常规分子生物学操作要点 ppt课件
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
常规分子生物学操作要点
重组DNA技术的原理
重组DNA技术是指将一种生物体（供体）的基 因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一 种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳 定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操 作程序
也称为分子克隆技术, 基因克隆或基因工程 供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基本
琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖为线性多糖聚合物，红色海藻产物琼脂中提
取而来。琼脂糖溶液加热到沸点后冷却凝固，密度由 浓度决定的。
分辨能力同凝胶的类型和浓度有关:琼脂糖凝胶分辨
范围为0.2～50kb之间.
不同浓度琼脂糖凝胶的分辨能力
凝胶类型及浓度
0.3％琼脂糖 0.7％琼脂糖 1.4％琼脂糖 4.0％琼脂糖 10％琼脂糖 20％琼脂糖
原理
➢电泳及迁移率
➢核苷酸链多聚阴离子 在生理条件下，核 酸分子的糖一磷酸骨架中的磷酸基团，是 呈离子化状态的。相同分子量的双链DNA 几乎具有等量净电荷
➢无反应活性的稳定的介质 降低了对流运 动，故电泳的迁移率又是同分子的摩擦系 数成反比的。已知摩擦系数是分子的大小、 极性及介质粘度的函数，分子大小的不同、 构型或形状的差异，所带的净电荷的多寡， 便彼此分离开来。
注意：反转录酶除了具有聚合活性，还有RNaseH （降解DNA/RNA中的RNA）活性。
19
cDNA第二链的合成方法－置换合成法
G 5‘ppp’5G
RNaesH
AAAAAAAAAAAAAAOH TTT3T’ TTTTTTTTTTp DNApol dNTPs 5’
5’
AAAATTTOH 3’
TTTTTTTTTTTTTTp
一般来说，目的基因的克隆战略分为两大类： 一类是构建感兴趣的生物个体的基因文库，即将 某生物体的全基因组分段克隆，然后建立合适的 筛选模型从基因组文库中挑出含有目的基因的重 组克隆； 另一类是利用PCR扩增技术甚至化学合成法体外 直接合成目的基因，然后将之克隆表达。
13
核酸的提取及检测
就基因工程而言，核酸 分子是其研究所涉及的主 要对象，所以核酸的分离 与提取是研究中很重要的 基本技术。
核酸样品的质量将直接 关系到实验的成败。
14
基因组DNA的分离与纯化
DNA主要存在于细胞核的染色体中。 核外也有少量DNA，如线粒体DNA（
mtDNA），叶绿体DNA（cpDNA）， 质粒DNA。 总的原则 保证一级结构的完整性 排除其它分子的污染
15
一般步骤
(1) 破碎细胞，裂解细胞壁 机械方法: 超声波处理、研磨、 匀浆 化学方法: SDS（阴离子去垢剂） EDTA，使得DNase失活(why?) 酶学方法: 溶菌酶或蜗牛酶
Trizol试剂
17
（2）The first strand synthesis
18
cDNA第二链的合成方法－置换合成法
利用第一链在反转录酶作用下产生的 cDNA:mRNA杂交链，不用碱变性（水解mRNA ），而是在dNTPs存在下，利用RNA酶H在杂交 链的mRNA链上造成切口和缺口。
从而产生一系列RNA引物，使之成为合成第二链 的引物，在大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的作用下合成 第二链。
5’
5’
TTTTTTTTTTTTTTOH
AAA3A’ AAAAAAAAAAp
S
T4-DNA ligase 5’
5’
1
TTTTTTTTTTTTTT 3’
3’
AAAAAAAAAAAAAA 5’
该方法使用较多
20
质粒DNA的分离与纯化
质粒plasmid: 指细菌细胞质中独立于细 菌染色体之外能自主复制的遗传单位
共价闭合环状 质粒DNA的分离：细菌培养和质粒
DNA扩增；细菌菌体的裂解；质粒 DNA的分离
21
质粒DNA－碱裂解法原理
➢ 染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体 DNA为线状分子，而质粒DNA为共价闭合环状 分子；
➢ 当用碱处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易 发生变性，共价闭环的质粒DNA在回到中性pH 时即恢复其天然构象；
