常规分子生物学操作要点 ppt课件
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分子生物学基本操作
DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，把DNA样品 加入到一块包含电解质的多孔支持介质（琼脂糖 凝胶）的样品孔中，并置于静电场上。由于DNA 分子的双螺旋骨架两侧带有含负电荷的磷酸根残 基，因此在电场中向正极移动。在外加电场作用 下向正极泳动。 DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与 分子筛效应。不同DNA的分子量大小及构型不同， 电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。
琼脂糖凝胶电泳 和凝胶成像实验步骤
一、琼脂糖凝胶电泳
凝胶电泳是分离和纯化DNA片段最常用的技术。 根据制备凝胶的材料:
琼脂糖电泳 凝胶 电泳
聚丙烯酰胺电泳
琼脂糖的孔径大，可以分离长度为100bp至60kb的核酸片断； 聚丙烯酰胺凝胶的孔径小，可分离小片断（5-50bp）的核酸。
1、实验原理
琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成 具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂 糖的浓度。
0.1-10 ul Sterilized Micro-filter Tips
加样-使用合适的枪与枪头
比如加含有甘油的试剂，酶等最好用clear Tips Fra bibliotek 不会有残留；
如果甘油含量高，或特别浓稠的试剂最好用Clear, Non-Beveled Tips（或将一般枪头去尖头）；
与RNA操作有关的枪头最好为Sterilized Micro-filter Tips，或者至少为用DEPC水处理的枪头；
加样酶（冰上）时，应注意体积准确，及 外壁不带，内壁吹打干净，注意用枪头从 反应体系的管底吸上，反复吹打
多通道枪
混匀----所有试剂在使用前都要充分混匀; 多数
分子操作在加样后、反应前都要充分混匀
一、枪混匀
二、旋涡混匀器
0.2ml管,0.5ml管15% 体积以下
琼脂糖凝胶电泳 和凝胶成像实验步骤
一、琼脂糖凝胶电泳
凝胶电泳是分离和纯化DNA片段最常用的技术。 根据制备凝胶的材料:
琼脂糖电泳 凝胶 电泳
聚丙烯酰胺电泳
琼脂糖的孔径大，可以分离长度为100bp至60kb的核酸片断； 聚丙烯酰胺凝胶的孔径小，可分离小片断（5-50bp）的核酸。
1、实验原理
琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成 具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂 糖的浓度。
0.1-10 ul Sterilized Micro-filter Tips
加样-使用合适的枪与枪头
比如加含有甘油的试剂，酶等最好用clear Tips Fra bibliotek 不会有残留；
如果甘油含量高，或特别浓稠的试剂最好用Clear, Non-Beveled Tips（或将一般枪头去尖头）；
与RNA操作有关的枪头最好为Sterilized Micro-filter Tips，或者至少为用DEPC水处理的枪头；
加样酶（冰上）时，应注意体积准确，及 外壁不带，内壁吹打干净，注意用枪头从 反应体系的管底吸上，反复吹打
多通道枪
混匀----所有试剂在使用前都要充分混匀; 多数
分子操作在加样后、反应前都要充分混匀
一、枪混匀
二、旋涡混匀器
0.2ml管,0.5ml管15% 体积以下
分子生物学实验技术ppt课件
质粒转化大肠杆菌的过程
感受态
非定向克隆 +
或
定向克隆
克隆的片段只能按
+ 特定方向连接基因组DNA的构建基因组DNA的类型
质粒（﹤10kb)噬菌体质经双向电泳之后，用蛋白质水解酶裂解成肽段，可 用于质谱分析。通过电离源将蛋白质分子转化为气相离子， 然后用质谱分析仪的电场、磁场将具有特定质量与电荷比 值（M/Z值）的蛋白离子分离开，经过离子检测器收集分离 的离子，确定离子的M/Z值，分析鉴定未知蛋白质。
两种离子发生方法： 基质辅助激光解吸附/离子化（MALDI)、电喷雾离子化 （ESI)
噬菌体展示技术
噬菌体展示技术是将编码目的蛋白的基 因与编码噬菌体表面蛋白的基因融合后， 以融合蛋白的形式表达在噬菌体表面的一 种技术。
