常规分子生物学操作要点 ppt课件
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分子生物学基本操作
0.5-1.5ml管 15%40%体积时;试管30% 体积以下，
水浴
提前10-30分钟调好温度;稳定 后才能使用;
水位不可以低于水浴锅高度 的50%
用合适浮子; 定时; 使用后需要添水或换水 关闭电源
离心
离心前，如果需要预冷，至少预冷15分 钟。盖好管盖，充分混匀；
质量对称放置；
装枪头 带手套
枪头
灭菌 外包报纸
灭菌后50-70度烘干后使用 带手套
0.1to 10 ul clear Tips 0.5 to 10 ul Clear Tips
1-200 ul clear Tips
1-200 ul Yellow Tips (Universal Fit)
1-200 ul Clear, graduated (Universal Fit),
DNA的提取过程就是用化学和物理的方法， 使DNA与其他细胞物质分离开来的过程。
一般本实验室采用的有高盐法，CTAB法， 煮沸法。
本次实验采用SDS高盐沉淀法。
菌株划LB平板活化，挑单菌落，接3ml 试管，于30℃剧烈振荡培养过夜至稳定 期。离心收集菌体1ml，然后用等体积 TEN洗涤菌体，离心收集菌体，悬浮于 等体积TEN中。
DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，把DNA样品 加入到一块包含电解质的多孔支持介质（琼脂糖 凝胶）的样品孔中，并置于静电场上。由于DNA 分子的双螺旋骨架两侧带有含负电荷的磷酸根残 基，因此在电场中向正极移动。在外加电场作用 下向正极泳动。 DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与 分子筛效应。不同DNA的分子量大小及构型不同， 电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。
水浴
提前10-30分钟调好温度;稳定 后才能使用;
水位不可以低于水浴锅高度 的50%
用合适浮子; 定时; 使用后需要添水或换水 关闭电源
离心
离心前，如果需要预冷，至少预冷15分 钟。盖好管盖，充分混匀；
质量对称放置；
装枪头 带手套
枪头
灭菌 外包报纸
灭菌后50-70度烘干后使用 带手套
0.1to 10 ul clear Tips 0.5 to 10 ul Clear Tips
1-200 ul clear Tips
1-200 ul Yellow Tips (Universal Fit)
1-200 ul Clear, graduated (Universal Fit),
DNA的提取过程就是用化学和物理的方法， 使DNA与其他细胞物质分离开来的过程。
一般本实验室采用的有高盐法，CTAB法， 煮沸法。
本次实验采用SDS高盐沉淀法。
菌株划LB平板活化，挑单菌落，接3ml 试管，于30℃剧烈振荡培养过夜至稳定 期。离心收集菌体1ml，然后用等体积 TEN洗涤菌体，离心收集菌体，悬浮于 等体积TEN中。
DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，把DNA样品 加入到一块包含电解质的多孔支持介质（琼脂糖 凝胶）的样品孔中，并置于静电场上。由于DNA 分子的双螺旋骨架两侧带有含负电荷的磷酸根残 基，因此在电场中向正极移动。在外加电场作用 下向正极泳动。 DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与 分子筛效应。不同DNA的分子量大小及构型不同， 电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。
分子生物学实验技术ppt课件
(1)加入能减弱疏水作用的试剂可以 消除碱基堆集作用。
