多肽合成方法
多肽固相合成
多肽固相合成引言多肽是由氨基酸单元组成的生物大分子，具有广泛的生物活性和潜在的药物研发价值。
多肽固相合成是一种常用的合成方法，可以用于制备中小型多肽以及肽类药物。
本文将介绍多肽固相合成的原理、步骤和常用技术，并探讨其在药物研究领域中的重要性。
1. 多肽固相合成的原理多肽固相合成基于肽链从C端向N端逐渐延伸的原理。
合成过程中，多肽链通过戊二烯二硅烷（Boc）或氯甲酰（Fmoc）等保护基与固体载体（通常为氯甲基丙烯酸酯交联的聚合物）共价结合。
经过一系列的反应和保护基的去除，最终得到目标多肽。
2. 多肽固相合成步骤多肽固相合成步骤一般包括以下几个阶段：2.1. 准备工作首先，需要准备好实验室必备的试剂和仪器设备，并确保实验室操作符合安全要求。
此外，还需要选取合适的固相载体和保护基。
2.2. 固相修饰将固相载体与氯甲基丙烯酸酯进行反应，引入活性基团，以便后续与氨基酸单元的连接。
2.3. 保护基的引入选择合适的保护基（例如Boc、Fmoc）引入到固相载体上，以保护其反应活性。
2.4. 氨基酸单元的耦合将保护基的氨基酸单元与固相载体上的活性基团耦合，形成肽链的C端。
2.5. 保护基的去除通过适当的反应条件去除保护基，暴露出氨基酸单元的反应位点。
2.6. 重复步骤2.4和2.5重复步骤2.4和2.5，直到合成完整的多肽链。
2.7. 多肽链的剪切与脱保护将多肽与固相载体分离，并通过适当的反应条件去除保护基。
2.8. 纯化与鉴定对合成得到的多肽进行纯化和鉴定，通常使用高效液相色谱（HPLC）和质谱（MS）等检测技术。
3. 常用的多肽固相合成技术多肽固相合成涉及到许多关键的技术，下面介绍几种常用的技术方法：3.1. Boc策略Boc策略是一种常用的多肽固相合成策略，其特点是生化反应条件温和，适用于氨基酸侧链中含有灵敏官能团的情况。
然而，Boc保护基的去除需要使用强酸，容易引起副反应。
3.2. Fmoc策略Fmoc策略是另一种常用的多肽固相合成策略，它与Boc 策略相比，具有更广泛的应用范围。
多肽固相合成法
多肽固相合成法
多肽固相合成法是一种用于合成多肽的常用技术。
它采用固定底
物制备多肽，可以有效避免不可控的水解和非特异性反应，从而在多
肽分子量上取得更高的精度。
多肽固相合成的步骤正是控制这种精度
的关键。
首先，将要合成的多肽位于固定底物中，固定底物通常由一种蛋
白质-树脂组成，在加水后会形成一种凝胶状态，这种状态使其和蛋白
质紧密结合。
其次，将硫代乙酰胺酯（FMOC）作为氨基酸的凝胶合成
试剂，用于氨基酸依次地缩合在固定底物上，并在每次缩合后用脱保
护剂去除FMOC基团，以形成氨基酸序列所需的碳酰基结构。
该过程可
以重复多次，以形成特定长度的多肽。
最后，利用氨基酸序列的碱性
将多肽从固定底物上解离出来。
多肽固相合成法的优势在于其准确性和可控性，可以有效地避免
水解和非特异性反应，并且可以使多肽分子量达到更高的精度。
当然，也有一些缺点需要注意，例如在合成过程中必须明确多肽序列，耗时
较长，以及成本较高。
多肽固相合成法是一种极具实用性的技术，已被广泛用于人工合
成多肽。
它可以用于多肽标准品的合成，以及多肽的研究，在医药、
精准制药、分子药理学等领域有着重要的实际意义。
多肽生物合成实验报告
一、实验目的1. 掌握多肽生物合成的原理和方法；2. 学习多肽固相合成技术；3. 通过实验，了解多肽的生物活性。
二、实验原理多肽是由氨基酸通过肽键连接而成的高分子化合物。
