HSV_1gC糖蛋白真核表达载体的构建及表达

见的黏膜性疱疹外 , 还可引起疱疹性角膜炎和疱疹 性脑炎, 前者严重的可引起失明 , 后者则常伴有较重 的神经系统后遗症。近年的研究还显示 H SV 感染可 增强 引 起 艾 滋 病 ( acqu ired i mm une deficiency syn drom e , AI D S)的人类免疫缺陷病毒 ( hum an i mm unod ef iciency v irus, H I V )感染及传播的几率 , 因此 , 有效 治疗 H SV 感染对于预防 H IV 的传播也具有重要的意 义
X i an 710032 , Ch ina * an D epart m ent o fM icrob io logy , Fourth M ilitary M ed ica l U n iversity ,
ern blot 检 测。 结 果 : 成 功构 建 了真 核表 达 载体 pC I mCM V gC 1 I RES DH FR L 22R。经过两 轮筛 选 获得 稳定 表 达 H SV 1 型 gC 基 因 的 细 胞 系 , W estern b lo t 成 功 检 测 到 目 的 蛋 白。 结论 : HSV 1 gC 在 CHO K1 细胞 中成功 表达 , 并具 有良好 的 特异性结合活 性 , 为进 一 步的 实 验研 究 和 临床 应 用提 供 了 基础。 [ 关键词 ] H SV; gC; DH FR; 真 核表达 ; CHO [ 中图分类号 ] R 392. 12 [ 文献标识码 ] A
1. 1 材料 真核表达载体为本室以 pC I neo质粒 为基础进 行 改建 , 主要是用鼠 CMV (mCM V ) 启动子替换载体上的人 CMV ( hCM V ) 启动 子 , 同时 克 隆入 内部 核 糖体 进入 位 点 ( Interna l R ibosom al Entry S ite , IRES) 基因 , 命名为 pC I mCM V I RES; 中 国仓鼠二氢叶酸还原 酶 ( DHFR ) 基因、 CHO K 1 细胞为本实 验 室保 存 ; DNA 电泳凝 胶回收 试剂盒、质粒 提取试 剂盒、 DNA 聚合酶、限制性内切酶、连接酶等生化试剂均购 自大连 T a Ka R a公司 ; RPM I1640 培养基购自 G ibco ; 新生 牛血清 购自杭 州 四季青公司 ; G 418 购自 Ca lbioche m 公司 ; L ipofectam ine 2000 购自 Inv itrogen 公司 ; 脱脂奶粉 购自博 士德公 司 ; 30K 超滤 管 ( Am icon U ltra 15 C entr ifuga l F ilter) 、 PVDF 膜购自 M illipo re 公 司 ; B io D ot SF M icro filtration A ppara tus 购 自 B I O RAD 公 司 ; H is N i Sepharose纯化填 料购自 GE 公司 ; 抗 H SV 单 克隆抗 体 ( mA b) 4C9 为 本实 验室 前 期制 备 ; 小 鼠抗 H is mAb 购 自 In v itrogen 公司 ; 红外标记的羊抗鼠二抗购自 L I COR 公司。 1. 2 方法 1. 2 . 1 HSV 1 gC 1 基因 的合成 根 据 G enBank 中 H SV 1 基 因组序列 ( NC_001806) 选取 gC 1 胞外 区 1 457 aa 编码 基因 , 并对编码碱基进行优 化 , 为利于 表达 的重组 蛋白 分泌 , 将 编 码前导肽的核苷酸序列换为 人 轻链 前导肽序 列 , 编码氨 基 酸序列为 M EA PAQLLFLLLLW LPDTTG, 在基因 5 端加入 N he I 酶切位点和 K ozak 序 列 , gC 1 456、 457 为 2 个组 氨酸 (H ) 残 基 , 加上 4 个 H 即可形成 6 H is 尾用于纯化 , 基因 3 端加 上 终止码 TAA 和克隆用 的 M lu I酶 切位 点 , 片段 大小 共 1 390 bp , 交由 Ta K aR a 公 司 进 行 全 基 因 合 成 , 合 成 后 克 隆 至 pM D19 T S i m p le 载体中 , 命名为 pM D19 T gC 1 。 1. 2 . 2 L22R 突变型 DHFR 基因 的构建 根据 中国仓鼠 DH FR 基因序列 , 合成 5 端起始码和 EcoR I 之间 1 ~ 96 bp 的 序 列 , 并把编码第 22 位亮氨酸 ( L ) 的 CTT 用编码精 氨酸 ( R ) 的 CGG 替换 , 基因两端分别加入克隆所需的 X ba I和 N ot I酶 切 位点 , 基因由 T a K aR a公 司合 成后 克隆 至 pM D19 T Si m ple 载 体中。设计扩增 DHFR 基因 后半 段的 引物 , 序列 如下 : 上 游 引 物: 3, 5 CCGGAATTCAAATACTTCCAAAGAATGACCACCAC 5 GATG CGG CCGCCA CTGT CGACTTAGC 下 游 引 物:
收稿日期 : 2011- 01- 10; 接受日期 : 2011 - 02- 01