(2)DNA样品加热时，碱基堆集作 用减少，同时伴随A260的增加。
(3)能够断裂氢键的试剂对于单链 DNA的碱基堆集作用没有影响．但 是将双链DNA碱基堆集作用减少到 变性DNA的程度。
3．带负电荷的磷酸基的静电斥力
正离子(如Na+) 可以中和带负电荷的磷酸基团，有效地 屏蔽了磷酸基之间的静电斥力，促进了双螺旋结构的稳 定。
分子生物学实验技术
核酸和蛋白质的基本性质 及实验操作注意事项
蛋白质
一、核酸的基本性质
核酸：是以核苷酸为基本组成单位的生物信息大分子。核酸可 以分为脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）和核糖核 酸（ribonucleic acid，RNA）两大类。
• 核酸（DNA和RNA）是线性多聚核苷酸， 基本结构单元是核苷酸
增色效应或高色效应(hyperchromic effect)。指变性后DNA 溶液的紫外吸收作用增强的效应。DNA分子具有吸收250－ 280nm波长的紫外光的特性，其吸收峰值在260nm。DNA分子 中碱基间电子的相互作用是紫外吸收的结构基础,但双螺旋 结构有序堆积的碱基又“束缚”了这种作用。
变性DNA 的双链解开,碱基中电子的相互作用更有利于紫外 吸收,故而产生增色效应。
碱基位于双螺旋的内侧，
磷酸和核糖在外侧，
(2)DNA样品加热时，碱基堆集作 用减少，同时伴随A260的增加。
(3)能够断裂氢键的试剂对于单链 DNA的碱基堆集作用没有影响．但 是将双链DNA碱基堆集作用减少到 变性DNA的程度。
3．带负电荷的磷酸基的静电斥力
正离子(如Na+) 可以中和带负电荷的磷酸基团，有效地 屏蔽了磷酸基之间的静电斥力，促进了双螺旋结构的稳 定。
分子生物学实验技术
核酸和蛋白质的基本性质 及实验操作注意事项
蛋白质
一、核酸的基本性质
核酸：是以核苷酸为基本组成单位的生物信息大分子。核酸可 以分为脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）和核糖核 酸（ribonucleic acid，RNA）两大类。
• 核酸（DNA和RNA）是线性多聚核苷酸， 基本结构单元是核苷酸
增色效应或高色效应(hyperchromic effect)。指变性后DNA 溶液的紫外吸收作用增强的效应。DNA分子具有吸收250－ 280nm波长的紫外光的特性，其吸收峰值在260nm。DNA分子 中碱基间电子的相互作用是紫外吸收的结构基础,但双螺旋 结构有序堆积的碱基又“束缚”了这种作用。
变性DNA 的双链解开,碱基中电子的相互作用更有利于紫外 吸收,故而产生增色效应。
碱基位于双螺旋的内侧，
磷酸和核糖在外侧，
分子生物学PPT课件
01
其他RNA
如miRNA、snRNA等，在基因表达调控、 RNA加工等方面发挥作用。
04
03
RNA的合成与加工
01
02
03
转录
以DNA为模板，通过RNA 聚合酶的作用，合成RNA 的过程。
加工
新合成的RNA需要经过一 系列加工过程，如剪接、 修饰等，才能成为成熟的 RNA分子。
转录后调控
通过RNA干扰、RNA编辑 等方式对RNA进行转录后 水平的调控，影响基因的 表达。
03
单链结构
RNA通常以单链形式存在，但在某些情况下可以形成局 部双链结构。
RNA的种类与功能
mRNA
信使RNA，负责携带DNA的遗传信息到细 胞质中，指导蛋白质的合成。
rRNA
tRNA
转运RNA，负责在蛋白质合成过程中携带和 转运氨基酸。
核糖体RNA，是核糖体的组成部分，参与蛋 白质的合成。
02
DNA修复的类型
直接修复、切除修复、 重组修复和SOS修复等 。
DNA修复的意义
维护基因组的稳定性和 细胞的正常生理功能。
DNA的转录与表达
DNA转录的过程
转录因子和RNA聚合酶的作用
以DNA为模板，合成RNA的过程，包括起 始、延伸和终止三个阶段。