将不同蛋白的cDNA插入噬菌体载体进 行表达，得到表达不同蛋白的一定规模的 噬菌体展示库 。
将“诱饵”蛋白固定化，基于“诱饵”蛋白与 “猎物”蛋白之间的相互作用，可将展示库 中与固定化的“诱饵”蛋白有相互作用的“猎 物”蛋白分离纯化出来，再对“猎物”蛋白进 行质谱鉴定。
四、蛋白组学研究
蛋白质分离 蛋白质分析 蛋白质相互作用的研究方法： 酵母双杂交技术，噬菌体展示技术，表
面等离子共振技术，荧光共振能量转移 技术，蛋白质微阵列芯片技术，免疫共 沉淀技术，pull-down技术
蛋白质分离
最常用的蛋白质分离技术是20世纪70年代发明的双 向电泳（2-DE），是根据蛋白质的等电点不同在pH 梯度介质中进行第一次分离，即等点聚焦（IEF)，然 后根据蛋白质分子量的不同进行第二次分离，即 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。
重叠延伸PCR原理
重叠延伸PCR技术由于使用了具有互补末端的引物， 使PCR 产物形成了重叠链，从而在随后的扩增反应中通过 重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来。可 简单迅速的将两个DNA片段连在一起，用于嵌合基因的构 建
分子生物学PPT课件
04 蛋白质的结构与功能
蛋白质的化学组成与结构
蛋白质的基本组成单 位
氨基酸，具有氨基和羧
基的有机化合物。
氨基酸的种类
20种常见氨基酸，根据 侧链R基的不同进行分 类。
蛋白质的一级结构
氨基酸的线性排列顺序 ，包括肽键和二硫键的 连接。
蛋白质的高级结构
二级结构（α-螺旋、β折叠等）、三级结构和 四级结构。
01
其他RNA
如miRNA、snRNA等，在基因表达调控、 RNA加工等方面发挥作用。
04
03
RNA的合成与加工
01
02
03
转录
以DNA为模板，通过RNA 聚合酶的作用，合成RNA 的过程。
加工
新合成的RNA需要经过一 系列加工过程，如剪接、 修饰等，才能成为成熟的 RNA分子。
转录后调控
通过RNA干扰、RNA编辑 等方式对RNA进行转录后 水平的调控，影响基因的 表达。
03
DNA连接酶的种类和应用
04
重组DNA分子的构建和筛选
PCR技术及其应用
01
PCR技术的原理及步骤
02
03
04
引物的设计与优化
PCR反应体系的组成及优化
PCR技术的应用举例
基因克隆与基因工程
基因克隆的定义和原理 基因表达载体的构建和选择
基因工程的基本步骤 基因工程的应用举例
分子生物学在医学、农业等领域的应用
医学领域的应用
基因诊断、基因治疗、药物研 发等
工业领域的应用
酶工程、发酵工程、生物制药 等
农业领域的应用
转基因作物、基因编辑育种、 农业生物技术等
环境领域的应用
环境监测、污染治理、生态修 复等
分子生物学技术ppt课件
• 核酸研究中的应用十分广泛。
探针技术
• 探针是经过特殊标记的核酸片段，具有特定的 序列，能够与待测的核酸片段互补结合，因此 可用于检测核酸样品中的基因。
• 标记物：同位素、生物素或荧光染 Nhomakorabea • 核酸片段：人工合成、克隆的基因组DNA、
cDNA、RNA • 探针种类：DNA、RNA
印迹技术(Blotting): 将在凝胶中分离的 生物大分子转移(印迹)在固相化介质上 并加以检测分析的技术。
(1) DNA 印迹: Southern blotting (2) RNA 印迹: Northern blotting (3) 蛋白质印迹: Western blotting
印迹技术基本原理
凝胶电泳
转移
杂交
放射自显影 或化学显色
Southern blotting（DNA印迹技术）
组织或细胞中基因组DNA经限制性内切酶消 化后进行琼脂糖凝胶电泳，将含有DNA区带的凝 胶放入变性溶液变性后，使胶中的DNA分子转移 到NC膜上。转移完成后，加热使DNA固定于NC膜 上，用于杂交反应可进行DNA印渍。
三个步骤为一个循环。新合成的DNA分子作 为下一轮合成的模板，经多次循环（25～30次） 后即可达到扩增DNA片段的目的。
PCR的主要用途
目的基因的克隆 为重组DNA获得目的基因提供了简便快速的方法
基因的体外突变 利用PCR技术可以随意设计引物在体外进行基因 的嵌合、缺失、点突变等改造。
DNA和RNA的微量分析 一滴血液、一根毛发或一个细胞已足以满足PCR 的检测需要。
DNA序列分析 基因突变分析
PCR衍生技术