。
造成现有疫苗效果不佳的原因之一可能是病毒 的免疫逃避分子对免疫系统的影响。 H SV 1 病毒糖 蛋白 C ( gC 1) 可与补体 C3b 结合 , 阻止补体系统的 激活 , 糖蛋白 E ( gE ) 和糖蛋白 I( g I) 则能够与抗体 IgG 的 F c结合, 抑制补体的激活以及抗体依赖的细 胞毒效应 ( ADCC )
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C( gC ) 哺乳动 物表达 载体 pC I mCM V gC 1 IRES DH FR L22R, 实现其在中国仓鼠卵巢细胞 ( CHO K 1) 中的稳定表 达。 方法 : 利用基因重组技 术构 建同 时 克隆 有 gC 1 基因 和中 国 仓鼠 二 氢叶酸 还原 ( DHFR L22R ) 基因 的 真核 表 达载 体 pC I mCMV gC 1 I RES DHFR L22R, 按 L ipo fectam ineTM 2000 说 明 书 转 染 野生型 CHO K 1 细胞 , 在 G418 和氨 甲喋 呤 ( M TX ) 双 筛选 压 力下筛选稳定 表达 细胞 株 , Slot blot 方法 测定 重组 蛋 白的 表 达 , 并用 H is N i琼脂糖填料进行目的蛋白纯化 , 纯化后 W est
单纯疱疹病毒 ( herpes si m plex v irus , H SV ) 是一 种流行于全世界的疱疹性疾病病原体
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[ Ab stract]
AI M: To stab ly express he rpes sm i p lex vi
, 除引起常
rus type 1 ( HSV 1 ) g lycopro te in C ( gC ) in Ch inese ham ste r ova ry ce lls ( CHO K 1) . METHODS : The e ukaryo tic ex p ressi on vecto r pC I mCMV gC 1 IRES DHFR L22R was constructed and tran sfected in to CHO K 1 ce lls b y L i po fectam i neTM 2000 . The transfec ted ce lls we re se lected by G418 and me tho trexa te ( M TX ). The expre ssion o f HSV 1 gC was ana lyzed by S lo t b lo. t HSV 1 gC p ro te ins we re puri fi ed w ith H is N i Sepha rose and then de tected by W estern b lo.t RESULTS : The eukaryo tic exp ress i on vector pC I mC MV gC 1 IRES DHFR L22 R was construc ted successfu lly . CHO K 1 ce lls stab ly exp ress i ng HSV 1 gC p ro te ins we re es tab lished and con fir med by W estern b l o. t CONCLU SION: The HSV 1 gC prote ins have been exp ressed succe ssfu lly and have good b i oactivity. The resu lts make it possib l e for further study and clin i c a l use o f HSV 1 gC. [ K eyword s] he rpes sm i p lex v irus; gC; DHFR; sion ; CHO [摘 要 ] 目的 : 构 建单纯疱疹病毒 1 型 (H SV 1) 囊膜糖蛋 白 exp res
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ISSN 1007- 8738细 胞与分子免疫学杂志 ( Ch in J Ce llM ol I mmuno l) 2011, 27( 5)
文章编号: 1007- 8738( 2011) 05- 0494- 04
H SV 1 gC 糖蛋白真核表达载体的构建及表达
党引利 , 阎 岩 , 张晓晓, 李璞媛, 于 澜, 张生物学教研室 , 陕 西 西安 710032)
Construction and expression of the eu karyotic expression vector carrying HSV 1 gC glycoprotein gene
DANG Y in li, YAN Yan, ZHANG X iao x ia o, LI Pu yuan, YU Lan, ZHANG L ei, ZHANG Fang lin, X U Zhi kai, WU X ing