识别启动子、结合DNA并催化RNA的合成 。
分子生物学实验技术ppt课件
荧光共振能量转移技术
荧光共振能量转移是指两个荧光发色 基团在足够靠近时，当供体分子吸收 一定频率的光子后被激发到更高的电 子能态，在该电子回到基态前，通过 偶极子相互作用，实现了能量向邻近 的受体分子转移（即发生能量共振转 移）。
CFP的发射光谱与YFP的吸收光谱有 相当的重叠，当它们足够接近时，用 CFP的吸收波长激发，CFP的发色基 团将会把能量高效率地共振转移至 YFP的发色基团上，所以CFP的发射 荧光将减弱或消失，主要发射将是 YFP的荧光。
TaqMan作用机理
原位PCR技术原理
由于细胞膜和核膜均具有一定的通透性，当进PCR扩增时， 各种成分（如如引物、DNA聚合酶、核苷酸等）均可进入细 胞内或细胞核内，以固定在细胞内或细胞核内的RNA或 DNA为模板，与原位进行扩增。扩增的产物一般分子较大、 或互相交织，不易穿过细胞膜或在膜内外弥散，从而被保留 在原位。这样原有的细胞内单拷贝或低拷贝的特定DNA或 RNA序列在原位以呈指数级扩增，扩增的产物就可以被原位 杂交技术检测出来。
表面等离子共振技术（SPR）
SPR是利用单色偏振光与金属膜内表面店子发生的 等离子共振时，SPR角（反射光强度最小时的入射角） 与金属表面结合的生物分子的质量呈正比，如将“诱饵” 蛋白座位配基，固化在几十纳米的金属膜表面，加入 “猎物”蛋白溶液，这样就可以通过SPR角的改变来反映 “诱饵”蛋白与“猎物”蛋白形成的蛋白质复合物从而反映 二者的相互作用。
分子生物学课件ppt
合成生物学与人工生命
合成生物学
合成生物学是近年来发展迅速的一个领域，旨在通过设计和构建人工生物系统来探索生命的基本规律。合成生物学的 研究范围广泛，包括基因组学、代谢工程、细胞工厂等领域。
人工生命
人工生命是指通过计算机模拟或人工构建的方式创造出来的生命形式。人工生命的研究有助于深入理解生命的本质和 演化规律，同时为解决实际问题提供新的思路和方法。
Western blot实验技术
样品制备
在进行Western blot实验前，需要制备待 检测的样品，包括组织、细胞等。样品制备 过程中需注意保持生物活性。
电泳分离
通过电泳分离技术将蛋白质按分子量大小 分离，为后续的转膜和检测做准备。电泳过 程中需注意保持恒压和恒流。
荧光原位杂交技术
荧光标记探针
荧光原位杂交技术使用荧光标记的探针与 目标DNA或RNA结合，通过荧光信号检测 杂交体。荧光标记探针的选择直接影响实验 结果。
信号检测
杂交后的信号通过荧光显微镜进行检测， 获取杂交体的定位和表达情况。信号检测需
注意排除背景噪声。
基因敲除与转基因技术
基因敲除
基因敲除技术通过特定方法去除或沉默目标基因的表 达，研究基因功能。基因敲除的方法有多种，如 TALEN和CRISPR-Cas9等。
分子生物学前沿研究
表观遗传学研究
01
2024分子生物学(全套课件396P)pdf
分子生物学(全套课件396P)pdf
目录
•分子生物学概述
•DNA的结构与功能
•RNA的结构与功能
•蛋白质的结构与功能
•基因表达的调控
•分子生物学技术与应用
PART01
分子生物学概述
分子生物学的定义与发展
分子生物学的定义
分子生物学是研究生物大分子，特别是蛋白质和核酸的结构、
功能、相互作用及其在生命过程中的作用机制和调控规律的科
学。
分子生物学的发展
自20世纪50年代以来，随着DNA双螺旋结构的发现、遗传密码
的破译、基因工程技术的建立等一系列重大科学事件的发生，
分子生物学迅速崛起并渗透到生命科学的各个领域，推动了整
个生物科学的飞速发展。
分子生物学的研究对象与任务
分子生物学的研究对象
主要包括蛋白质、核酸、糖类等生物
大分子，以及由这些大分子所组成的
各种亚细胞结构和细胞器。
分子生物学的研究任务
揭示生物大分子的结构、功能及其相互
作用机制；阐明生物大分子在生命过程
