胞及PC-12细胞系等。
Nucleofector试剂盒包含两个溶液：Nucleofector溶液和添加剂。两者都是针对每个细胞类型来特异开发的。它们在核转染过程中提供了细胞友好的环
境，支持DNA直接到达细胞核。Nucleofector溶液只与Nucleofector装置共同使用时，才能发挥作用。
Nucleofector细胞转染技术的优势：
1.不依赖细胞的有丝分裂，适用于悬浮细胞、原代细胞等难转染细胞。
2.高转染效率，直接将外源基因转入核内。
在某些细胞中Nucleofector的转染效率可以达到90%，与病毒感染同样有效。Nucleofector直接将DNA运送到细胞核中，因此，基因表达就可以立即开始，数小时内就可以完成转染和分析的全过程，对于细胞系来说2-6小时就可以分析，对于原代细胞则需要4-16小时。
电转染操作流程
Neon TM
电转染一般流程
1． 电穿孔前一至两天，将细胞转移至装有新鲜培养基的培养皿中，保证实验当天细胞量达
到70-90%。
2． 加培养基（不含抗生素）到24孔板中，每孔500µl ，放于37℃培养箱预热。（注：使用
其他孔数培养板或者100µl 枪头时，加入培养基和质粒及细胞的数量见下表1） 3． 将培养细胞取出，悬浮细胞直接取部分培养的细胞计数，确定细胞密度；贴壁细胞用2ml
的PBS 冲洗细胞，吸出PBS ，加入约750µl 胰酶消化3min ，加入750µl 培养基，终止消化，取部分细胞悬液进行细胞计数，确定细胞密度。
4． 将悬浮细胞转到离心管，室温下100-400g 离心力离心5min ，倒掉上清。 5． 向细胞中加入2mlPBS 冲洗细胞，室温下100-400g 离心力离心5min 。
6． 吸出PBS,用重悬缓冲液R 重新悬浮细胞沉淀，最终使细胞密度为2.0×107个/ml 。轻轻
吹打细胞，使其形成单细胞悬液。（注：细胞悬液在室温时间不能超过15-30min ,否则将导致细胞活性和转染效率降低）
7． 将适量质粒加到1.5ml 离心管中，再加入细胞悬液，轻轻混匀。所用细胞浓度、DNA 和
接种体积见下表1）。
8． 将装有3ml 电解缓冲液E 的Neon TM 管插入移液器架中。 9． 在仪器上设置脉冲电压、脉冲宽度、脉冲数。 10．将枪头插入NeonTM 移液器中，用10µl 的枪头吸细胞混合液，枪头中必须无气泡。将带有样品的NeonTM 移液器垂直插入NeonTM 管中。
11．选择电穿孔方案，并按下触摸屏上的Start （开始）键。 12．电脉冲释放后，触摸屏上会显示完成，提示电穿孔完成。 13．将脉冲好的样品立即转移至准备好的装有预热培养基的培养板中。将培养板放到培养箱培养。
转染步骤范文
转染步骤范文
转染是指将外源DNA导入到受体细胞中的过程，用于基因工程、基因治疗等研究和应用。转染步骤是实现转染的关键步骤，包括细胞培养、转染试剂制备、转染试剂处理、细胞培养和分析。以下是转染步骤的详细描述。
第一步：细胞培养
在进行转染实验之前，首先需要培养并扩增所使用的细胞。细胞的培养基因常见的有DMEM、RPMI等，培养基中会添加适当的酵素抑制剂（如胰酶）和生长因子，以促进细胞的生长和增殖。
第二步：转染试剂制备
转染试剂可以是化学试剂，也可以是病毒载体或质粒DNA。化学试剂常见的有聚乙烯亚胺（PEI）、脂质体、阳离子聚合物等。病毒载体包括腺病毒、逆转录病毒、腺相关病毒、大肠杆菌之Coli phage等。质粒DNA则是将外源DNA经过酶切和纯化处理得到的。
第三步：转染试剂处理
在这一步中，将转染试剂与细胞一起孵育，以使转染试剂与细胞内部的DNA互相结合。转染试剂的使用方法根据具体试剂的特点而定，常见的方法有磷酸钙共沉淀、脂质体包裹、病毒载体包装等。
第四步：细胞培养和分析
在细胞孵育一定时间后，可以对转染效率进行分析。常见的分析方法包括荧光显微镜观察、流式细胞术、PCR等。通过这些分析方法，可以观
察到转染后的外源DNA是否成功导入到细胞，并根据实验需要进行下一步操作。
除了以上步骤，还有一些实验时需要注意的要点，例如选择合适的细胞密度和培养时间、优化转染条件、进行有效杀菌等。同时，也需要仔细阅读相关实验操作手册，并参考先前类似研究的文献，以确保实验的准确性和可重复性。
总结起来，转染步骤是进行基因转染的重要环节，包括细胞培养、转染试剂制备、转染试剂处理、细胞培养和分析。通过精确执行每个步骤，并结合适当的方法和实验操作要点，可以高效地将外源DNA导入到受体细胞中，实现基因工程和基因治疗等研究和应用的目的。
如何进行高效电转染实验？(Entranster)
要想做好细胞的电转染实验，应注意以下几点：
1. 选择合适的电场强度
合适的电场强度对于电转染实验非常重要，电场强度不能过高，过高会增加细胞的死亡率；也不能过低，过低不能增加膜的通透性或在膜上形成小孔。不同细胞系具有不同的最佳场强值，实验前应测定所转染细胞系的最佳电场强度。
2. 选择合适的细胞
用于电转的细胞一般选取处于对数生长期的细胞（15代以内，传代后2d）。因为处于对数生长期的细胞分裂旺盛，表面结构致密比稳定期的细胞差，电转后，细胞膜的恢复能力强，而且处于有丝分裂期的细胞更容易接受外源DNA.