反转录PCR技术
mRNA反转录生成cDNA, cDNA 为模板PCR扩增
探针技术
• 探针是经过特殊标记的核酸片段，具有特定的 序列，能够与待测的核酸片段互补结合，因此 可用于检测核酸样品中的基因。
• 标记物：同位素、生物素或荧光染 Nhomakorabea • 核酸片段：人工合成、克隆的基因组DNA、
cDNA、RNA • 探针种类：DNA、RNA
印迹技术(Blotting): 将在凝胶中分离的 生物大分子转移(印迹)在固相化介质上 并加以检测分析的技术。
(1) DNA 印迹: Southern blotting (2) RNA 印迹: Northern blotting (3) 蛋白质印迹: Western blotting
印迹技术基本原理
凝胶电泳
转移
杂交
放射自显影 或化学显色
Southern blotting（DNA印迹技术）
组织或细胞中基因组DNA经限制性内切酶消 化后进行琼脂糖凝胶电泳，将含有DNA区带的凝 胶放入变性溶液变性后，使胶中的DNA分子转移 到NC膜上。转移完成后，加热使DNA固定于NC膜 上，用于杂交反应可进行DNA印渍。
三个步骤为一个循环。新合成的DNA分子作 为下一轮合成的模板，经多次循环（25～30次） 后即可达到扩增DNA片段的目的。
PCR的主要用途
目的基因的克隆 为重组DNA获得目的基因提供了简便快速的方法
基因的体外突变 利用PCR技术可以随意设计引物在体外进行基因 的嵌合、缺失、点突变等改造。
DNA和RNA的微量分析 一滴血液、一根毛发或一个细胞已足以满足PCR 的检测需要。
DNA序列分析 基因突变分析
PCR衍生技术
反转录PCR技术
mRNA反转录生成cDNA, cDNA 为模板PCR扩增
常见分子生物学实验方法 ppt课件
反转录合成cDNA
在冰上加入：
组成
体积
溶液A（随机引物RP）
1ul
溶液B（dNTPs)
1ul
溶液D(5*RT buffer)
4ul
溶液E（含逆转录酶、RNA酶抑制剂）1ul
1-5ug Total RNA
6ul
溶液G
7ul
1、混匀，42℃，60min;
2、95 ℃，5min，终止反应。
PCR扩增
取1支0.2ml的PCR管，在冰上加入：
如 EcoRI 识别序列:
5’ GAATTC 3’ 3’ CTTAAG 5’
限制性内切酶的特点 1. 高度特异性 2. 商业化生产 3. 反应需要Mg2+ 4. 不同的内切酶可能产生相同的末端
影响核酸限制性内切酶活性的因素
❖（1）DNA 纯度 ❖ （2）DNA甲基化的程度 ❖ （3）酶切消化反应温度 ❖ （4）DNA的分子结构 ❖ （5）限制性内切酶的缓冲液
影响连接效率的因素
A ATP 浓度 B 连接酶浓度 C 反应时间 D insert和vector的比值（载体DNA和外源DNA的分子数 比（浓度比）为1：3～1：10） E 连接温度 其中连接温度是影响连接效率的最重要的因素。
重组载体的转化
感受态细胞 (Competent cells): 经过 CaCl溶液处理的E. coli
❖ 选择载体 ❖ 获得目的基因 ❖ 目的基因与载体的重组 ❖ 重组载体的转化 ❖ 重组子的筛选与鉴定
重组质粒构建的简单流程
基因组DNA,PCR产物, cDNA (插入子)
质粒DNA (载体)
限制性酶切 (修饰 DNA 末端)
连接载体与插入片段
转化 (将重组质粒导入宿主细胞)
分子生物学课件ppt
转基因技术
转基因技术是将外源基因导入生物体，实现基因的过 表达或补充。转基因技术的关键在于选择合适的载体 和导入方法。
THANKS
感谢观看
基因编辑技术的应用
基因编辑技术在许多领域都有广泛的应用，如罕见病治疗、癌症免疫治疗、农业育种等。 通过基因编辑技术，可以实现对特定基因的敲除、敲入或修饰，以达到治疗或改良的目的 。
基因编辑技术的伦理问题
虽然基因编辑技术具有巨大的潜力，但也引发了伦理和法律等方面的争议。在应用基因编 辑技术时，需要充分考虑伦理和法律问题，确保技术的合理应用和规范发展。
发展趋势
基因组学、蛋白质组学、代谢组学等 多组学研究，跨学科交叉融合，生物 信息学和计算生物学的发展等。
02
分生物学基本概念
基因与DNA
基因
基因是生物体内携带遗传信息的最小 单位，负责编码蛋白质或RNA分子 。
DNA
DNA是生物体的主要遗传物质，由四 种不同的脱氧核苷酸组成，通过特定 的序列排列储存遗传信息。
高通量测序
高通量测序是指一次可以对大量DNA或RNA分子进行序列测定的技术。高通量测序技术极大地提高了 基因组学和转录组学研究的效率，为生物医学研究提供了强大的工具。