(2) 通过蛋白质变性或分解，使 DNA游离出来 (3) 分离DNA
16
cDNA的分离与纯化
（1）mRNA 分离
RNase，不需辅助因子，耐酸碱，分布极广 RNase的来源
外源：操作者，实验器皿，试剂，空气 内源：不同组织和细胞数量不同 创造无RNase的环境 —DEPC(焦碳酸二乙酯 —异硫氰酸胍
10
DNA体外重组技术
实验设计
❖ 所需的各种DNA片段及其排列次序 ❖ ORF ❖ 酶切位点
实验方法和操作
基因工程的操作过程
酶切
连接
转化重组DNA导入受体菌
目的基因的获取 克隆载体的构建 外源基因与载体的连接 （体外重组）
检测
扩增
克隆基因的表达
转化子的筛选和鉴定
目的基因的克隆
基因工程或DNA重组技术的前提条件是从生物体 中分离克隆目的基因。
➢ 变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片 结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子 则以溶解状态存在液相中，从而可通过离心将 两者分开。
核酸的检测
包括DNA的质量、大小、纯度检测 分光光度计法
dsDNA：1A260≈50ug/ml ssDNA，RNA：1A260 ≈ 40ug/ml 寡聚核苷酸：1A260 ≈ 20ug/ml A260/A280 ＝ 1.65～1.85（DNA）；2.0(RNA) 比值高，有蛋白质、酚类等污染 凝胶电泳法
转化常用的宿主细 胞是大肠杆菌。
增殖转化细胞，使 得有足够数量的转 化细胞用于筛选程 序
8
阳性克隆的筛选和检测
目的基因
载体
限制性内切酶
限制性内切酶
重组体
DNA连接酶
载体自连
目的基因自连 9
阳性克隆的检测方法
抗药性标记选择 蓝白斑筛选 分子杂交法 插入片段大小的鉴定（酶切，PCR） 测序 ---
元件
DNA的体外重组
3
EcoRⅠ
限制性核酸内切酶
5‘ …
… 3’Βιβλιοθήκη Baidu
3‘ …
… 5’
• 回文序列 palindromic seq
4
• 粘性末端 cohensive end
CCCGGG GGGCCC
• 平末端 blunt end
Sma I
CCC GGG
GGG CCC
重组DNA分子的转化
转化是指将质粒或 其他外源DNA导入 处于感受态的宿主 细胞，并使其获得 新的表型的过程。
重组DNA技术的原理
重组DNA技术是指将一种生物体（供体）的基 因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一 种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳 定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操 作程序
也称为分子克隆技术, 基因克隆或基因工程 供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基本
琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖为线性多糖聚合物，红色海藻产物琼脂中提
取而来。琼脂糖溶液加热到沸点后冷却凝固，密度由 浓度决定的。
分辨能力同凝胶的类型和浓度有关:琼脂糖凝胶分辨
范围为0.2～50kb之间.
不同浓度琼脂糖凝胶的分辨能力
凝胶类型及浓度
0.3％琼脂糖 0.7％琼脂糖 1.4％琼脂糖 4.0％琼脂糖 10％琼脂糖 20％琼脂糖
原理
➢电泳及迁移率
➢核苷酸链多聚阴离子 在生理条件下，核 酸分子的糖一磷酸骨架中的磷酸基团，是 呈离子化状态的。相同分子量的双链DNA 几乎具有等量净电荷
➢无反应活性的稳定的介质 降低了对流运 动，故电泳的迁移率又是同分子的摩擦系 数成反比的。已知摩擦系数是分子的大小、 极性及介质粘度的函数，分子大小的不同、 构型或形状的差异，所带的净电荷的多寡， 便彼此分离开来。
注意：反转录酶除了具有聚合活性，还有RNaseH （降解DNA/RNA中的RNA）活性。
19
cDNA第二链的合成方法－置换合成法
G 5‘ppp’5G
RNaesH
AAAAAAAAAAAAAAOH TTT3T’ TTTTTTTTTTp DNApol dNTPs 5’
5’
AAAATTTOH 3’
TTTTTTTTTTTTTTp
一般来说，目的基因的克隆战略分为两大类： 一类是构建感兴趣的生物个体的基因文库，即将 某生物体的全基因组分段克隆，然后建立合适的 筛选模型从基因组文库中挑出含有目的基因的重 组克隆； 另一类是利用PCR扩增技术甚至化学合成法体外 直接合成目的基因，然后将之克隆表达。