3. 质粒质量要好
应选择纯度高的质粒，首先DNA／RNA应该超纯(A260／A280>1．8)，其次应不含内毒素，同时质粒应溶于双蒸水而不是TE缓冲溶液。另外，DNA浓度不宜过高。
4. 选择合适的电转染试剂
电击会对细胞造成一定程度的伤害，在转染试剂的选择上要注意，应选择具有细胞膜修复成分的电转染试剂，如engreen的Entranster-E，可将电击对细胞的损伤降到最低。并且，Entranster-E可适用于lonza、Bio-rad、BTX等多种电转仪。
转染步骤及经验(精华)
转染步骤及经验（精华）
一、基础理论
转染是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。分类：物理介导方法：电穿孔法、显微注射和基因枪；化学介导方法：如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术；生物介导方法：有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。病毒介导的转染技术，是目前转染效率最高的方法，同时具有细胞毒性很低的优势。但是，病毒转染方法的准备程序复杂，常常对细胞类型有很强的选择性，在一般实验室中很难普及。其它物理和化学介导的转染方法，则各有其特点。需要指出的一点，无论采用哪种转染技术，要获得最优的转染结果，可能都需要对转染条件进行优化。影响转染效率的因素很多，从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态到转染方法的操作细节（见后文）。
二、转染操作流程（以常用的6孔板为例）
(1) 细胞培养：
取6孔培养板，以3x104/cm2密度铺板，37℃5%CO2培养箱中培养至70%～90%汇合。(不同细胞略有不同，根据实验室优化的条件进行，汇合过分，转染后不利筛选细胞)。
(2) 转染液制备：
在EP管中制备以下两液(为转染每一个孔细胞所用的量)
A液：用不含血清培养基稀释1-10μg DNA，终量100μL，
B液：用不含血清培养基稀释对应量的转染试剂，终量100μL；
轻轻混合A、B液（1:1混匀），室温中置15分钟，稍后会出现微浊现象，但并不妨碍转染。
(3) 转染准备：用2mL不含血清培养液漂洗两次，再加入2mL不含血清及PS的培养液。
电转染过程和原理
电转染过程和原理
电转染是一种常用于对细胞进行基因转染的技术，它利用电场作用使DNA分子从胞外直接转移到细胞内。电转染主要用于将外源的DNA或RNA导入到目标细胞中，实现基因转移、基因敲除或基因表达。
电转染的原理基于以下几个步骤：
1. 基质制备：将待转染的DNA或RNA溶解在缓冲液中，形成转染基质。
2. 细胞准备：将待转染的细胞收集并洗涤，使细胞悬浮于含有缓冲液的试管中。
3. 电转染：将经过洗涤的细胞与转染基质混合，然后放入电转染装置中。电转染装置是由平行电极组成的装置，其中一个电极位于细胞上方，另一个电极位于细胞下方。通常，细胞与电极之间的距离为0.2-2毫米。
4. 施加脉冲电场：在电转染过程中，施加一个短暂的高电压脉冲（通常为50-1500伏特），使细胞和转染基质之间产生电压差。这个脉冲电场的作用是在细胞膜上形成孔隙，使外源DNA或RNA能够通过电荷间的相互作用直接进入细胞质。
5. 转染后的细胞处理：将细胞转移到培养基中，让其进行恢复和增殖。此时，转染的DNA或RNA已经进入细胞质，并被细胞的基因表达系统识别和转录。
电转染原理的关键是脉冲电场的作用，它可以在短时间内创建一个临时微孔，使外源DNA或RNA通过穿越细胞膜，进入到细胞质中。脉冲电场作用于细胞膜时，会产生电荷的电力作用，使细胞膜上的脂质疏水层分子破裂，形成通道，从而使DNA或RNA分子能够通过这些通道进入细胞内。
整个电转染过程通常在数毫秒到几十毫秒内完成，具有高效、可大规模转染、对不同类型的细胞适用等优点，因此在基因转染研究、基因治疗、基因工程等领域被广泛应用。
南京恩晶生物转染试剂操作方法
南京恩晶转染试剂操作方法
一、操作步骤（以6孔板为例）
1.转染前18-24小时使用完全培养基在6孔细胞培养板，每孔接种2ml 细胞培液（根据细胞培养条件，可含血清及抗生素），约为1-3×105个细胞，转染前细胞密度应达到70－90%。若使用其他的培养板或培养皿，可以参照下表中提供的孔（或皿）表面积和体积相应的调整细胞接种数、EnoGeneFec™ 2000加量。
培养板
表面积
(cm2/孔or
皿)
可容纳培养基
体积
（ml/孔or
皿）
DNA（或其他核苷酸