在生物体内，多肽的生物合成主要通过以下步骤进行：1. 氨基酸活化：将氨基酸与活化剂（如N-保护基团）反应，生成活化氨基酸；2. 固相合成：将活化氨基酸依次连接到固相载体上，形成多肽链；3. 多肽释放：将多肽链从固相载体上释放出来；4. 氨基酸脱保护：去除多肽链上的保护基团，得到具有生物活性的多肽。
本实验采用固相多肽合成技术，通过逐步引入不同的氨基酸，构建目标多肽链。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 氨基酸：L-苯丙氨酸、L-组氨酸、L-亮氨酸等；- 固相载体：聚苯乙烯树脂；- 活化剂：N-保护基团；- 消除剂：二甲基甲酰胺；- 释放剂：三氟乙酸；- 试剂：氢氧化钠、盐酸等；- 仪器：多肽合成仪、磁力搅拌器、紫外分光光度计等。
2. 实验步骤：（1）准备固相载体：将聚苯乙烯树脂浸泡在水中，然后用稀盐酸洗涤，去除杂质。
最后，用蒸馏水冲洗干净，晾干备用。
（2）活化氨基酸：将氨基酸与N-保护基团反应，生成活化氨基酸。
将活化氨基酸溶解在二甲基甲酰胺中，备用。
（3）多肽合成：将固相载体放入多肽合成仪中，依次加入活化氨基酸，通过多肽合成仪进行反应。
每步反应后，用消除了N-保护基团的溶剂清洗载体，去除未反应的氨基酸。
（4）多肽释放：将合成好的多肽链从固相载体上释放出来。
将载体浸泡在释放剂中，使其溶解，得到多肽溶液。
（5）氨基酸脱保护：将多肽溶液用氢氧化钠溶液处理，去除N-保护基团，得到具有生物活性的多肽。
（6）生物活性检测：采用体外生物活性检测方法，如ACE抑制活性检测、-葡萄糖苷酶抑制活性检测等，对合成的多肽进行活性评估。
四、实验结果与分析1. 合成多肽的分子量：通过质谱分析，合成的多肽分子量为1882.29 g/mol，与理论计算值相符。
多肽药物合成
多肽药物合成引言多肽药物是一种由2-50个氨基酸残基组成的化合物，具有重要的生物活性。
多肽药物的合成是一项复杂的过程，涉及到合成策略的选择、氨基酸保护基团的选择和去保护、纯化和质量分析等多个步骤。
本文将介绍多肽药物合成的基本步骤和一些常用的合成策略。
多肽合成的基本步骤多肽的合成包括以下几个基本步骤：1.保护基团的引入：为了防止氨基酸在反应过程中发生副反应，必须在每个氨基酸上引入保护基团。
常用的保护基团有Boc（tert-butoxycarbonyl）和Fmoc（fluorenylmethyloxycarbonyl）等。
2.活化剂的选择：合成多肽需要将氨基酸残基逐一连接起来。
为了实现这一过程，需要选择合适的活化剂。
常用的活化剂有DCCI（dicyclohexylcarbodiimide）和HATU（N,N,N’,N’-tetramethyl-O-(1H-benzotriazol-1-yl)uronium hexafluorophosphate）等。
3.脱保护：在多肽合成的过程中，需要不断地去除保护基团。
常用的去保护试剂有TFA（三氟乙酸）和HF（氢氟酸）等。
4.纯化：合成完成后，需要对多肽进行纯化。
常用的纯化方法有逆相高效液相色谱法和凝胶渗透色谱法等。
5.质量分析：为了确定合成的多肽是否符合要求，需要对其进行质量分析。
常用的质量分析方法有质谱法和核磁共振法等。
多肽合成的策略在多肽合成过程中，有几种常用的合成策略：1.固相合成：固相合成是一种在固相载体上逐渐添加氨基酸残基的合成方法。
这种方法的优势在于反应时间短、产率高、纯化方便。
常用的固相载体有Rink Amide Resin 和Wang Resin等。
2.液相合成：液相合成是一种在液相中依次加入氨基酸残基的合成方法。
这种方法的优势在于合成的多肽可以保持天然构象。