04
分子生物学应用
生物医药研究
01
02
03
药物设计与开发
利用分子生物学技术，研 究药物与靶点的相互作用 ，提高药物的疗效和降低 副作用。
分子生物学前沿研究
表观遗传学研究
01
表观遗传学研究
表观遗传学是研究基因表达的调控机制，通过研究DNA甲基化、组蛋
白修饰等机制，揭示基因表达的调控规律，以及环境因素对基因表达的
影响。
02
分子生物学ppt课件完整版
肿瘤标志物
寻找和验证肿瘤特异性标志物，用于肿瘤的早期诊断、预后评估和 个性化治疗。
肿瘤免疫治疗
利用分子生物学技术，研究和开发肿瘤免疫治疗策略，如CAR-T细胞 疗法等。
免疫学中的分子生物学应用
免疫相关基因
研究免疫相关基因的突变、表达和调控，揭示免疫应答和免疫疾 病的分子机制。
疫苗研发
利用分子生物学技术，研究和开发新型疫苗，如mRNA疫苗、 DNA疫苗等。
03
DNA修复机制
当DNA受到损伤时，细胞会启动修复机制对损伤进行修复。常见的修
复方式包括直接修复、切除修复和重组修复等。这些修复机制能够确保
遗传信息的稳定性和准确性。
03
RNA的结构与功能
RNA的分子组成
核糖核苷酸
RNA的基本组成单位是核 糖核苷酸，由磷酸、核糖 和碱基组成。
碱基
RNA中的碱基主要有腺嘌 呤（A）、鸟嘌呤（G）、 胞嘧啶（C）和尿嘧啶（U ）。
基因诊断与治疗
基因诊断
通过检测特定基因或基因突变来 预测或诊断疾病，如遗传性疾病
、癌症等。
基因治疗
通过修改或替换病变基因来治疗 疾病，如基因编辑技术CRISPR-
Cas9等。
个性化医疗
基于患者的基因组信息，制定个 性化的治疗方案，提高治疗效果
和减少副作用。
肿瘤分子生物学研究
肿瘤基因
研究肿瘤相关基因的突变、表达和调控，揭示肿瘤发生和发展的分 子机制。
分子生物学ppt课 件完整版
目 录
• 分子生物学概述 • DNA的结构与功能 • RNA的结构与功能 • 基因的表达与调控 • 分子生物学技术与方法 • 分子生物学在医学领域的应用
01
分子生物学概述
寻找和验证肿瘤特异性标志物，用于肿瘤的早期诊断、预后评估和 个性化治疗。
肿瘤免疫治疗
利用分子生物学技术，研究和开发肿瘤免疫治疗策略，如CAR-T细胞 疗法等。
免疫学中的分子生物学应用
免疫相关基因
研究免疫相关基因的突变、表达和调控，揭示免疫应答和免疫疾 病的分子机制。
疫苗研发
利用分子生物学技术，研究和开发新型疫苗，如mRNA疫苗、 DNA疫苗等。
03
DNA修复机制
当DNA受到损伤时，细胞会启动修复机制对损伤进行修复。常见的修
复方式包括直接修复、切除修复和重组修复等。这些修复机制能够确保
遗传信息的稳定性和准确性。
03
RNA的结构与功能
RNA的分子组成
核糖核苷酸
RNA的基本组成单位是核 糖核苷酸，由磷酸、核糖 和碱基组成。
碱基
RNA中的碱基主要有腺嘌 呤（A）、鸟嘌呤（G）、 胞嘧啶（C）和尿嘧啶（U ）。
基因诊断与治疗
基因诊断
通过检测特定基因或基因突变来 预测或诊断疾病，如遗传性疾病
、癌症等。
基因治疗
通过修改或替换病变基因来治疗 疾病，如基因编辑技术CRISPR-
Cas9等。
个性化医疗
基于患者的基因组信息，制定个 性化的治疗方案，提高治疗效果
和减少副作用。
肿瘤分子生物学研究
肿瘤基因
研究肿瘤相关基因的突变、表达和调控，揭示肿瘤发生和发展的分 子机制。
分子生物学ppt课 件完整版
目 录
• 分子生物学概述 • DNA的结构与功能 • RNA的结构与功能 • 基因的表达与调控 • 分子生物学技术与方法 • 分子生物学在医学领域的应用
01
分子生物学概述
《分子生物学全套》ppt课件
分子生物学定义
分子生物学是一门从子水平研究生 物大分子的结构和功能的科学，主要 关注DNA、RNA和蛋白质等生物大 分子的复制、转录、翻译和调控等过 程。
分子生物学特点
以分子为研究对象，阐明生命现象的 本质；与多学科交叉融合，推动生命 科学的发展；实验技术手段不断更新 ，提高研究效率和准确性。
分子生物学发展历程
分子生物学研究内容及方法
研究内容
包括基因和基因组的结构与功能、DNA损伤与修复、基因表达的调控、蛋白质 组学的研究以及疾病产生的分子基础等。
研究方法
包括基因克隆与表达、蛋白质分离与纯化、PCR技术、基因敲除与敲入、高通 量测序技术、生物信息学分析等。这些方法的应用使得分子生物学研究更加深 入和广泛。
阔前景。
下一代测序技术在分子生物学中应用
下一代测序技术原理
基于大规模并行测序的原理，一次可对数百万至数十亿个DNA分 子进行测序。