类成分）用量（µg）
EnoGeneFec™
2000
用量
待加的无血清、
无抗生素的培
养基体积
96孔0.3 0.1-0.2 0.2μg溶于 20 μl
培养基
0.4-1.0 μl 溶于
20 μl培养基
50μl
24孔 2 0.5 (0.2-)1 μg溶于
25 μl 培养基
2-5 μl 溶于 25
μl培养基
0.4ml
12孔 4 1.0 (0.5-)2.0 μg溶于
100 μl培养基
4-10 μl 溶于
100 μl培养基
0.6ml
6孔10 2.0 (1.0-)5.0 μg溶于
100 μl培养基
10-25 μl 溶于
100 μl培养基
0.8ml
35 mm 10 2.0 (1.0-)5.0 μg溶于
100 μl培养基
10-25μl 溶于
100 μl培养基
0.8ml
60mm 20 5ml (3.0-)10.0μg 溶
于 500 μl培养基
20-50μl 溶于
500 μl培养基
2.4ml
10-cm 60 10ml (8.0-)20.0 μg 溶
于 1.5ml培养基
转染步骤及经验
转染步骤及经验
转染是在生物实验中将外源基因导入到细胞中的常用操作步骤之一。本文将介绍转染的步骤及经验，并提供一些实用的技巧，旨在帮助读
者顺利完成转染实验。
一、实验准备
在进行转染实验前，必须做好充分的实验准备工作。以下是一些关
键准备步骤：
1.1 细胞培养与处理
- 培养适量的目标细胞，并确保其良好的生长状态。
- 处理细胞，使其处于适宜转染的状态。例如，对于贴壁细胞，可
以使用酶消化将细胞分散为单个细胞。
1.2 载体准备
- 准备带有目标基因的载体。这可以是质粒、病毒等。
- 使用合适的方法制备高质量的载体DNA或RNA。
1.3 转染试剂
- 准备合适的转染试剂，如转染剂、离子可溶液等。不同类型的细
胞需要使用不同的试剂。
二、转染步骤
转染步骤的具体操作根据不同的实验目的和细胞类型可能会有所不同。以下是一般的转染步骤：
2.1 细胞处理
- 将要转染的细胞洗涤并收集到离心管中。
- 注意不要创建过高的转染细胞密度，以免影响转染效率。
2.2 与载体混合
- 将载体与转染试剂混合，形成载体-试剂复合物。根据实验需要可做不同浓度的复合物。
- 注意操作过程中避免产生气泡，以防止对细胞的损伤。
2.3 加入转染复合物
- 缓慢地将转染复合物滴加到细胞中，确保复合物均匀分布在细胞表面。
- 转染时间和温度应根据细胞类型和所用试剂进行优化。
2.4 培养细胞
- 按照细胞所需的培养条件将细胞孵育在恰当的培养基中。
- 在培养期间，根据实验设计进行后续处理，如观察表型、提取蛋白等。
三、经验分享
3.1 优化试剂浓度
- 不同的细胞系对试剂的敏感度不同，需要根据实验经验进行优化。试验应根据需要尝试不同浓度的试剂。
电转步骤
2.3.3.1 电转步骤
1. 感染前一天，将鸡胚胎成纤维DF1细胞接种到6孔板内，第二天细胞量需达到70-80%；
2. 从培养箱中取出细胞，PBS清洗后，胰酶37℃消化1min，用培养基吹打收集细胞，1200rpm 2min离心，去除上清；
3. 用电转液重悬细胞，离心去除上清；
4. 用电转液重悬再次细胞，按每个电转杯120μl体系分装细胞，加10μg质粒混匀。将体系转移到电转杯中，小心不要有气泡。DF-1细胞采用670mV 30ms电击。电击后将细胞重新接板，8h后将死细胞吸掉，换新鲜培养基继续培养。继续培养，24h后观察荧光蛋白的表达情况；
5. 48h后荧光强度最强，准备收集细胞TRIZOL法提取总RNA。
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Protocol for Neon transfection system (100 μl Tips) 电穿孔技术的原理
电穿孔技术是利用脉冲电场改变细胞膜的状态和通透性,达到将DNA导入细胞以及促使细胞发生融合的目的。该技术目前一方面应用于细菌、真菌、植物、昆虫和哺乳动物细胞的基因转移,另一方面应用于细胞融合,制备杂交细胞和动物克隆等
影响电穿孔效率的因素
电场强度:电压太低时,细胞膜的改变不足以允许DNA分子通过,而电压过高时又会造成细胞的不可逆损害。对于大多数哺乳动物细胞而言,250~2500V/cm的电压可获得有效转染[2,3]。电脉冲形状和长度:电脉冲形状主要有指数衰减式和方波两种,一般需20~100毫秒。缓冲液:通常使用甘露醇和蔗糖等非离子缓冲液,但有报道认为HEPES缓冲液的转染效率更高,血清也可以提高转染效率[4]。其它诸如转染温度、DNA浓度和构象等均会对转染效果产生影响。