然而，液相合成的产率较低，纯化困难。
3.多肽片段合成：多肽片段合成是将多个较小的多肽片段合成后，利用液相或溶液合成方法拼接成一条完整的多肽。
多肽的制备
多肽的制备多肽是由多个氨基酸通过肽键连接而成的生物硬件分子。
在生物体内，多肽起着重要的生命活动调节作用，如激素、酶、抗体等。
同时在医药、生物学、化学等领域也有着广泛的应用。
为了获得高纯度的多肽，人们需要进行多肽的制备。
本文将介绍多肽的制备方法以及其中的技术难点。
一、多肽的合成方法1.化学合成法化学合成法是通过化学反应将氨基酸逐一连接起来形成多肽的方法。
化学合成法可以得到高纯度的多肽，但是对于较长的多肽来说，合成过程较为复杂，同时存在着副反应的风险。
常用的化学合成法包括肽酯合成法、二氧化碳缩合法、氟酸系列缩合法、Boc/Hmb保护肽合成法、Fmoc保护肽合成法等。
其中，Fmoc保护肽合成法是目前较为流行的一种方法。
2.生物合成法生物合成法是通过利用细胞内的生物合成酶来合成多肽。
生物合成法可以得到天然或半合成的多肽，具有高效、高选择性等优点，但是需要协同体系运作，所以技术难度较大。
常用的生物合成法有原核表达法、真核表达法、化学生物学方法等。
3.组合法组合法是利用已知肽段进行不同肽段的组合构成多肽，具有高度的灵活性和高效性。
组合法可分为串联法和并联法，串联法是将肽段逐一连接，而并联法是通过多肽段之间的交联产生新的多肽。
组合法对多肽的序列、长度等均具有较高的灵活性和可控性，但是仍存在着合成效率较低、非特异性等问题。
二、多肽合成中的技术难点1.肽键的形成在多肽的合成过程中，最关键的步骤是肽键的形成。
肽键是碳氮双键，由氨基酸中的羧基和氨基结合而成。
肽键的形成需要利用肽缩合试剂，如二甲基亚砜(DMSO)、二甲基乙酰胺(DMA)等。
但是这些与氨基酸反应的缩合试剂在做法过程中可能会导致污染，降低肽的成品率和品质。
2.产品纯度的提高多肽的合成较为复杂，合成产物中往往存在着单体、副产物和难溶性的杂质等，需要进行纯化和提纯。
高效液相层析(HPLC)、逆相高效液相层析(RP-HPLC)、凝胶过滤层析(GFC)、离子交换层析(IEX)等技术可以用于多肽的分离、纯化和提纯。
固相合成法合成多肽的一般步骤
固相合成法合成多肽的一般步骤
固相合成法是一种常用的合成多肽的方法，它采用固定在固相载体上的起始氨基酸，通过循环的反应步骤逐渐扩大多肽链的长度。
下面是一般的固相合成多肽的步骤：
1. 选择合适的固相载体：常用的固相载体包括树脂或纳米粒子等。
载体上通常含有反应活性的官能团，以便于多肽链的延长。
2. 固相载体的活化：将固相载体与活化试剂（例如DIC、DCC等）进行反应，以提供反应所需的官能团。
3. 起始氨基酸的固定：将起始氨基酸与已活化的固相载体进行反应，使其固定在载体上。
4. 反应循环：重复以下步骤，逐渐扩大多肽链的长度：
a. 去保护基：使用适当的切割试剂去除氨基酸残基上的保护基。
b. 活化：将下一个氨基酸与已去保护的氨基酸残基进行反应，生成新的伸长部分。
5. 合成结束：在合成所需长度的多肽链合成完成后，将多肽链从固相载体上解离下来。
6. 去保护基：去除整个多肽链上的保护基，恢复对应的功能基团。
7. 纯化和表征：对合成得到的多肽进行纯化和分析，常用的方法包括高效液相色谱（HPLC）、质谱等。
需要注意的是，每一步骤都需要严格控制反应条件，遵循适当的化学法则和实验室操作规范，确保多肽的合成效果和质量。
多肽药物设计和合成方法介绍
多肽药物设计和合成方法介绍摘要：多肽药物是一类由多个氨基酸残基组成的化合物，具有广泛的生物活性和药理学应用。