测序数据分析
包括序列比对、变异检测、基因表达量分析等，以揭示基因组的结 构和功能。
下一代测序技术的应用
在疾病诊断、个性化医疗、物种鉴定和进化生物学等领域发挥重要 作用。
非编码RNA与疾病关系
非编码RNA异常表达与多种疾病相关，如肿瘤、心血管疾 病等，可作为疾病诊断和治疗的新靶点。
非编码RNA研究前景
随着高通量测序技术和生物信息学发展，非编码RNA研究 将更加深入，为疾病防治提供新思路和新方法。
合成生物学在分子生物学中应用前景
合成生物学概念及研究范畴
合成生物学是一门新兴交叉学科，旨在通过设计和构造新的生物部件、系统和机器来理解 和操控自然生物系统。
RNA产物。
影响因素
包括DNA模板的序列和 结构、RNA聚合酶的活 性和选择性、转录因子
分子生物学是一门从子水平研究生 物大分子的结构和功能的科学，主要 关注DNA、RNA和蛋白质等生物大 分子的复制、转录、翻译和调控等过 程。
分子生物学特点
以分子为研究对象，阐明生命现象的 本质；与多学科交叉融合，推动生命 科学的发展；实验技术手段不断更新 ，提高研究效率和准确性。
分子生物学发展历程
分子生物学研究内容及方法
研究内容
包括基因和基因组的结构与功能、DNA损伤与修复、基因表达的调控、蛋白质 组学的研究以及疾病产生的分子基础等。
研究方法
包括基因克隆与表达、蛋白质分离与纯化、PCR技术、基因敲除与敲入、高通 量测序技术、生物信息学分析等。这些方法的应用使得分子生物学研究更加深 入和广泛。
阔前景。
下一代测序技术在分子生物学中应用
下一代测序技术原理
基于大规模并行测序的原理，一次可对数百万至数十亿个DNA分 子进行测序。
测序数据分析
包括序列比对、变异检测、基因表达量分析等，以揭示基因组的结 构和功能。
下一代测序技术的应用
在疾病诊断、个性化医疗、物种鉴定和进化生物学等领域发挥重要 作用。
非编码RNA与疾病关系
非编码RNA异常表达与多种疾病相关，如肿瘤、心血管疾 病等，可作为疾病诊断和治疗的新靶点。
非编码RNA研究前景
随着高通量测序技术和生物信息学发展，非编码RNA研究 将更加深入，为疾病防治提供新思路和新方法。
合成生物学在分子生物学中应用前景
合成生物学概念及研究范畴
合成生物学是一门新兴交叉学科，旨在通过设计和构造新的生物部件、系统和机器来理解 和操控自然生物系统。
RNA产物。
影响因素
包括DNA模板的序列和 结构、RNA聚合酶的活 性和选择性、转录因子
《分子生物学基础》课件
近年来，随着基因组学、蛋白 质组学和生物信息学等新兴领 域的发展，分子生物学的研究 范围和应用领域不断扩大和深 化。
目前，分子生物学已经成为生 命科学领域中最重要的学科之 一，对于未来的生命科学研究 和新技术的开发具有重要的推 动作用。
02
分子生物学基本概念
基因与DNA
基因是生物体遗传信息的载体， 由DNA分子组成。
DNA是双螺旋结构，由四种不 同的脱氧核苷酸组成，通过碱基
配对维持其稳定性。
DNA复制是遗传信息传递的关 键过程，通过半保留复制确保遗
传信息的准确传递。
蛋白质与酶
蛋白质是生物体的重要组成成分，具有多种结构 和功能。
酶是生物体内具有催化功能的蛋白质，能够加速 化学反应的速率。
酶的活性受多种因素调节，包括温度、pH值、抑 制剂和激活剂等。
分子生物学具有跨学科的特点，涉及到化学、物理学、生物学等多个领域的知识。
分子生物学的研究方法和技术手段多种多样，包括基因组学、蛋白质组学、生物信 息学等。
分子生物学的重要性
分子生物学是现代生物学的核心学科之一，对于理解 生命的本质和机制具有重要意义。
分子生物学在医学、农业、工业等领域有着广泛的应 用，对于疾病的诊断和治疗、新药的研发和农业生产
VS
详细描述
干细胞研究涉及胚胎干细胞和成体干细胞 等多种类型。在再生医学中，通过诱导干 细胞定向分化或利用干细胞的旁分泌效应 ，可以实现受损组织的修复和再生。目前 ，干细胞治疗已在多种疾病中取得初步成 效，如糖尿病、帕金森病等。
表观遗传学在疾病研究中的应用
总结词
表观遗传学是研究基因表达水平上遗传信息的变异和传递的学科，与疾病的发生和发展 密切相关。
详细描述
相关主题
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核酸样品的质量将直接 关系到实验的成败。
14
基因组DNA的分离与纯化
DNA主要存在于细胞核的染色体中。 核外也有少量DNA，如线粒体DNA（