1.Cultivate the required number of cells (5×105-2×106 adhere cell per each 100ul Neon Tip),
the cells should be 70-90% confluent on the day of experiment. 实验前培养足够量的细胞（对于100ul的tip，每个tip需要5×105-2×106 贴壁细胞，可以根据实际情况调整），并使其在实验当天达到70%-90%的汇合度。
2.Pre-warm an aliquot of culture medium containing serum, DPBS and so on.预热实验所需的
culture medium，DPBS等。
3.Prepare 6-well plate by filling the wells with 2.0 ml of culture medium containing serum and
supplements without antibiotics and pre-incubate plate in a humidified 37℃/5% CO2 incubator. 准备6孔板，在每孔中加入2.0 mL 不含抗生素的正常培养基，放到倒培养箱中预热。
4.Aspirate the media from cells and rinse the cells using DPBS, trypsinize the cells using
Trypsin/EDTA, after neutralization, harvest the cells in growth medium with serum. 用DPBS漂洗细胞两次，加入Trypsin/EDTA消化细胞，再加入生长培养基终止消化，收集细胞。
5.Count cells to determine the cell density, transfer enough cells for Neon transfection into a
1.5 ml microcentrifuge tube or a 15 ml cornial tube and centrifuge the cells at 100-400 × g
for 5 minutes at room temperature. 对消化的细胞进行计数，确定细胞的密度，取出足够转染用的细胞，转移到新的1.5 mL 或者15 mL的离心管中，100-400 × g，室温离心5min。
6.Wash the cells with DPBS by centrifugation at 100-400 ×g for 5 minutes at room
temperature. 用DPBS漂洗一次，同上条件离心。
7.Aspirate the DPBS and resuspend the cell pellet in Resuspension Buffer R in a final density
of 1.0 × 107 cells/mL. Gently pipette the cells to obtain a single cell suspension. 弃DPBS,用适量的Buffer R重悬细胞，使细胞密度达到1.0 ×107 cells/mL.（该密度仅适用于每个
tip转染1×106个细胞的情况，其他情况可根据每个tip转染的细胞量进行调整）
8.Add appropriate amount of plasmid DNA/siRNA into the cells. Set up a Neon Tube with 3
mL Electrolytic Buffer into the Pipette Station. 按需加入质粒或siRNA，在电击座中加3 mL buffer E，放到电击台上。
9.Perform the Neon transfection. 按操作说明进行电击。
10.Transfer the electroporated cells into the prewarmed culture plates.将电击过的细胞转移到
预热的6孔板中。
11.Gently rock the plate back and forth, incubate it at 37℃in a humidified CO2 incubator. 轻
柔的前后摇晃孔板几次，放入培养箱培养。
12.收拾、整理实验所用的仪器，材料等，做到“三还原”