本文将介绍多肽药物设计和合成的方法，包括序列设计、合成策略、修饰技术等，为多肽药物研发提供参考。
1. 引言多肽药物是一类由10个以上的氨基酸残基组成的化合物，因其具有良好的生物相容性、高效的靶向性和较低的毒性而备受关注。
目前，多肽药物已经广泛应用于癌症、代谢疾病和神经系统疾病等领域。
2. 多肽药物的序列设计多肽药物的序列设计是其研发的基础。
一方面，序列确定了多肽的生物活性和靶向性；另一方面，也决定了多肽的合成难度和成本。
目前，常用的序列设计方法包括仿生学设计、计算机辅助设计和随机设计等。
2.1 仿生学设计仿生学设计是通过模仿天然生物体内已经存在的功能多肽或蛋白质序列进行设计。
通过改变氨基酸的类型、顺序或剪切序列，可以改变多肽的生物活性和稳定性。
2.2 计算机辅助设计计算机辅助设计是利用计算机模拟和分析多肽序列的方法。
通过构建多肽序列库，结合分子模拟和机器学习算法，可以预测多肽的构象和性质，为设计合理的多肽药物提供指导。
2.3 随机设计随机设计是通过随机合成数以万计的多肽库，通过高通量筛选方法选出具有特定功能的多肽。
这种方法能够大大提高多肽药物的研发效率和成功率，但也存在一定的经济成本和资源浪费。
3. 多肽药物的合成策略多肽药物的合成是多肽药物研发的关键一步。
由于多肽分子的复杂性，传统的肽合成方法往往存在低产率、副反应多等问题。
为解决这些问题，研究者们开展了许多改良的合成策略。
3.1 固相合成法固相合成法是目前最常用的多肽合成方法之一。
该方法利用固相合成支架和保护氨基酸基团，通过逐步添加氨基酸残基的方式，将氨基酸一步步连接成多肽。
3.2 液相合成法液相合成法是一种将氨基酸溶解于溶剂中，并利用活性化的氨基酸进行反应的方法。
这种方法可以在单一试管中完成多肽的合成，但合成速度较慢，副反应也较多。
3.3 交联酶法交联酶是自然界中一种特殊的酶，能够通过反应选择性地将相互作用的氨基酸连接起来形成多肽。
多肽药生产合成
多肽药生产合成
多肽药物的生产合成涉及多个步骤，从确定氨基酸序列到最终产品的纯化。
以下是多肽药物生产合成的一般过程：
1. 序列设计：根据药物的治疗目标，科学家首先设计多肽的氨基酸序列。
这一步需要考虑多肽的生物活性、稳定性和溶解性。
2. 固相合成法（SPPS）：目前多肽药物的生产主要采用固相合成法。
在此方法中，每个氨基酸的羧基被连接到一个不溶性的树脂上，然后逐个添加其他氨基酸，形成肽链。
每一步都伴随着侧链的保护和脱保护反应，以防止不必要的副反应。
3. 洗涤和脱保护：在每次添加一个氨基酸之后，必须彻底清洗树脂以除去未反应的试剂和副产品。
在整条肽链组装完成后，进行脱保护反应，释放出合成的多肽。
4. 裂解和纯化：多肽从树脂上裂解下来后，通常需要进一步的纯化步骤，如高效液相色谱（HPLC）或毛细管电泳等技术，以确保产品的纯度和一致性。
5. 分析和表征：使用质谱、核磁共振（NMR）和氨基酸分析等技术对多肽的结构和组成进行详细分析和表征。
6. 冻干和包装：纯化后的多肽通常通过冻干的方式保存，以延长其稳定性。
然后按照适宜的剂量单位进行包装，准备作为药物产品销售。
7. 质量控制：在整个生产过程中，必须严格执行质量控制措施，以确保所有批次的多肽药物都符合规定的安全性、纯度和效力标准。
多肽药物的生产合成是一个精细和复杂的过程，要求高度专业的设备和技术。
由于多肽分子本身的多样性和复杂性，合成过程中可能遇到多种挑战，如序列复杂性、合成效率、多肽稳定性和成本控制等。