mtDNA），叶绿体DNA（cpDNA）， 质粒DNA。 总的原则 保证一级结构的完整性 排除其它分子的污染
15
一般步骤
(1) 破碎细胞，裂解细胞壁 机械方法: 超声波处理、研磨、 匀浆 化学方法: SDS（阴离子去垢剂） EDTA，使得DNase失活(why?) 酶学方法: 溶菌酶或蜗牛酶
一般来说，目的基因的克隆战略分为两是利用PCR扩增技术甚至化学合成法体外 直接合成目的基因，然后将之克隆表达。
13
核酸的提取及检测
就基因工程而言，核酸 分子是其研究所涉及的主 要对象，所以核酸的分离 与提取是研究中很重要的 基本技术。
转化常用的宿主细 胞是大肠杆菌。
增殖转化细胞，使 得有足够数量的转 化细胞用于筛选程 序
8
阳性克隆的筛选和检测
目的基因
载体
限制性内切酶
限制性内切酶
重组体
DNA连接酶
载体自连
目的基因自连 9
阳性克隆的检测方法
抗药性标记选择 蓝白斑筛选 分子杂交法 插入片段大小的鉴定（酶切，PCR） 测序 ---
➢ 变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片 结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子 则以溶解状态存在液相中，从而可通过离心将 两者分开。
核酸的检测
包括DNA的质量、大小、纯度检测 分光光度计法
dsDNA：1A260≈50ug/ml ssDNA，RNA：1A260 ≈ 40ug/ml 寡聚核苷酸：1A260 ≈ 20ug/ml A260/A280 ＝ 1.65～1.85（DNA）；2.0(RNA) 比值高，有蛋白质、酚类等污染 凝胶电泳法
10
DNA体外重组技术
实验设计
❖ 所需的各种DNA片段及其排列次序 ❖ ORF ❖ 酶切位点
实验方法和操作
基因工程的操作过程
酶切
连接
转化重组DNA导入受体菌
目的基因的获取 克隆载体的构建 外源基因与载体的连接 （体外重组）
检测
扩增
克隆基因的表达
转化子的筛选和鉴定
目的基因的克隆
基因工程或DNA重组技术的前提条件是从生物体 中分离克隆目的基因。
注意：反转录酶除了具有聚合活性，还有RNaseH （降解DNA/RNA中的RNA）活性。
19
cDNA第二链的合成方法－置换合成法
G 5‘ppp’5G
RNaesH
AAAAAAAAAAAAAAOH TTT3T’ TTTTTTTTTTp DNApol dNTPs 5’
5’
AAAATTTOH 3’
TTTTTTTTTTTTTTp
常规分子生物学操作要点
重组DNA技术的原理
重组DNA技术是指将一种生物体（供体）的基 因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一 种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳 定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操 作程序
也称为分子克隆技术, 基因克隆或基因工程 供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基本
共价闭合环状 质粒DNA的分离：细菌培养和质粒
DNA扩增；细菌菌体的裂解；质粒 DNA的分离
21
质粒DNA－碱裂解法原理
➢ 染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体 DNA为线状分子，而质粒DNA为共价闭合环状 分子；
➢ 当用碱处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易 发生变性，共价闭环的质粒DNA在回到中性pH 时即恢复其天然构象；
原理
➢电泳及迁移率
➢核苷酸链多聚阴离子 在生理条件下，核 酸分子的糖一磷酸骨架中的磷酸基团，是 呈离子化状态的。相同分子量的双链DNA 几乎具有等量净电荷
➢无反应活性的稳定的介质 降低了对流运 动，故电泳的迁移率又是同分子的摩擦系 数成反比的。已知摩擦系数是分子的大小、 极性及介质粘度的函数，分子大小的不同、 构型或形状的差异，所带的净电荷的多寡， 便彼此分离开来。
琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖为线性多糖聚合物，红色海藻产物琼脂中提
取而来。琼脂糖溶液加热到沸点后冷却凝固，密度由 浓度决定的。
分辨能力同凝胶的类型和浓度有关:琼脂糖凝胶分辨
范围为0.2～50kb之间.