13
核酸的提取及检测
就基因工程而言，核酸 分子是其研究所涉及的主 要对象，所以核酸的分离 与提取是研究中很重要的 基本技术。
核酸样品的质量将直接 关系到实验的成败。
14
基因组DNA的分离与纯化
DNA主要存在于细胞核的染色体中。 核外也有少量DNA，如线粒体DNA（
mtDNA），叶绿体DNA（cpDNA）， 质粒DNA。 总的原则 保证一级结构的完整性 排除其它分子的污染
15
一般步骤
(1) 破碎细胞，裂解细胞壁 机械方法: 超声波处理、研磨、 匀浆 化学方法: SDS（阴离子去垢剂） EDTA，使得DNase失活(why?) 酶学方法: 溶菌酶或蜗牛酶
Trizol试剂
17
（2）The first strand synthesis
18
cDNA第二链的合成方法－置换合成法
利用第一链在反转录酶作用下产生的 cDNA:mRNA杂交链，不用碱变性（水解mRNA ），而是在dNTPs存在下，利用RNA酶H在杂交 链的mRNA链上造成切口和缺口。
从而产生一系列RNA引物，使之成为合成第二链 的引物，在大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的作用下合成 第二链。
5’
5’
TTTTTTTTTTTTTTOH
AAA3A’ AAAAAAAAAAp
S
T4-DNA ligase 5’
5’
1
TTTTTTTTTTTTTT 3’
3’
AAAAAAAAAAAAAA 5’
该方法使用较多
20
质粒DNA的分离与纯化
质粒plasmid: 指细菌细胞质中独立于细 菌染色体之外能自主复制的遗传单位
共价闭合环状 质粒DNA的分离：细菌培养和质粒
DNA扩增；细菌菌体的裂解；质粒 DNA的分离
21
质粒DNA－碱裂解法原理
➢ 染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体 DNA为线状分子，而质粒DNA为共价闭合环状 分子；
➢ 当用碱处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易 发生变性，共价闭环的质粒DNA在回到中性pH 时即恢复其天然构象；
(2) 通过蛋白质变性或分解，使 DNA游离出来 (3) 分离DNA
16
cDNA的分离与纯化
（1）mRNA 分离
RNase，不需辅助因子，耐酸碱，分布极广 RNase的来源
外源：操作者，实验器皿，试剂，空气 内源：不同组织和细胞数量不同 创造无RNase的环境 —DEPC(焦碳酸二乙酯 —异硫氰酸胍
10
DNA体外重组技术
实验设计
❖ 所需的各种DNA片段及其排列次序 ❖ ORF ❖ 酶切位点
实验方法和操作
基因工程的操作过程
酶切
连接
转化重组DNA导入受体菌
目的基因的获取 克隆载体的构建 外源基因与载体的连接 （体外重组）
检测
扩增
克隆基因的表达
转化子的筛选和鉴定
目的基因的克隆
基因工程或DNA重组技术的前提条件是从生物体 中分离克隆目的基因。
➢ 变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片 结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子 则以溶解状态存在液相中，从而可通过离心将 两者分开。
核酸的检测
包括DNA的质量、大小、纯度检测 分光光度计法
dsDNA：1A260≈50ug/ml ssDNA，RNA：1A260 ≈ 40ug/ml 寡聚核苷酸：1A260 ≈ 20ug/ml A260/A280 ＝ 1.65～1.85（DNA）；2.0(RNA) 比值高，有蛋白质、酚类等污染 凝胶电泳法
转化常用的宿主细 胞是大肠杆菌。
增殖转化细胞，使 得有足够数量的转 化细胞用于筛选程 序
8
阳性克隆的筛选和检测
目的基因
载体
限制性内切酶
限制性内切酶
重组体
DNA连接酶
载体自连
目的基因自连 9
阳性克隆的检测方法
抗药性标记选择 蓝白斑筛选 分子杂交法 插入片段大小的鉴定（酶切，PCR） 测序 ---
元件
DNA的体外重组
3
EcoRⅠ
限制性核酸内切酶
5‘ …
… 3’Βιβλιοθήκη Baidu
3‘ …
… 5’
• 回文序列 palindromic seq
4
• 粘性末端 cohensive end
CCCGGG GGGCCC
• 平末端 blunt end
Sma I
CCC GGG
GGG CCC
重组DNA分子的转化
转化是指将质粒或 其他外源DNA导入 处于感受态的宿主 细胞，并使其获得 新的表型的过程。