随着技术的进步，多肽药物的生产方法也在不断优化，以提高产量、降低成本并简化生产流程。
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多肽合成中肽键形成的基本原理一个肽键的形成（生成一个二肽），从表面上看是一个简单的化学过程，它指两个氨基酸组分通过肽键（酰胺键）连接，同时脱去水。
在温和反应条件下，肽键的形成是通过活化一个氨基酸（A）的羧基部分，第二个氨基酸（B）则亲核进攻活化的羧基部分而形成二肽（A－B）。
如果羧基组分（A）的氨基未保护，肽键的形成则不可控制，可能开有成线性肽和环肽等副产物，与目标化合物A－B混在一起。
所以，在多肽合成过程中，对不参与肽键形成的所有官能团必须以暂时可逆的方式加以保护。
因此，多肽合成－即每一个肽键的形成，包括三个步聚：第一步，需要制备部分保护的氨基酸，氨基酸的两性离子结构不再存在；第二步，为形成肽键的两步反应，N－保护氨基酸的羧基必须先活化为活性中间体，随后形成肽键。
这一耦合反应既可作为一步反应进行，也可作为两个连续的反应进行。
第三步，对保护基进行选择性脱除或全脱除。
尽管全部脱除要等到肽链全部组装完成后才能进行，但为了继??? 续肽合成，选择性脱除保护基也是必需的。
由于10个氨基酸（Ser、Thr、Tyr、Asp、Glu、Lys、Arg、His、Sec和Cys）含有需要选择性保护的侧链官能团，使肽合成变得更加复杂。
因为对选择性的要求不同，所以必须区分临时性和半永久性保护基。
临时性保护基用于下一步要反应氨基酸的氨基或羧基官能团的暂时保护，在不干扰已经形成的肽键或氨基酸侧链的半永久性保护基才脱除，有时也在合成过程中脱除。
在理想状态下，羧基组分的活化和随后的肽键形成（耦合反应）应为快速反应，没有消旋或副产物形成，并应用等摩尔反应物以获得高产率。
但遗憾的是，还没有一种能满足这些要求的化学耦合方法相比，适用于实际合成的方法很少。
在肽合成过程中，参与多种反应的官能团常常与一个手性中心相连（甘氨酸是唯一的例外），存在发生的消旋的潜在危险。
多肽合成循环的最后一步，保护基要全部脱除。
除了在二肽的合成中需要全脱保护以外，选择性脱除保护基对于肽链延长具有非常重要的意义。
合成策略要深思熟虑地规划，依战略选择，可以选择性脱除Nα－氨基保护基或羧基保护基。
“战略”一词这里是指单个氨基酸的缩合反应顺序。
一般来说，在逐步合成和片段缩合之间是有区别的。
在溶液中进行肽合成（也指“常规合成”），对困难序列，多数情况下，用肽链逐步延长法只能合成较短的片段。
要合成更长的肽时，目标分子必须分割成合适的片段，并确定在片段缩合过程中，它们能使能C端差向异构化程度最小。
在单个片段逐步组装完成后，再连接产生目标化合物。
肽合成战术包括选择最恰当的保护基组合和最佳的片段偶联方法。
最初的固相多肽合成（SPPS）只是肽和蛋白质逐步合成法的一种变化，其概念是将增长的肽链连接到一个不溶性的聚合物载体上，由Robert Bruce Merrifield在1963年首次报道。
今天，为纪念他1984年获得诺贝尔奖而称之为Merrifield。
在聚合物载体上，也可以进行片段缩合反应。
多肽合成方法之酰基叠氮物法早在1902年，Theodor Curtius就将酰基叠氮物法引入到肽化学中，因此它是最古老的缩合方法之一。
在碱性水溶液中，除了与酰基叠氨缩合的游离氨基酸和肽以外，氨基酸酯可用于有机溶剂中。
与其他许多缩合方法不同的是，它不需要增加辅助碱或另一等当量的氨基组分来捕获腙酸。
长期以来，一直认为叠氮物法是唯一不发生消旋的缩合方法，随着可选择性裂解的氨基酸保护基引入，该方法经历了一次大规模的复兴。