不同浓度琼脂糖凝胶的分辨能力
凝胶类型及浓度
0.3％琼脂糖 0.7％琼脂糖 1.4％琼脂糖 4.0％琼脂糖 10％琼脂糖 20％琼脂糖
(2) 通过蛋白质变性或分解，使 DNA游离出来 (3) 分离DNA
16
cDNA的分离与纯化
（1）mRNA 分离
RNase，不需辅助因子，耐酸碱，分布极广 RNase的来源
外源：操作者，实验器皿，试剂，空气 内源：不同组织和细胞数量不同 创造无RNase的环境 —DEPC(焦碳酸二乙酯 —异硫氰酸胍
Trizol试剂
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（2）The first strand synthesis
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cDNA第二链的合成方法－置换合成法
利用第一链在反转录酶作用下产生的 cDNA:mRNA杂交链，不用碱变性（水解mRNA ），而是在dNTPs存在下，利用RNA酶H在杂交 链的mRNA链上造成切口和缺口。
从而产生一系列RNA引物，使之成为合成第二链 的引物，在大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的作用下合成 第二链。
5’
5’
TTTTTTTTTTTTTTOH
AAA3A’ AAAAAAAAAAp
S
T4-DNA ligase 5’
5’
1
TTTTTTTTTTTTTT 3’
3’
AAAAAAAAAAAAAA 5’
该方法使用较多
20
质粒DNA的分离与纯化
质粒plasmid: 指细菌细胞质中独立于细 菌染色体之外能自主复制的遗传单位
元件
DNA的体外重组
3
EcoRⅠ
限制性核酸内切酶
5‘ …
… 3’
3‘ …
… 5’
• 回文序列 palindromic seq end
CCCGGG GGGCCC
• 平末端 blunt end
Sma I
CCC GGG
GGG CCC
重组DNA分子的转化
转化是指将质粒或 其他外源DNA导入 处于感受态的宿主 细胞，并使其获得 新的表型的过程。
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基因组DNA的分离与纯化
DNA主要存在于细胞核的染色体中。 核外也有少量DNA，如线粒体DNA（
mtDNA），叶绿体DNA（cpDNA）， 质粒DNA。 总的原则 保证一级结构的完整性 排除其它分子的污染
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一般步骤
(1) 破碎细胞，裂解细胞壁 机械方法: 超声波处理、研磨、 匀浆 化学方法: SDS（阴离子去垢剂） EDTA，使得DNase失活(why?) 酶学方法: 溶菌酶或蜗牛酶
一般来说，目的基因的克隆战略分为两是利用PCR扩增技术甚至化学合成法体外 直接合成目的基因，然后将之克隆表达。
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核酸的提取及检测
就基因工程而言，核酸 分子是其研究所涉及的主 要对象，所以核酸的分离 与提取是研究中很重要的 基本技术。
转化常用的宿主细 胞是大肠杆菌。
增殖转化细胞，使 得有足够数量的转 化细胞用于筛选程 序
8
阳性克隆的筛选和检测
目的基因
载体
限制性内切酶
限制性内切酶
重组体
DNA连接酶
载体自连
目的基因自连 9
阳性克隆的检测方法
抗药性标记选择 蓝白斑筛选 分子杂交法 插入片段大小的鉴定（酶切，PCR） 测序 ---
➢ 变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片 结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子 则以溶解状态存在液相中，从而可通过离心将 两者分开。
核酸的检测
包括DNA的质量、大小、纯度检测 分光光度计法
dsDNA：1A260≈50ug/ml ssDNA，RNA：1A260 ≈ 40ug/ml 寡聚核苷酸：1A260 ≈ 20ug/ml A260/A280 ＝ 1.65～1.85（DNA）；2.0(RNA) 比值高，有蛋白质、酚类等污染 凝胶电泳法
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DNA体外重组技术
实验设计
❖ 所需的各种DNA片段及其排列次序 ❖ ORF ❖ 酶切位点
实验方法和操作
基因工程的操作过程
酶切
连接
转化重组DNA导入受体菌
目的基因的获取 克隆载体的构建 外源基因与载体的连接 （体外重组）
检测
扩增
克隆基因的表达
转化子的筛选和鉴定
目的基因的克隆
基因工程或DNA重组技术的前提条件是从生物体 中分离克隆目的基因。
注意：反转录酶除了具有聚合活性，还有RNaseH （降解DNA/RNA中的RNA）活性。