中的作用机制和调控规律；探索生物大
分子的进化与起源等问题。
分子生物学是在遗传学的基础上发展起来的，遗传学为分子生物学提供了研究对象和研究方法。同时，分子生物学的发展也推动了遗传学的深入研究，使得遗传学从传统的表型遗传学向分子遗传学转变。生物化学是研究生物体内化学过程的
科学，而分子生物学则是研究生物大
分子的结构和功能的科学。两者在研
究对象和研究方法上有一定的重叠和
交叉，但侧重点不同。生物化学更注
重生物体内化学过程的动态变化，而
分子生物学则更注重生物大分子的静
态结构和功能。
细胞生物学是研究细胞结构和功能的
科学，而分子生物学则是研究细胞内
生物大分子的结构和功能的科学。两
2024《分子生物学全套》ppt课件
ppt课件
contents •分子生物学概述
•基因与基因组结构
•DNA复制与修复机制
•转录与翻译过程调控
•蛋白质组学与代谢组学研究方法•现代分子生物学技术应用
•生物信息学在分子生物学中应用•分子生物学前沿领域及未来发展趋势
目录
分子生物学概述
分子生物学定义与特点分子生物学定义
分子生物学特点
以分子为研究对象，阐明生命现象的本
质；与多学科交叉融合，推动生命科学
的发展；实验技术手段不断更新，提高
研究效率和准确性。
分子生物学发展历程
早期发展阶段
现代分子生物学阶段
分子生物学研究内容及方法研究内容
研究方法
基因与基因组结构
基因概念及功能
基因功能
基因定义基因通过编码蛋白质或
参与生物体的各种生理和生化过程，
从而控制生物的性状和表现。
基因分类
基因组组成与结构特点
基因组定义
基因组是指一个生物体内所有基因的
总和。
基因组组成
基因组包括编码区和非编码区，其中
编码区包含结构基因和调控基因，非
编码区则包含一些重要的调控元件和
重复序列。
基因组结构特点
不同生物的基因组具有不同的结构特点，如原核生物基因组较小且连续，真核生物基因组较大且存在大量的重复序列和间隔区。
转录后水平调控
转录后水平调控主要涉及mRNA 的加工、剪接、运输和降解等过程，通过这些过程可以影响mRNA 的稳定性和翻译效率。
基因表达概念
基因表达是指基因转录成mRNA ，再翻译成蛋白质的过程。
基因表达调控机制
生物体通过多种机制对基因表达进行调控，包括转录水平调控、转录后水平调控、翻译水平调控和表观遗传调控等。
转录水平调控
转录水平调控是最主要的基因表达调控机制，包括启动子、增强子、沉默子等顺式作用元件和反式作用因子的相互作用。
分子生物学PPT优秀课件
Sequence hypothesis ：
核酸片段的特异性完全由其碱基序列所决定， 且这种序列是某一蛋白质氨基酸序列的密码.
Central dogma ：
信息一旦进入蛋白质，它就不可能再输出.
分子生物学研究领域共同遵循的三大原则
构成生物大分子的单体相同 核酸语言(Nt) 蛋白质语言(aa)
生物遗传信息的表达的中心法则相同
Enzymatic nature of crystalline Protein
What genes are & How they act?
Nucleic Acid Chemistry
Protein Chemistry
分子生物学：从分子水平理解生命活动 细胞生物学：从细胞水平理解生命活动 遗传学： 从遗传角度理解生命活动 生物化学：从化学组成角度来理解生物大
Molecular Biology of Gene
What is the gene? Basic property Replication Expression Mutation
DNA Double Helix model
1952 J .Watson and F. Crick
分子生物学诞生
Crick：….我本人的思想是基于两个基本原理，我 称之为 序列假说（sequence hypothesis） 和中心法则（central dogma )…
核酸片段的特异性完全由其碱基序列所决定， 且这种序列是某一蛋白质氨基酸序列的密码.