该方法的起始原料分别是晶体状的氨基酸酰肼或肽酰肼64,通过肼解相应的酯很容易得到。
在－10℃的盐酸中，用等当量的亚硝酸钠使酰肼发生亚硝化而转化为叠氮化物65,依次洗涤、干燥，然后与相应的氨基组分反应。
有些叠氮化物可用冰水稀释而沉淀出来。
二苯磷酰基叠氮化物（DPPA）也可以用于酰基叠氮化物的合成。
Honzl-Rudinger 方法采用亚硝酸叔丁作为亚硝化试剂，并且使叠氮缩合反应可在有机溶剂中进行。
因酰基叠氮化物的热不稳定性，缩合反应需在低温下进行。
当温度较高时，Curtius重排，即酰基叠氮转化为异氰酸酯的反应成为一个主要的副反应，最终导致生成副产物脲。
由于反应温度低（如4℃）而导致反应速率相当慢，使得肽缩合反应通常需要几天才能完全。
对于较长的N端保护的肽链，酯基的肼解一般比较困难，因此，使用正交的N保护肼衍生物是一种选择。
在肼基的选择性脱除后，按倒接（backing-off）策略组合的肽片段可以用于叠氮缩合。
如前所述，虽然叠氮法一直被认为是消旋化倾向最小的缩合方法，但在反应中，过量的碱会诱发相当大的消旋。
因此，在缩合反应期间要避免与碱接触，例如，氨基组分的铵盐应采用N，N－二异丙胺或N－烷基吗啉代替三乙胺来中和。
虽然有上述局限性，但该方法仍很重要，尤其对于片段缩合而言，因为该方法具有较低的异构化倾向，适用于羟基未保护丝氨酸或苏氨酸组分，同时，Nˊ保护的本行酰肼还具有多种用途。
多肽合成方法之酸酐法在多肽合成中，最初考虑应用酸酐要追溯到1881年Theodor Curtius对苯甲酰基氨基乙酸合成的早期研究。
从氨基乙酸银与苯甲酰氯的反应中，除获得苯甲酰氨基乙酸外，还得到了BZ-Glyn-OH(n=2-6)。
早期曾认为，当用苯甲酰氯处理时，N－苯甲酰基氨基酸或N－苯甲酰基肽与苯甲酸形成了活性中间体不对称酸酐。
大约在70年后，Theodor Wieland利用这些发现将混合酸酐法用于现代多肽合成。
目前，除该方法外，对称酸酐以及由氨基酸的羧基和氨基甲酸在分子内形成的N－羧基内酸酐（NCA,Leuchs anhydrides）也用肽缩合。
最后应该提到，不对称酸酐常常参与生化反应中的酰化反应。
多肽合成方法之混合酸酐法有机羧酸和无机酸皆可用于混合酸酐的形成。
然而，仅有几个得到了广泛的实际应用，多数情况下，采用氯甲酸烷基酯。
过去频繁使用的氯甲酸乙酯，目前主要被氯甲酸异丁酯所替代。
由羧基组分和氯甲酸酯起始形成的混合酸酐，其氨解反应的区域选择性依赖依赖于两个互相竞争的羰基的亲电性和（或）空间位阻。
在由N保护的氨基酸羧酸盐（羧基组分）和氯甲酸烷基酯（活化组分，例如源于氯甲酸烷基酯）形成混合酸酐时，亲核试剂胺主要进攻氨基酸组分的羧基，形成预期的肽衍生物，并且释放出游离酸形式的活性成分。
当应用氯甲酸烷基酯（R1＝异丁基、乙基等）时，游离的单烷基碳酸不稳定，立即分解为二氧化碳和相应的醇。
然而，对于亲核进攻的区域选择性，也有一些相反的报道，产物为氨基甲酸酯和原来的N保护氨基酸组分。
为了形成混合酸酐，将N保护的氨基酸或肽分别溶于二氯甲烷、四氢呋喃、二氧六环、乙腈、乙酸乙酯或DMF中，用等当量的三级碱（N－甲基哌啶、N－甲基吗啉、N－乙基吗啉等）处理。
然后，在－15℃－－5℃，剧烈搅拌的同时加入氯甲酸烷基酯以形成不对称酸酐（活化）。
经短时间活化后，加入亲核性氨基酸组分。
如果作为铵盐使用（需要更多的碱），必须避免碱的过量使用。
如果严格按照以上的反应条件，混合酸酐法很容易进行，是最有效的缩合方法之一。