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cDNA第二链的合成方法－置换合成法
G 5‘ppp’5G
RNaesH
AAAAAAAAAAAAAAOH TTT3T’ TTTTTTTTTTp DNApol dNTPs 5’
5’
AAAATTTOH 3’
TTTTTTTTTTTTTTp
常规分子生物学操作要点
重组DNA技术的原理
重组DNA技术是指将一种生物体（供体）的基 因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一 种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳 定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操 作程序
也称为分子克隆技术, 基因克隆或基因工程 供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基本
共价闭合环状 质粒DNA的分离：细菌培养和质粒
DNA扩增；细菌菌体的裂解；质粒 DNA的分离
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质粒DNA－碱裂解法原理
➢ 染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体 DNA为线状分子，而质粒DNA为共价闭合环状 分子；
➢ 当用碱处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易 发生变性，共价闭环的质粒DNA在回到中性pH 时即恢复其天然构象；
原理
➢电泳及迁移率
➢核苷酸链多聚阴离子 在生理条件下，核 酸分子的糖一磷酸骨架中的磷酸基团，是 呈离子化状态的。相同分子量的双链DNA 几乎具有等量净电荷
➢无反应活性的稳定的介质 降低了对流运 动，故电泳的迁移率又是同分子的摩擦系 数成反比的。已知摩擦系数是分子的大小、 极性及介质粘度的函数，分子大小的不同、 构型或形状的差异，所带的净电荷的多寡， 便彼此分离开来。
琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖为线性多糖聚合物，红色海藻产物琼脂中提
取而来。琼脂糖溶液加热到沸点后冷却凝固，密度由 浓度决定的。
分辨能力同凝胶的类型和浓度有关:琼脂糖凝胶分辨
范围为0.2～50kb之间.
不同浓度琼脂糖凝胶的分辨能力
凝胶类型及浓度
0.3％琼脂糖 0.7％琼脂糖 1.4％琼脂糖 4.0％琼脂糖 10％琼脂糖 20％琼脂糖
(2) 通过蛋白质变性或分解，使 DNA游离出来 (3) 分离DNA
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cDNA的分离与纯化
（1）mRNA 分离
RNase，不需辅助因子，耐酸碱，分布极广 RNase的来源
外源：操作者，实验器皿，试剂，空气 内源：不同组织和细胞数量不同 创造无RNase的环境 —DEPC(焦碳酸二乙酯 —异硫氰酸胍
Trizol试剂
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（2）The first strand synthesis
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cDNA第二链的合成方法－置换合成法
利用第一链在反转录酶作用下产生的 cDNA:mRNA杂交链，不用碱变性（水解mRNA ），而是在dNTPs存在下，利用RNA酶H在杂交 链的mRNA链上造成切口和缺口。
从而产生一系列RNA引物，使之成为合成第二链 的引物，在大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的作用下合成 第二链。
5’
5’
TTTTTTTTTTTTTTOH
AAA3A’ AAAAAAAAAAp
S
T4-DNA ligase 5’
5’
1
TTTTTTTTTTTTTT 3’
3’
AAAAAAAAAAAAAA 5’
该方法使用较多
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质粒DNA的分离与纯化
质粒plasmid: 指细菌细胞质中独立于细 菌染色体之外能自主复制的遗传单位
元件
DNA的体外重组
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EcoRⅠ
限制性核酸内切酶
5‘ …
… 3’
3‘ …
… 5’
• 回文序列 palindromic seq end
CCCGGG GGGCCC
• 平末端 blunt end
Sma I
CCC GGG
GGG CCC
重组DNA分子的转化
转化是指将质粒或 其他外源DNA导入 处于感受态的宿主 细胞，并使其获得 新的表型的过程。