Central dogma ：
信息一旦进入蛋白质，它就不可能再输出.
分子生物学研究领域共同遵循的三大原则
构成生物大分子的单体相同 核酸语言(Nt) 蛋白质语言(aa)
生物遗传信息的表达的中心法则相同
Enzymatic nature of crystalline Protein
What genes are & How they act?
Nucleic Acid Chemistry
Protein Chemistry
分子生物学：从分子水平理解生命活动 细胞生物学：从细胞水平理解生命活动 遗传学： 从遗传角度理解生命活动 生物化学：从化学组成角度来理解生物大
Molecular Biology of Gene
What is the gene? Basic property Replication Expression Mutation
DNA Double Helix model
1952 J .Watson and F. Crick
分子生物学诞生
Crick：….我本人的思想是基于两个基本原理，我 称之为 序列假说（sequence hypothesis） 和中心法则（central dogma )…
分子生物学ppt课件完整版
01 02
半保留复制
DNA双链在复制时，每条新链的合成都需要一条模板链作为指导，合 成后的两条子链分别与模板链互补，形成两个新的双链DNA分子，其 中一个分子保留了原来亲代DNA分子的一条链。
碱基互补配对原则
在DNA复制过程中，碱基之间的互补配对关系保证了复制的准确性。
2024/1/25
03
DNA修复机制
rRNA
核糖体RNA，是核糖体的组 成部分，参与蛋白质的合成。
13
其他RNA
如miRNA、snRNA、 snoRNA等，在基因表达调控 、RNA加工等方面发挥作用
。
RNA的功能与调控
遗传信息传递
RNA作为遗传信息的传递者，将DNA上的遗传信息转录 到mRNA上，再通过翻译合成蛋白质。
基因表达调控
RNA在基因表达调控中发挥着重要作用，如miRNA可以 通过与mRNA结合抑制其翻译，从而影响基因表达。
基因的概念
基因是生物体内控制遗传性状的基本 单位，由DNA序列构成。
基因的种类
根据功能不同，基因可分为结构基因 、调节基因、操纵基因等。
2024/1/25
16
基因的表达过程
转录
后转录修饰
在RNA聚合酶的催化下，以DNA为模 板合成RNA的过程。
包括RNA剪接、RNA编辑等过程，对 RNA进行加工和修饰。
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常规分子生物学操作要点
重组DNA技术的原理
重组DNA技术是指将一种生物体（供体）的基 因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一 种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳 定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操 作程序
也称为分子克隆技术, 基因克隆或基因工程 供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基本
琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖为线性多糖聚合物，红色海藻产物琼脂中提
取而来。琼脂糖溶液加热到沸点后冷却凝固，密度由 浓度决定的。
分辨能力同凝胶的类型和浓度有关:琼脂糖凝胶分辨
范围为0.2～50kb之间.