Benoiton和他的同事对混合酸酐的稳定性，减少副产物氨基甲酸酯和消旋等方面进行了深入研究，由此进一步了解了反应机理，并提高了该方法的缩合效率，目前该方法已获得广泛应用。
通过研究过量氨基甲酸酯产生的原因,尤其是在异亮氨酰基和缬氨酰基的情况下，发现以二氯甲烷为溶剂和N－甲基哌啶作为三及碱能防止这一主要副反应。
混合酸酐对水解有较高稳定性，因此，可以用水洗涤有机相来纯化混合酸酐。
从氯甲酸烷基酯制得的混合酸酐的稳定性依赖于使用的烷基。
由Boc-、Z-和 Fmoc-的保护氨基酸和氯甲酸异丙酯制得的混合酸酐能够被分离纯化，比从氯甲酸乙酯或氯甲酸异丁酯获得的混合酸酐更稳定。
当没有合适的亲核试剂时，混合酸酐在有机溶剂中的分解起始于环化，生成2－烷氧基－5（4H）－恶唑酮，同时释放出二氧化碳和醇R2－OH，副产物为对称酸酐和酯。
在混合酸酐缩合法的实际应用中，有以下几方面需要注意：虽然含水的DMF对于混合酸酐的形成和随后的缩合反应是一个好的溶剂，但是，正如在Z-Gly-Xaa-OH(Xaa=Ala,Leu,Val,Phe)与H－Val-OEt的反应中所遇到的，它促进消旋的程度比使用四氢呋喃或卤化试剂为溶剂时要高得多。
氯甲酸异丙酯优氯甲酸乙酯或异丁酯。
有趣的是，在DMF或N－甲基吡咯烷酮中，氯甲酸乙酯活化比氯甲酸异丁酯活化引起的消旋更少。
尽管如此，从氯甲酸乙酯制取的混合酸酐，以三乙胺作为三级碱在目前几乎没有实用价值。
最初，分别在Nα－甲基磺酰基、Nα－三苯甲基、N α－三氟乙酰基保护的氨基酸活化中观察到混合酸酐法的副反应。
有时特戊酸（2,2－二甲基丙酸）被推荐作为活化基，用于混合酸酐的合成，对于Nα－酰基保护的天冬酰胺尤其如此。
类似地，这种不对称酸酐由Nα－酰基氨基酸和特戊酰氯制得，并且与氨基亲核试剂反应的产率高。
特戊酸叔丁基的强+I效应降低了它的羰基的亲电性，同时还因为空间位阻的影响，使亲核试剂在活化的氨基酸上发生预期的区域选择性进攻。
从机理上考虑，这里也要提到酰基磷翁盐作为活性中间体在肽缩合中的应用。
多肽合成方法之对称酸酐法Nα－酰基氨基酸的对称酸酐是用于肽键形成的高活性中间体。
与混合酸酐法相反，它与胺亲核试剂的反应没有模棱两可的区域选择性。
但肽缩合产率最高，为50%（以羧基组分计）。
虽然由对称酸酐氨解形成的游离Nα－酰基氨基酸可以和目标肽一起，通过饱和碳酸氢钠溶液萃取回收，但在最初，这种方法的实用价值极低。
对称酸酐可以用Nα－保护氨基酸与光气，或方便的碳二亚胺反应制得。
两当量的Nα－保护氨基酸与－当量的碳二亚胺反应有利于对称酸酐的形成，对称酸酐可以分离出来，也可不经纯化而直接用于后面的缩合反应。
基于Nα－烷氧羰基氨基酸的对称酸酐对水解稳定，可采用类似上述纯化混合酸酐的方法进行纯化。
由于Boc-保护氨基酸的商品化和合理的价格，在肽链的逐步延长中，使用对称酸酐法日益受到重视。
虽然可以买到晶状的对称酸酐，但原位制备仍然是一种不错的选择。
多肽合成方法－N-羧基内酸酐法Hermann Leuchs在1906看发现，在N－羧基内酸酐（NCA）中，氨基酸的羧基活化和酰基保护同时发生。
因此，在德国文献中，又称之为Leuchs－酸酐。
原则上，该类衍生物应具备理想的前提条件以应用于多肽合成。
第一个N－羧基内酸酐（1,3－氧氮杂环戊烷－2,5－二酮）是从N－（乙氧羰基）氨基酸酰氯消除氯乙烷而得到的。
制备该类衍生物的一个好方法是游离氨基酸与光气反应，相应的氨基甲酰氨为中间体。
然而，痕量的水就能使N－羧基内酸酐发生聚合，因为最初形成的氨基甲酸自动脱去羧基得到游离胺，此游离胺是发生进一步开环反应的亲核试剂。