不同浓度琼脂糖凝胶的分辨能力
凝胶类型及浓度
0.3％琼脂糖 0.7％琼脂糖 1.4％琼脂糖 4.0％琼脂糖 10％琼脂糖 20％琼脂糖
原理
➢电泳及迁移率
➢核苷酸链多聚阴离子 在生理条件下，核 酸分子的糖一磷酸骨架中的磷酸基团，是 呈离子化状态的。相同分子量的双链DNA 几乎具有等量净电荷
➢无反应活性的稳定的介质 降低了对流运 动，故电泳的迁移率又是同分子的摩擦系 数成反比的。已知摩擦系数是分子的大小、 极性及介质粘度的函数，分子大小的不同、 构型或形状的差异，所带的净电荷的多寡， 便彼此分离开来。
注意：反转录酶除了具有聚合活性，还有RNaseH （降解DNA/RNA中的RNA）活性。
19
cDNA第二链的合成方法－置换合成法
G 5‘ppp’5G
RNaesH
AAAAAAAAAAAAAAOH TTT3T’ TTTTTTTTTTp DNApol dNTPs 5’
5’
AAAATTTOH 3’
TTTTTTTTTTTTTTp
一般来说，目的基因的克隆战略分为两大类： 一类是构建感兴趣的生物个体的基因文库，即将 某生物体的全基因组分段克隆，然后建立合适的 筛选模型从基因组文库中挑出含有目的基因的重 组克隆； 另一类是利用PCR扩增技术甚至化学合成法体外 直接合成目的基因，然后将之克隆表达。
13
核酸的提取及检测
就基因工程而言，核酸 分子是其研究所涉及的主 要对象，所以核酸的分离 与提取是研究中很重要的 基本技术。
核酸样品的质量将直接 关系到实验的成败。
14
基因组DNA的分离与纯化
DNA主要存在于细胞核的染色体中。 核外也有少量DNA，如线粒体DNA（
mtDNA），叶绿体DNA（cpDNA）， 质粒DNA。 总的原则 保证一级结构的完整性 排除其它分子的污染
15
一般步骤
(1) 破碎细胞，裂解细胞壁 机械方法: 超声波处理、研磨、 匀浆 化学方法: SDS（阴离子去垢剂） EDTA，使得DNase失活(why?) 酶学方法: 溶菌酶或蜗牛酶
Trizol试剂
17
（2）The first strand synthesis
18
cDNA第二链的合成方法－置换合成法
利用第一链在反转录酶作用下产生的 cDNA:mRNA杂交链，不用碱变性（水解mRNA ），而是在dNTPs存在下，利用RNA酶H在杂交 链的mRNA链上造成切口和缺口。
从而产生一系列RNA引物，使之成为合成第二链 的引物，在大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的作用下合成 第二链。
5’
5’
TTTTTTTTTTTTTTOH
AAA3A’ AAAAAAAAAAp
S
T4-DNA ligase 5’
5’
1
TTTTTTTTTTTTTT 3’
3’
AAAAAAAAAAAAAA 5’
该方法使用较多
20
质粒DNA的分离与纯化
质粒plasmid: 指细菌细胞质中独立于细 菌染色体之外能自主复制的遗传单位
共价闭合环状 质粒DNA的分离：细菌培养和质粒
DNA扩增；细菌菌体的裂解；质粒 DNA的分离
21
质粒DNA－碱裂解法原理
➢ 染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体 DNA为线状分子，而质粒DNA为共价闭合环状 分子；
➢ 当用碱处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易 发生变性，共价闭环的质粒DNA在回到中性pH 时即恢复其天然构象；
(2) 通过蛋白质变性或分解，使 DNA游离出来 (3) 分离DNA
16
cDNA的分离与纯化
（1）mRNA 分离
RNase，不需辅助因子，耐酸碱，分布极广 RNase的来源
外源：操作者，实验器皿，试剂，空气 内源：不同组织和细胞数量不同 创造无RNase的环境 —DEPC(焦碳酸二乙酯 —异硫氰酸胍
10
DNA体外重组技术
实验设计
❖ 所需的各种DNA片段及其排列次序 ❖ ORF ❖ 酶切位点
实验方法和操作
基因工程的操作过程
酶切
连接
转化重组DNA导入受体菌
目的基因的获取 克隆载体的构建 外源基因与载体的连接 （体外重组）
检测
扩增
克隆基因的表达
转化子的筛选和鉴定
目的基因的克隆
基因工程或DNA重组技术的前提条件是从生物体 中分离克隆目的基因。
➢ 变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片 结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子 则以溶解状态存在液相中，从而可通过离心将 两者分开。
核酸的检测
包括DNA的质量、大小、纯度检测 分光光度计法
dsDNA：1A260≈50ug/ml ssDNA，RNA：1A260 ≈ 40ug/ml 寡聚核苷酸：1A260 ≈ 20ug/ml A260/A280 ＝ 1.65～1.85（DNA）；2.0(RNA) 比值高，有蛋白质、酚类等污染 凝胶电泳法
转化常用的宿主细 胞是大肠杆菌。
增殖转化细胞，使 得有足够数量的转 化细胞用于筛选程 序
8
阳性克隆的筛选和检测
目的基因
载体
限制性内切酶
限制性内切酶
重组体
DNA连接酶
载体自连
目的基因自连 9
阳性克隆的检测方法
抗药性标记选择 蓝白斑筛选 分子杂交法 插入片段大小的鉴定（酶切，PCR） 测序 ---
元件
DNA的体外重组
3
EcoRⅠ
限制性核酸内切酶
5‘ …
… 3’Βιβλιοθήκη Baidu
3‘ …
… 5’
• 回文序列 palindromic seq
4
• 粘性末端 cohensive end
CCCGGG GGGCCC
• 平末端 blunt end
Sma I
CCC GGG
GGG CCC
重组DNA分子的转化
转化是指将质粒或 其他外源DNA导入 处于感受态的宿主 细胞，并使其获得 新的表型的过程。
重组DNA技术的原理
重组DNA技术是指将一种生物体（供体）的基 因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一 种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳 定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操 作程序
也称为分子克隆技术, 基因克隆或基因工程 供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基本
琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖为线性多糖聚合物，红色海藻产物琼脂中提
取而来。琼脂糖溶液加热到沸点后冷却凝固，密度由 浓度决定的。
分辨能力同凝胶的类型和浓度有关:琼脂糖凝胶分辨
范围为0.2～50kb之间.
不同浓度琼脂糖凝胶的分辨能力
凝胶类型及浓度
0.3％琼脂糖 0.7％琼脂糖 1.4％琼脂糖 4.0％琼脂糖 10％琼脂糖 20％琼脂糖
原理
➢电泳及迁移率
➢核苷酸链多聚阴离子 在生理条件下，核 酸分子的糖一磷酸骨架中的磷酸基团，是 呈离子化状态的。相同分子量的双链DNA 几乎具有等量净电荷
➢无反应活性的稳定的介质 降低了对流运 动，故电泳的迁移率又是同分子的摩擦系 数成反比的。已知摩擦系数是分子的大小、 极性及介质粘度的函数，分子大小的不同、 构型或形状的差异，所带的净电荷的多寡， 便彼此分离开来。
注意：反转录酶除了具有聚合活性，还有RNaseH （降解DNA/RNA中的RNA）活性。
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cDNA第二链的合成方法－置换合成法
G 5‘ppp’5G
RNaesH
AAAAAAAAAAAAAAOH TTT3T’ TTTTTTTTTTp DNApol dNTPs 5’
5’
AAAATTTOH 3’
TTTTTTTTTTTTTTp
一般来说，目的基因的克隆战略分为两大类： 一类是构建感兴趣的生物个体的基因文库，即将 某生物体的全基因组分段克隆，然后建立合适的 筛选模型从基因组文库中挑出含有目的基因的重 组克隆； 另一类是利用PCR扩增技术甚至化学合成法体外 直接合成目的基因，然后将之克隆表达。
13
核酸的提取及检测
就基因工程而言，核酸 分子是其研究所涉及的主 要对象，所以核酸的分离 与提取是研究中很重要的 基本技术。
核酸样品的质量将直接 关系到实验的成败。
14
基因组DNA的分离与纯化
DNA主要存在于细胞核的染色体中。 核外也有少量DNA，如线粒体DNA（
mtDNA），叶绿体DNA（cpDNA）， 质粒DNA。 总的原则 保证一级结构的完整性 排除其它分子的污染
15
一般步骤
(1) 破碎细胞，裂解细胞壁 机械方法: 超声波处理、研磨、 匀浆 化学方法: SDS（阴离子去垢剂） EDTA，使得DNase失活(why?) 酶学方法: 溶菌酶或蜗牛酶
Trizol试剂
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（2）The first strand synthesis
18
cDNA第二链的合成方法－置换合成法
利用第一链在反转录酶作用下产生的 cDNA:mRNA杂交链，不用碱变性（水解mRNA ），而是在dNTPs存在下，利用RNA酶H在杂交 链的mRNA链上造成切口和缺口。
从而产生一系列RNA引物，使之成为合成第二链 的引物，在大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的作用下合成 第二链。
5’
5’
TTTTTTTTTTTTTTOH
AAA3A’ AAAAAAAAAAp
S
T4-DNA ligase 5’
5’
1
TTTTTTTTTTTTTT 3’
3’
AAAAAAAAAAAAAA 5’
该方法使用较多
20
质粒DNA的分离与纯化
质粒plasmid: 指细菌细胞质中独立于细 菌染色体之外能自主复制的遗传单位
共价闭合环状 质粒DNA的分离：细菌培养和质粒
DNA扩增；细菌菌体的裂解；质粒 DNA的分离
21
质粒DNA－碱裂解法原理
➢ 染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体 DNA为线状分子，而质粒DNA为共价闭合环状 分子；
➢ 当用碱处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易 发生变性，共价闭环的质粒DNA在回到中性pH 时即恢复其天然构象；
(2) 通过蛋白质变性或分解，使 DNA游离出来 (3) 分离DNA
16
cDNA的分离与纯化
（1）mRNA 分离
RNase，不需辅助因子，耐酸碱，分布极广 RNase的来源
外源：操作者，实验器皿，试剂，空气 内源：不同组织和细胞数量不同 创造无RNase的环境 —DEPC(焦碳酸二乙酯 —异硫氰酸胍
10
DNA体外重组技术
实验设计
❖ 所需的各种DNA片段及其排列次序 ❖ ORF ❖ 酶切位点
实验方法和操作
基因工程的操作过程
酶切
连接
转化重组DNA导入受体菌
目的基因的获取 克隆载体的构建 外源基因与载体的连接 （体外重组）
检测
扩增
克隆基因的表达
转化子的筛选和鉴定
目的基因的克隆
基因工程或DNA重组技术的前提条件是从生物体 中分离克隆目的基因。
➢ 变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片 结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子 则以溶解状态存在液相中，从而可通过离心将 两者分开。
核酸的检测
包括DNA的质量、大小、纯度检测 分光光度计法
dsDNA：1A260≈50ug/ml ssDNA，RNA：1A260 ≈ 40ug/ml 寡聚核苷酸：1A260 ≈ 20ug/ml A260/A280 ＝ 1.65～1.85（DNA）；2.0(RNA) 比值高，有蛋白质、酚类等污染 凝胶电泳法
转化常用的宿主细 胞是大肠杆菌。
增殖转化细胞，使 得有足够数量的转 化细胞用于筛选程 序
8
阳性克隆的筛选和检测
目的基因
载体
限制性内切酶
限制性内切酶
重组体
DNA连接酶
载体自连
目的基因自连 9
阳性克隆的检测方法
抗药性标记选择 蓝白斑筛选 分子杂交法 插入片段大小的鉴定（酶切，PCR） 测序 ---
元件
DNA的体外重组
3
EcoRⅠ
限制性核酸内切酶
5‘ …
… 3’Βιβλιοθήκη Baidu
3‘ …
… 5’
• 回文序列 palindromic seq
4
• 粘性末端 cohensive end
CCCGGG GGGCCC
• 平末端 blunt end
Sma I
CCC GGG
GGG CCC
重组DNA分子的转化
转化是指将质粒或 其他外源DNA导入 处于感受态的宿主 细胞，并使其获得 新的表型的过程。